专利名称：一种测定乳制品中乳铁蛋白的高效亲和色谱法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种乳铁蛋白含量的測定方法，具体涉及ー种测定乳制品中乳铁蛋白的高效亲和色谱法。
背景技术：
乳铁蛋白(Lactoferrin, Lf)是ー种铁结合性多功能糖蛋白，分子量为70_80kD,又称乳转铁蛋白，因其晶体呈红色，也被俗称为“红蛋白”。Lf广泛存在于乳汁、唾液、泪液等外分泌液或血浆中性粒细胞中。乳铁蛋白是ー种多功能蛋白质，具有广谱抗菌，抗病毒感染作用，能调节体内铁的平衡；调节骨髓细胞的生成，促进细胞的生长；调节机体免疫功能，增强机体抗病能力；抑制人体肿瘤细胞的作用；能同多种抗生素及抗真菌制剂协同作用，更有效地治疗疾病。血液中Lf来自于嗜中性白细胞，主要在动物炎症反应时合成乳铁蛋白。因此，乳铁蛋白被认为是ー种新型的抗菌抗癌药物和极具开发潜カ的功能性食品配 料，广泛应用于配方奶粉、乳品、保健品、医药等方面。Lf由乳腺合成，分娩后乳腺合成能力逐渐减弱。Lf在动物乳汁中的含量随动物种类、泌乳期、胎次、个体等而有所不同。牛常乳Lf含量0. 02-0. 35g/L，初乳I. 5-5. Og/L,同一个体常乳含量约为初乳的20%。山羊、猪乳中Lf含量O. 02-0. 2g/L ;而人乳中Lf含量达2. Og/L。目前測定乳制品中乳铁蛋白含量的方法有酶联免疫吸附法(ELISA)、分光光度法、毛细管电泳法(CE)、高效液相色谱法(HPLC)等。其中，ELISA灵敏度高，检出限低，样品无需纯化，但是该法试剂盒费用昂贵，且受环境和操作人员的影响较大，稳定性差，比较适合大批量样品的初步筛选，不适用于准确定量分析；分光光度法快速简便，但此法受其他物质的干扰明显，准确性稍差，仅适用于分离纯化后具有较高浓度的乳铁蛋白的分析；CE法与HPLC法均能快速准确的对乳铁蛋白定量，但是利用毛细管色谱柱、反相色谱柱或离子色谱柱分离，前处理均较复杂，样品需经过特殊浄化，要求较为严格，而目前还没有快速有效的浄化方法；使用凝胶色谱柱时，乳铁蛋白与其他杂蛋白分子大小接近吋，很难达到基线分离。专利CN 011672835B《一种测定乳制品中乳铁蛋白的方法》，公开了采用盐溶盐析预处理样品，阳离子交换柱进行液相色谱分析，前处理复杂且液相色谱分析时间长。亲和色谱是利用偶联了亲和配基的亲和吸附介质为固定相来亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的液相色谱法。亲和色谱已经广泛应用于生物分子的分离纯化和分析。发明专利CN 1319990C《牛初乳中乳铁蛋白的分离提纯エ艺方法》，公开了利用肝素-琼脂糖树脂柱从牛初乳中分离提纯乳铁蛋白，获得纯度大于90 %的乳铁蛋白。上海德诺产品检测有限公司公开了《一种乳制品中乳铁蛋白含量的測定方法》(公开号CN102590418A)，方法采用肝素亲和层析柱作为脱脂乳液的前处理净化柱，C18色谱柱进行分离，高效液相色谱法测定乳铁蛋白的含量。本发明采用肝素亲和层析柱作为色谱柱，用高效液相色谱系统进行分离、检測。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，克服现有技术中測定乳制品中乳铁蛋白含量的成本高、前处理复杂、准确性较差或分离度达不到要求等缺陷，将亲和层析柱用于高效液相色谱系统，提供一种简便快速，准确度高且成本低的乳制品中乳铁蛋白含量的測定方法。本发明的一种测定乳制品中乳铁蛋白的高效亲和色谱法，包括以下步骤I.实验操作称取样品3. 0-5. Og于50mL比色管中，加入10_20mL水，涡旋混匀后，超声提取30min。提取完毕后，用有机酸调节pH值至4. 6，静止10_30min沉淀蛋白后，用超纯水至提取液体积为25_50mL,转移约10mT,提取液至50mL离心管中，3000-8000r/min下离心3_10min,取上清液过O. 45 μ m水系滤膜，直接进样或适宜稀释后进样測定。2.色谱测定 称取乳铁蛋白标准品，用水溶解并定容后作为储备液，然后进一歩用水稀释为具有浓度梯度的标准使用液；利用液相色谱仪对试样进行检测，外标法定量；由于采用上述技术方案，本发明的有益效果在于I.建立了測定乳制品中乳铁蛋白的高效亲和色谱法，比已有的方法专属性高、定量准确且成本低。2.对样品采用水提取，有机酸沉淀酪蛋白，前处理简单、快速。3.本发明可应用于乳制品中乳铁蛋白含量的检测，对促进我国乳制品检测具有重要意义。
图I为乳铁蛋白标准品的HPLC图谱。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进ー步详细说明，但本发明并不局限于具体实施例。实施例I配方奶粉中乳铁蛋白含量的测定I.样品提取称取样品5. Og于50mL比色管中，加入15mL超纯水，涡旋混匀后，超声提取30min。提取完毕后,用こ酸调节pH值至4. 6,静止IOmin沉淀酪蛋白，加入超纯水，使提取液体积为25mL,润旋混勻后,转移IOmL提取液至50mL离心管中，8000r/min下离心5min,取上清液过O. 45 μ m水系滤膜，滤液待测。2.高效液相色谱系统測定按照液相色谱条件测定样品和标准工作溶液，用标准曲线对样品溶液浓度进行校正，外标法定量。色谱条件为色谱柱GEHea I thcare Hitrap Heparin HP 柱，ImL ；波长280nm；进样量20yL;流速0.5mL/min ；
柱温30で；流动相为A 0. 01mol/L, pH = 7的磷酸钠缓冲溶液，B 0. 01mol/L, pH = 7的含有lmol/L的氯化钠的磷酸钠缓冲溶液；ニ元梯度洗脱0-5min，采用体积比为100%流动相A ；5-12min,由体积比为100%流动相A线性转换为100%流动性B ;12_19min，采用体积比为100%流动相B ；19-20min,由体积比为100%流动相B线性转换为100%流动性A，保持5min。3.线性关系将标准溶液逐级稀释，制备浓度为17，34，85，170，340,850 μ g/mL六个不同浓度的系列混合标准溶液，按浓度从低到高顺序，依照上述色谱条件測定。每ー浓度測定3次，按其标准溶液浓度C( μ g/mL)与对应平均峰面积A作标准曲线图，回归方程为A=2. 443C-37. 57，相关系数为 0. 9994。4.实际样品测定及准确度选取两个品牌的配方奶粉，每个样品平行測定3次，计算其乳铁蛋白的含量。 測定结果为A品牌一段奶粉中乳铁蛋白未检出，B品牌三段奶粉中乳铁蛋白的含量为34.8mg/100g。采用A品牌一段奶粉阴性样品进行加标测定其准确度，加标浓度分别为30mg/100g和60mg/100g，每个浓度平行测定三次，平均回收率分别为100. 9%和87. 4%，相对标准偏差分别为0. 95%和0. 26%。5.检测低限以奶粉阴性样品进行添加试验，以3倍信噪比求得方法对乳铁蛋白的检出限(LOD)。乳铁蛋白在奶粉样品中的检测低限为2mg/100g。实施例2牛奶及人乳中乳铁蛋白含量的测定I.样品提取同实施例I。2.高效液相色谱系统測定条件同实例I。3.线性关系同实施例I。4.实际样品測定、精密度及准确度某牛奶样品中乳铁蛋白含量平行測定6次，计算其精密度，该牛奶样品中乳铁蛋白的含量为14. 06mg/100g，相对标准偏差为I. 5%。对两个人乳样品进行平行測定，计算结果为A人乳中乳铁蛋白的含量为351. 4mg/100g, B人乳中乳铁蛋白的含量为100. 6mg/100g。
权利要求
1.一种测定乳制品中乳铁蛋白的高效亲和色谱法，其特征在于所述测定方法包括如下的步骤 试样经水提取，提取液经有机酸调节pH值至4. 6沉淀酪蛋白后，离心，采用亲和层析柱分离，用配置二极管阵列检测器的高效液相色谱系统测定含量。
2.根据权利要求I所述的测定方法，其特征在于，所述的有机酸为甲酸或乙酸。
3.根据权利要求I所述的测定方法，其特征在于，所述的亲和层析柱为肝素亲和层析柱。
4.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，所述的肝素亲和层析柱优选GEHealthcare Hitrap Heparin HP 柱，ImL 或 5mL。
5.根据权利要求I所述的测定方法，其特征在于，所述的高效液相色谱测定系统的流·动相为A 0. Olmo 1/L，pH = 7的磷酸钠缓冲溶液，B 0. Olmol/L, pH = 7的含有lmol/L的氯化钠的磷酸钠缓冲溶液；二元梯度洗脱0-5min,采用体积比为100%流动相A ；5-12min,由体积比为100%流动相A线性转换为100%流动性B ;12-19min，采用体积比为100%流动相B ；19-20min,由体积比为100%流动相B线性转换为100%流动性A，保持5min。
6.根据权利要求I或5所述的测定方法，其特征在于，所述的高效液相色谱系统的色谱条件还包括流动相流速O. 4-1. OmL/min ;检测波长280nm ;柱温25_30°C,进样体积10_50u L0
7.根据权利要求I所述的测定方法，其特征在于，所述的乳制品为婴幼儿配方食品、牛奶、羊奶、人乳、还原乳或含乳饮料。
全文摘要
本发明公开了一种测定乳制品中乳铁蛋白的高效亲和色谱法(1)将乳制品用水提取，有机酸调节pH值沉淀酪蛋白，离心获得测试液；(2)测试液采用高效液相色谱系统分离检测，所采用的色谱柱为亲和层析柱，检测器为二极管阵列检测器。高效液相色谱系统的流动相为A0.01mol/L，pH7.0的磷酸钠缓冲溶液，B0.01mol/L，pH7.0的含有1mol/L氯化钠的磷酸钠缓冲溶液，采用梯度洗脱。本发明的方法线性回归方程相关系数＞0.999，最低检出量为2mg/100g。本发明采用亲和色谱法解决了样品基质复杂、不易准确定量的问题；具有前处理简单、分离效果好、专属性强、准确度高、受环境变化影响小等技术特点。
文档编号G01N30/02GK102854262SQ20121030293
公开日2013年1月2日 申请日期2012年8月24日 优先权日2012年8月24日
发明者宋薇 申请人:青岛谱尼测试有限公司