专利名称：苯乙醇胺a的免疫胶体金检测卡及其制备方法
技术领域：
本发明涉及β -肾上腺素受体激动剂检测技术领域，特别是涉及苯乙醇胺A的免疫胶体金检测卡及其制备方法。
背景技术：
近年来，接连不断的瘦肉精事件已成为中国食品安全领域挥之不去的幽灵。去年，湖南省成功破获一起涉及福建、湖南、浙江三省的瘦肉精生产、销售案件，并从饲料中检测出以前从未出现过的苯乙醇胺Α，这种瘦肉精新品种的出现，再次敲响了我国食品安全警
钟。 苯乙醇胺Α，又称“克伦巴胺”，可被非法添加于猪和牛的饲料中，有刺激动物生长，加强蛋白质在动物体内沉积，提高基础代谢水平，使体脂趋于分解等作用，也可促进猪生长速度加快、使其皮红毛亮、瘦肉率提高。人食用含这种瘦肉精的肉后，会出现恶心、头晕、四肢无力、手颤等中毒症状，甚至诱发高血压、心脏病等。因此，近期被农业部第1519号公告列为“禁止在饲料和动物饮水中使用的物质”。现有技术对于苯乙醇胺A的检测主要是高效液相色谱-串联质谱法、高效液相色谱法等检测方法，但这些技术的缺陷明显设备昂贵、操作复杂、难以推广。所以，建立一种简单、有效、适合基层使用的测定方法是极其必要的。本发明的目的是研制一种更适合企业进行现场检测且快捷简便、成本低廉的定性检测方法。
发明内容
针对以上情况，本发明的目的就是为了克服现有技术存在的缺陷而提供一种苯乙醇胺A的免疫胶体金检测卡及其制备方法，可有效解决能快速、简便地检测出β -肾上腺素受体激动剂苯乙醇胺A的问题。本发明的苯乙醇胺A胶体金检测卡，包括包被了单克隆抗体胶体金标记物的胶体金结合垫、包被了苯乙醇胺A-BSA和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、样品垫、吸水垫、PVC胶板和塑料模具组成，在PVC胶板的一端依次粘附样品垫、结合垫，中间黏贴硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水垫。本发明的苯乙醇胺A胶体金检测卡的制备方法，是由以下步骤实现
(1)胶体金溶液制备取IL三角烧瓶I个,加入超纯水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4 · 3H20) 5 mL，配制成500 mL O. 01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠(Na3C6H5O7 · 2H20)溶液5_7 mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5 min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8°C保存备用；
(2)抗体的预处理将要标记的苯乙醇胺A抗体在1000r/min, 4°C条件下，离心20min,取上清，用 O. 01 mol/L PBS 稀释成 I mg/mL ;或者用 O. 01 mol/L PBS 稀释成 I mg/mL,过O. 22 Mm滤膜；
(3)胶体金标记物的制备取步骤(I)中的胶体金溶液40mL，用0.25 mol/L K2CO3调节胶体金溶液pH至8. 5,电磁搅拌器250 r/min搅拌,逐滴加入4 mL含O. 3 mg抗体蛋白的蛋白溶液，反应10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA,继续搅拌反应10 min ;金标抗体溶液常温低速(1500 r/min)离心10 min,弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4°C,12000 r/min离心20 min,弃上清,收集沉淀,将沉淀用金标抗体稀释液定容至I mL,制备成苯乙醇胺A单克隆抗体胶体金标记物；
(4)胶体金膜的制备将步骤(3)苯乙醇胺A单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5PL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含苯乙醇胺A单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜；
(5)包被膜制备将羊抗鼠IgG抗体、苯乙醇胺A蛋白质偶联物稀释成Img/mL，用划膜仪依次以I KL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37°C包被2 h后，室温自然晾干或者37°C烘干； (6)样品垫前处理将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；
(7)检测卡的组装PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水垫，组装成试纸条，切割成一定宽度的长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。所述步骤(5)中所包被的检测线T设在质控线C的下方；
所述步骤(6)中的样品垫处理液是由I g小牛血清蛋白(BSA)和O. 8 g氯化钠(NaCl),用含有 O. 5%TRIT0N-100 的 O. 01 mol/L PBS 定容至 100 mL ；
本发明可有效用于测定β -肾上腺素受体激动剂苯乙醇胺Α，方法简单，方便、快捷，结果准确。
图I为本发明苯乙醇胺A的免疫胶体金检测卡的结构图图中I.加样孔 2.检测线3.质控线4.检测孔5.试纸条6.检测卡外壳；
图2为本发明苯乙醇胺A的免疫胶体金检测卡内的试纸条的剖视结构图，图中7.样品垫8.胶体金结合垫9. PVC胶板10.硝酸纤维素膜11.吸水垫。
具体实施例方式实施例I
图I为本发明苯乙醇胺A的免疫胶体金检测卡的结构图、图2为本发明苯乙醇胺A的免疫胶体金检测卡内的试纸条的剖视结构图图中9为PVC胶板；7为样品垫；8为胶体金结合垫，该胶体金结合垫上包被了单克隆抗体胶体金标记物；10为包被膜，即硝酸纤维素膜，该硝酸纤维素膜上包被了苯乙醇胺A-BSA和羊抗鼠IgG ;11为吸水垫，由吸水材料如滤纸制成。在PVC胶板9的一端上(样品端)粘附样品垫7、胶体金结合垫8，样品垫7和胶体金结合垫8为并排结构。在PVC胶板9的中间粘附硝酸纤维素膜10。在硝酸纤维素膜10上设置有羊抗鼠IgG质控线3和苯乙醇胺A-BSA检测线2。在PVC胶板9的另一端粘附吸水垫11。硝酸纤维素膜10的一端与结合垫8略交叉，另一端与吸水垫11略交叉。该试纸条5可装入有塑料模具制成的检测卡外壳6中，在检测卡外壳6的上盖上设有加样孔I和检测孔4，样品垫7正对加样孔1，硝酸纤维素膜10正对检测孔4。实施例2
苯乙醇胺A胶体金检测卡制备，是由以下步骤具体实现
(1)胶体金溶液制备取IL三角烧瓶I个,加入超纯水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4 · 3H20) 5 mL，配制成500 mL O. 01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠(Na3C6H5O7 · 2H20)溶液5_7 mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5 min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8°C保存备用；
(2)抗体的预处理将要标记的苯乙醇胺A抗体在1000r/min, 4°C条件下，离心20min,取上清,用 O. 01 mol/L PBS 稀释成 I mg/mL ;或者用 O. 01 mol/L PBS 稀释成 I mg/mL, 过O. 22 Mm滤膜；
(3)胶体金标记物的制备取步骤(I)中的胶体金溶液40mL，用0.25 mol/L K2CO3调节胶体金溶液pH至8. 5,电磁搅拌器250 r/min搅拌,逐滴加入4 mL含O. 3 mg抗体蛋白的蛋白溶液，反应10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA,继续搅拌反应10 min ;金标抗体溶液常温低速(1500 r/min)离心10 min,弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4°C,12000 r/min离心20 min,弃上清,收集沉淀,将沉淀用金标抗体稀释液定容至I mL,制备成苯乙醇胺A单克隆抗体胶体金标记物；
(4)胶体金膜的制备将步骤(3)苯乙醇胺A单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5PL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含苯乙醇胺A单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜；
(5)包被膜制备将羊抗鼠IgG抗体、苯乙醇胺A蛋白质偶联物稀释成Img/mL，用划膜仪依次以I KL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37°C包被2 h后，室温自然晾干或者37°C烘干；
(6)样品垫前处理将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；
(7)检测卡的组装PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉，组装成试纸条，切割成一定宽度长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。实施例3 最低检出限量试验
苯乙醇胺A最低检出限量试验
准确称量O. 500 g苯乙醇胺A标准品溶于超纯水并定容至100 mL,标为A1溶液，取A1溶液I mL于容量瓶加超纯水并定容至1000 mL，形成A2溶液，取A2溶液I mL于容量瓶加超纯水并定容至1000 mL,形成A3溶液，则A3溶液的浓度为5 ng/mL (5ppb)。取A3溶液ImL于4支试管中，并分别标号广4，往试管中分别加入往9 mL、4 mL、l mL、0 mL超纯水，配成苯乙醇胺A标准品溶液浓度分别是0. 5 ng/mL、l ng/mL、2. 5 ng/mL>5 ng/mL ;另取一支空试管，加入5 mL超纯水,标为5号试管。取上述I、号试管中液体作为样品滴加到苯乙醇胺A检测卡上，加样后5 min观察结果，检测线2和质控线3的显色结果见表I。表I苯乙醇胺A最低检出限量试验
权利要求
1.苯乙醇胺A胶体金检测卡，其特征在于按照下述步骤制备得到 胶体金溶液制备取I L三角烧瓶I个，加入超纯水495 mL，而后加入1%氯金酸HAuCl4 · 3H20 5 mL，配制成500 mL O. 01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠Na3C6H5O7 · 2H20溶液5_7 mL,继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5 min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8°C保存备用； 抗体的预处理将要标记的苯乙醇胺A抗体在1000 r/min, 4°C条件下,离心20 min,取上清，用O. 01 mol/L PBS稀释成I mg/mL ;或者用O. 01 mol/L PBS稀释成I mg/mL,过O. 22 Mm 滤膜； 胶体金标记物的制备取步骤(I)中的胶体金溶液40 mL，用O. 25 mol/L K2CO3调节胶体金溶液pH至8. 5,电磁搅拌器250 r/min搅拌,逐滴加入4 mL含O. 3 mg抗体蛋白的蛋白溶液，反应10 min ;逐滴加入4 mL 10% BSA,继续搅拌反应10 min ;金标抗体溶液常温1500 r/min离心10 min,弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4 , 12000 r/min离心20 min,弃上清,收集沉淀,将沉淀用金标抗体稀释液定容至I mL,制备成苯乙醇胺A单克隆抗体胶体金标记物； 胶体金膜的制备将步骤(3)苯乙醇胺A单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5 PL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含苯乙醇胺A单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜； 包被膜制备将羊抗鼠IgG抗体、苯乙醇胺A蛋白质偶联物稀释成I mg/mL，用划膜仪依次以I KL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37°C包被2 h后，室温自然晾干或者37°C烘干； 样品垫前处理将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干； 检测卡的组装PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水垫，组装成试纸条，切割成一定宽度的长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。
2.根据权利要求I所述的苯乙醇胺A胶体金检测卡，其特征在于所述步骤(5)中所包被的检测线T设在质控线C的下方； 所述步骤(6)中的样品垫处理液是由I g小牛血清蛋白和O. 8 g氯化钠，用含有O. 5%TRIT0N-100 的 O. 01 mol/L PBS 定容至 100 mL。
全文摘要
本发明苯乙醇胺A的免疫胶体金检测卡及其制备方法，涉及β-肾上腺素受体激动剂检测技术领域。本发明的检测卡外壳中的试纸条，由PVC胶板、样品垫、胶体金结合垫、包被膜和吸水垫组成；胶体金膜为含苯乙醇胺A单克隆抗体的玻璃纤维素膜，包被膜是硝酸纤维素膜，其上设有T线和C线，T线包被有苯乙醇胺A蛋白质偶联物，C线包被有羊抗鼠IgG抗体。本发明有效用于快速检测苯乙醇胺A，方便、快捷、结果准确。
文档编号G01N33/577GK102901819SQ201210366789
公开日2013年1月30日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年9月27日
发明者杜道林, 洪霞, 张祯, 薛永来 申请人:江苏维赛科技生物发展有限公司