专利名称：一种视黄醇检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体地说涉及一种检测人视黄醇结合蛋白的检测试剂盒。
背景技术：
视黄醇结合蛋白，是血浆中特异结合维生素A的结合蛋白，在维生素A的代谢中起重要作用。视黄醇结合蛋白的临床检测有助于肝炎、糖尿病早期诊断、肾脏疾病的诊断。 视黄醇结合蛋白主要由肝脏粗面内质网合成。广泛分布于人体血清、尿液、脑脊液中。在血液中视黄醇结合蛋白以复合物形式存在。当肝细胞损伤时.视黄醇结合蛋白的合成受到抑制。由于视黄醇结合蛋白的半衰期为3 12小时。其相对分子量小，且与血清总胆红素、白蛋白、凝血酶原时间相关。所以它可敏感地反映肝功能的改变。同时急性病毒性肝炎患者血清视黄醇结合蛋白含量与AST、ALP、ALT负相关。故可说明血清视黄醇结合蛋白是反映肝细胞受损的灵敏指标。尿视黄醇结合蛋白是一种低分子蛋白，可在肾小球滤过膜自由滤过并绝大部分被肾近曲小管重吸收而分解代谢。正常情况下，尿视黄醇结合蛋白排泌量甚微，当肾近曲小管受损时，尿视黄醇结合蛋白排泌量明显增加。因此测定尿视黄醇结合蛋白水平能更灵敏地反映肾小管的功能情况，且特异性较高。视黄醇结合蛋白本身具有很好的稳定性，在体内的含量相对恒定，一般情况下，正常人尿中视黄醇结合蛋白的含量极少，故有学者认为其在尿中的排泄量可作为肾小管功能受损的一个灵敏指标，能早期反映肾小管的损害问。研究表明，在糖尿病早期尚未发生肾小球功能障碍时，已存在肾小管的功能损伤。而在诊断糖尿病肾小管损害时，尿视黄醇结合蛋白可作为早期糖尿病肾病的一个更敏感的诊断指标。为早期糖尿病肾病的诊断提供依据。以使患者得到及时的诊治，改善预后，提高生存质量。视黄醇结合蛋白测定方法很多，包括··( 一)放射免疫测定法(RIA)、(二)酶联免疫测定法(ELISA)、(三)乳胶凝集试验和免疫比浊法、(四)荧光免疫测定法、(五)滴金免疫法。这些方法具有操作繁琐、耗时长、过度浪费资源的缺点，不适于常规检验。
发明内容
本发明的目的是提供一种视黄醇结合蛋白的检测试剂盒。该试剂盒可直接应用于全自动生化分析仪上，结果准确性强、试剂稳定性好、使用方便、便于大规模推广。本发明的另一目的是提供上述检测试剂盒的生产制备及使用方法。为实现上述目的，本发明提供的试剂盒组成为
试剂Rl :缓冲液、聚乙二醇、叠氮钠、乙二胺四乙酸钠、牛血清白蛋白；
试剂R2:缓冲液、结合有视黄醇结合蛋白单克隆抗体的乳胶粒子、吐温-20、叠氮钠、乙二胺四乙酸钠、牛血清白蛋白。
本发明提供的上述试剂盒的制备方法及操做步骤如下
(a)按下列比例配制好试剂
试剂Rl
Tris 缓冲液 200-220mmol/L 聚乙二醇5-10 mmol /I,
叠氮钠1-5 mmol/L
乙二胺四乙酸钠l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l-5mmol/L ;
试剂R2 · Tris 缓冲液 200-220mmol/L
结合有视黄醇结合蛋白单克隆抗体的乳胶粒子 3.5-5% (v/v)
吐温-20l-5mmol/L
叠氮钠O. 5-3 mmol/L
乙二胺四乙酸钠l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l_5mmol/L
(b)将试剂与待测样本按一定比例混合，使其完全反应；
(c)用半/全自动生化分析仪测定吸光度变化值；
Cd)根据吸光度变化值计算出样本中视黄醇结合蛋白的浓度。
具体实施例方式下述实施例是为了更详细的解释本发明，但不应理解为本发明局限于此。实施例I :
本发明的试剂盒举例是双试剂，其中
试剂Rl
Tris 缓冲液 200mmol/L 聚乙二醇8 mmol /I,
叠氮钠5 mmol/L
乙二胺四乙酸钠5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L ;
试剂R2
Tris 缓冲液 200mmol/L
结合有视黄醇结合蛋白单克隆抗体的乳胶粒子 5% (v/v)
吐温 _20Smmol /I,
叠氮钠3 mmol/L
乙二胺四乙酸钠5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L。实施例2 :试剂盒使用方法
I.试剂准备，试剂为液体双试剂，开瓶即用，其中
试剂Rl Tris 缓冲液 200mmol/L 聚乙二醇8 mmol/L
叠氮钠5 mmol/L
乙二胺四乙酸钠5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L ;
试剂R2
Tris 缓冲液 200mmol/L
结合有视黄醇结合蛋白单克隆抗体的乳胶粒子 5% (v/v) 吐温 _20Smmol /I,
叠氮钠3 mmol/L
乙二胺四乙酸钠5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L。2.全自动生化仪参数设置
(a)检测温度37°C
(b)检测波长主波长为340nm；
(c)反应时间10分钟，其中，温育时间5分钟，反应时间5分钟。3.检测步骤(全部在全自动生化分析仪中完成)
(a)取200μ L试剂I和10 μ L血清样本混匀；
(b)将混匀后的溶液在37°C温育5分钟，读取吸光度值Al；
(c)再添加50μ L试剂2，反应5分钟后，读取吸光度值Α2 ；
(d)计算ΛΑ=Α2_Α1。4.通过Λ A计算出视黄醇结合蛋白的浓度。本发明具有的优点
该试剂盒结果准确性强、试剂稳定性好、使用方便、便于大规模推广。所需检测仪器(生化分析仪)在各大医院和检测中心普遍使用。
权利要求
1.一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其组成为试剂R1、试剂R2， 其中 a、试剂Rl 包括200-220mmol/L Tris 缓冲液、5-10 mmol/L 聚乙二醇、1_5 mmol/L 叠氮钠、l-5mmol/L乙二胺四乙酸钠、l_5mmol/L牛血清白蛋白； b、试剂R2200-220mmol/L Tris缓冲液、结合有视黄醇结合蛋白单克隆抗体的乳胶粒子、l_5mmol/L 吐温-20、O. 5-3 mmol/L叠氮钠、l_5mmol/L 乙二胺四乙酸钠、l_5mmol/L牛血清白蛋白。
2.权利要求I的试剂盒，其特征在于试剂R2中的视黄醇结合蛋白单克隆抗体的乳胶粒子的制备方法为10. 5mg/ml的视黄醇结合蛋白单克隆抗体与10%的乳胶颗粒(直径50-100nm)，加入到200-220mmol/L Tris缓冲液中，震荡反应4小时， 离心去上清，再用200_220mmol/L Tris缓冲液稀释至O. 5%,并加入O. 1-0.3 mmol/L叠氮钠。
3.上述试剂盒的制备和操作方法，主要步骤为 (a)按下列比例配制好试剂 试剂Rl Tris 缓冲液 200-220mmol/L 聚乙二醇5-10 mmol /I, 叠氮钠1-5 mmol/L 乙二胺四乙酸钠l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l-5mmol/L ; 试剂R2 Tris 缓冲液 200-220mmol/L 结合有视黄醇结合蛋白单克隆抗体的乳胶粒子 3.5-5% (v/v) 吐温-20l-5mmol/L 叠氮钠0. 5-3 mmol/L 乙二胺四乙酸钠l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l-5mmol/L ; (b)将试剂与待测样本按一定比例混合，使其完全反应； (c)用半/全自动生化分析仪测定吸光度变化值； Cd)根据吸光度变化值计算出样本中视黄醇结合蛋白的浓度。
4.权利要求3的方法，其特征在于，被测样品与试剂比例应控制在I: 20到I :30之间。
5.权利要求3的方法，其特征在于，反应温度为37(±1) °C。
6.权利要求3的方法，其特征在于，反应时间为8-12分钟。
7.权利要求3的方法，其特征在于，用半/全自动生化分析仪检测的波长为340nm。
全文摘要
一种视黄醇结合蛋白的检测试剂盒。试剂盒盒体内包括试剂R1缓冲液、聚乙二醇、叠氮钠、乙二胺四乙酸钠、牛血清白蛋白；试剂R2缓冲液、结合有视黄醇结合蛋白单克隆抗体的乳胶粒子、吐温-20、叠氮钠、乙二胺四乙酸钠、牛血清白蛋白。通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列反应，再将反应物置于半/全自动生化分析仪下，检测主波长340nm处吸光度变化的速度，从而测算出视黄醇结合蛋白的浓度大小。本试剂盒具有准确、稳定、方便的优点。
文档编号G01N33/68GK102841210SQ20121031284
公开日2012年12月26日 申请日期2012年8月30日 优先权日2012年8月30日
发明者谢兵 申请人:谢兵