一种载脂蛋白e检测试剂盒及其制备方法

文档序号:5904674阅读:178来源:国知局
专利名称:一种载脂蛋白e检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体地说涉及一种检测人载脂蛋白E的检测试剂盒。
背景技术
载脂蛋白E(apolipoprotein E, ApoE)是一种多态性蛋白,参与脂蛋白的转化与代谢过程,其基因可以调节许多生物学功能,对ApoE及其基因多态性的研究是目前医学研究的热点之一。人群中ApoE多态性存在种族变异,不同人群中ApoE基因型高度不同。欧洲人ε4等位基因频率从北到南呈下降趋势的分布。亚洲人ε 4频率低,相比之下,非洲人及巴布比 亚和新几内亚ε 4频率高。许多证据认为,ApoE多态性是动脉粥样硬化早期及发展过程中个体差异的主要原因。大量人群调查发现ε4等位基因的一般作用是可以显著地升高健康人的总胆固醇浓度,使之易患动脉粥样硬化,相反,ε 2等位基因的一般作用是降低胆固醇浓度,其降低效应是ε 4升高胆固醇的2 3倍。ApoE等位基因变异还与血浆ApoB浓度、甘油三酯及血管收缩压有关。ε 2等位基因对冠状动脉硬化的发展有防护作用,经临床研究发现,患心血管疾病如心肌梗塞幸存者,或血管造影证明有动脉粥样硬化者,比其对照组的ε 4等位基因频率高。ΑροΕ4/3杂合子比Ε3/2和Ε3/3基因型者发生心肌梗塞年龄早。ApoE多态性变异还与肾病综合症、糖尿病有关。值得重视的是ApoE多态性与老年性痴呆病(AD)的关系。1993年,Rose研究发现,晚发性家族型AD病人ε 4频率增多,还发现ApoE和来源于淀粉样前体蛋白的小多肽A β的未和力很闻。其后陆续发现AD病人中携带ε 4等位基因者占46. 2%,而对照组占13. 2%。还发现携带二个ε 4等位基因的研究对象比携带一个ε 4的研究对象发生AD年龄早,比不携带ε 4等位基因的研究对象发生AD年龄更早,1994年,Schacher等人相继报道百岁老人普遍携带ε 2基因。。这一发现使ApoE多态性和研究向前迈出了一大步。有报道高老年人携带ε2等位基因数量是年青人的2倍。因此ε2等位基因似乎不仅可以保护人们免患AD,而且还与长寿有关。ApoE多态性与AD的关系,目前的研究主要集中在脑代谢中与A β或Tau蛋白以及神经元生长和分枝等有关。总之,在研究高脂血症评定心脑血管疾病的危险因素方面,以ApoE多态性为手段进行研究有重要的临床意义。有学者认为,基因型的“坏”(ε 4)和“好”(ε 2)的等位基因之间的平衡,可作为基因分析应用于医学检验领域,协助临床疾病的诊断。载脂蛋白E测定方法很多,包括(一)放射免疫测定法(RIA)、(二)酶联免疫测定法(ELISA)、(三)乳胶凝集试验和免疫比浊法、(四)荧光免疫测定法。这些方法具有操作繁琐、耗时长、过度浪费资源的缺点,不适于常规检验
发明内容
本发明的目的是提供一种载脂蛋白E的检测试剂盒。该试剂盒可直接应用于全自动生化分析仪上,结果准确性强、试剂稳定性好、使用方便、便于大规模推广。本发明的另一目的是提供上述检测试剂盒的生产制备及使用方法。为实现上述目的,本发明提供的试剂盒组成为
试剂Rl :缓冲液、聚乙二醇、叠氮钠、乙二胺四乙酸钠、牛血清白蛋白;
试剂R2 :缓冲液、结合有载脂蛋白E单克隆抗体的乳胶粒子、吐温-20、叠氮钠、乙二胺四乙酸钠、牛血清白蛋白。本发明提供的上述试剂盒的制备方法及操做步骤如下
(a)按下列比例配制好试剂试剂Rl
Tris 缓冲液 200-220mmol/L 聚乙二醇5-10 mmol /I,
叠氮钠1-5 mmol/L
乙二胺四乙酸钠l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l-5mmol/L ;
试剂R2
Tris 缓冲液 200-220mmol/L
结合有载脂蛋白E单克隆抗体的乳胶粒子 3. 5-5% (v/v)
吐温-20l-5mmol/L
叠氮钠O. 5-3 mmol/L
乙二胺四乙酸钠l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l-5mmol/L ;
(b)将试剂与待测样本按一定比例混合,使其完全反应;
(c)用半/全自动生化分析仪测定吸光度变化值;
Cd)根据吸光度变化值计算出样本中载脂蛋白E的浓度。
具体实施例方式下述实施例是为了更详细的解释本发明,但不应理解为本发明局限于此。实施例I :
本发明的试剂盒举例是双试剂,其中
试剂Rl
Tris 缓冲液 200mmol/L 聚乙二醇8 mmol /I,
叠氮钠5 mmol/L
乙二胺四乙酸钠5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L ;
试剂R2
Tris 缓冲液 200mmol/L 结合有载脂蛋白E单克隆抗体的乳胶粒子 5% (v/v)吐温 _20Smmol /I,
叠氮钠3 mmol/L
乙二胺四乙酸钠5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L。实施例2 :试剂盒使用方法
I.试剂准备,试剂为液体双试剂,开瓶即用,其中
试剂Rl
Tris 缓冲液 200mmol/L 聚乙二醇8 mmol /I,
叠氮钠5 mmol/L
乙二胺四乙酸钠5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L ;
试剂R2
Tris 缓冲液 200mmol/L 结合有载脂蛋白E单克隆抗体的乳胶粒子 5% (v/v)
吐温 _20Smmol /I,
叠氮钠3 mmol/L
乙二胺四乙酸钠5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L。2.全自动生化仪参数设置
(a)检测温度37°C
(b)检测波长主波长为340nm;
(c)反应时间10分钟。3.检测步骤(全部在全自动生化分析仪中完成)
(a)取180μ L试剂I和3 μ L血清样本混匀;
(b)将混匀后的溶液在37°C温育5分钟,读取吸光度Al;
(c)再添加60μ L试剂2,反应5分钟后,读取吸光度Α2 ;
(d)计算ΛA= Α2 - Al。4.通过吸光度变化值计算出载脂蛋白E的浓度。本发明具有的优点
该试剂盒结果准确性强、试剂稳定性好、使用方便、便于大规模推广。所需检测仪器(生化分析仪)在各大医院和检测中心普遍使用。
权利要求
1.一种载脂蛋白E检测试剂盒,其组成为试剂R1、试剂R2,其中 a、试剂Rl 包括200-220mmol/L Tris 缓冲液、5-10 mmol/L 聚乙二醇、1_5 mmol/L 叠氮钠、l-5mmol/L乙二胺四乙酸钠、l_5mmol/L牛血清白蛋白; b、试剂R2200-220mmol/L Tris缓冲液、结合有载脂蛋白E单克隆抗体的乳胶粒子、l_5mmol/L 吐温 _20、0. 5-3 mmol/L 叠氣纳、l_5mmol/L 乙二胺四乙酸纳、l-5mmol/L 牛血清白蛋白。
2.权利要求I的试剂盒,其特征在于试剂R2中的载脂蛋白E单克隆抗体的乳胶粒子的制备方法为10. 5mg/ml的载脂蛋白E单克隆抗体与10%的乳胶颗粒(直径50_100nm),加入到200-220mmol/L Tris缓冲液中,震荡反应4小时,离心去上清,再用200-220mmol/LTris缓冲液稀释至O. 5%,并加入O. 1-0. 3 mmol/L叠氮钠。
3.上述试剂盒的制备和操作方法,主要步骤为 (a)按下列比例配制好试剂 试剂Rl Tris 缓冲液 200-220mmol/L 聚乙二醇5-10 mmol /I, 叠氮钠1-5 mmol/L 乙二胺四乙酸钠l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l_5mmol/L 试剂R2 Tris 缓冲液 200-220mmol/L 结合有载脂蛋白E单克隆抗体的乳胶粒子 3. 5-5% (v/v) 吐温-20l-5mmol/L 叠氮钠0. 5-3 mmol/L 乙二胺四乙酸钠l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l_5mmol/L (b)将试剂与待测样本按一定比例混合,使其完全反应; (c)用半/全自动生化分析仪测定吸光度变化值; Cd)根据吸光度变化值计算出样本中载脂蛋白E的浓度。
4.权利要求3的方法,其特征在于,被测样品与试剂比例应控制在I: 75到I :85之间。
5.权利要求3的方法,其特征在于,反应温度为37(±1) °C。
6.权利要求3的方法,其特征在于,反应时间为10分钟。
7.权利要求3的方法,其特征在于,用半/全自动生化分析仪检测的波长为340nm。
全文摘要
一种载脂蛋白E检测试剂盒。试剂盒盒体内包括试剂R1缓冲液、聚乙二醇、叠氮钠、乙二胺四乙酸钠、牛血清白蛋白;试剂R2缓冲液、结合有载脂蛋白E单克隆抗体的乳胶粒子、吐温-20、叠氮钠、乙二胺四乙酸钠、牛血清白蛋白。通过将样品与试剂按一定的体积比混合,使之发生一系列反应,再将反应物置于半/全自动生化分析仪下,检测主波长340nm处吸光度变化的速度,从而测算出载脂蛋白E的浓度大小。本试剂盒具有准确、稳定、方便的优点。
文档编号G01N33/577GK102818900SQ20121029168
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月16日 优先权日2012年8月16日
发明者谢兵 申请人:北京恩济和生物科技有限公司
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