专利名称：检测残留苯乙醇胺a的酶联免疫试剂盒及其使用方法
技术领域：
本发明公开了一种检测动物组织及其代谢物中苯乙醇胺A的酶联免疫试剂盒及其检测方法，属于酶联免疫吸附分析方法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA )技术领域。本发明涉及用于检测动物源食品、血液及尿液中残留的苯乙醇胺A的含量的酶联免疫试剂盒及使用该试剂盒的检测方法。
背景技术：
苯乙醇胺A(Phenylethylamine, PEA)又称为克伦巴胺,学名为2_[4_ (4_硝基苯基)丁基-2-基氨基]-I-甲氧基苯乙醇，是一种人工合成的化学物质。化学结构式如下
权利要求
1.一种检测残留苯乙醇胺A的酶联免疫试剂盒，其特征在于包括酶标板96孔、苯乙醇胺A标准品工作液、苯乙醇胺A抗体工作液、苯乙醇胺A酶标二抗工作液、底物液、终止液、浓缩洗涤液和浓缩样品稀释液； 其中，所述酶标板是包被苯乙醇胺A抗原的酶标板，苯乙醇胺A抗原是用0.05 mo I/LpH 9. 6的碳酸盐包被缓冲液稀释成1:8000比例，100微 L/孔，37°C，2h，取出4°C放置过夜；取出酶标板甩掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300微 L/孔，洗板3次，Imin/次；然后加入O. 5% BSA封闭，150微 L/孔，37°C放置2h;取出酶标板甩掉板内液体，用洁净的毛巾包裹后拍干板内残留液体；将拍干后的酶标板整齐地摆放置GMP车间恒温25°C晾干；抽检要求板内孔与孔之间，板间的OD值变异系数均小于10% ;检验合格后将酶标板密封后置4°C下保存； 其中，所述苯乙醇胺A标准品的浓度分别为O ng/mL、0. I ng/mL、0. 3 ng/mL、0. 9 ng/mL、2. 7 ng/mL、8. I ng/mL ； 其中，所述苯乙醇胺A抗体工作液是用抗体稀释液稀释成1:10000比例； 所述苯乙醇胺A酶标二抗工作液是用酶标二抗稀释液稀释成1:2000比例； 所述底物液包含O. 05 mo I/L的NaHPO4 · 12Η20、0· 025 mo I/L的一水柠檬酸(C6H8O7 ·Η20)、0· 2 mmol/L的3, 3, 5, 5-四甲基联苯胺_、0· 5 mmol/L的过氧化氢脲和5%的N, N-二甲基甲酰胺； 所述终止液是2 mol/L的硫酸(H2SO4)； 所述浓缩洗涤液是20倍浓缩洗涤液，其包含0. 05%吐温-20，0. 01 mol/L的PBST，pH值范围7. 0-7. 5之间； 所述浓缩样品稀释液是2倍浓缩稀释液，其成分为0. 01 mol/L, pH7. 4磷酸盐PBS缓冲液。
2.权利要求I所述检测残留苯乙醇胺A的酶联免疫试剂盒的使用方法，其特征在于该方法包括以下步骤 (1)预处理待测样品，即将待测试的样品处理为液体样品，或者用有机溶剂提取待测样品，氮气吹干并将其复溶于样品稀释液工作液中； (2)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温20 25°C平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀； (3)取包被苯乙醇胺A抗原的酶标板，加标准品/样本50mL/孔到对应的微孔中； (4)加入苯乙醇胺A抗体工作液，50mL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应30 min ； (5)小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250mL/孔，充分洗涤4飞次，每次间隔10 S，用吸水纸拍干，拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破； (6)加入苯乙醇胺A酶标二抗100mL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应30 min，取出重复洗板步骤(5); (7)加入底物液100mL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应.15 20 min ； (8)加入终止液50mL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处或双波长450/630nm检测,测定每孔吸光度值,在5min内读完数据； (9)以标准品测试的吸光度值与标准品的浓度对数值绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中苯乙醇胺A的含量。
3.根据权利要求2所述检测残留苯乙醇胺A的酶联免疫试剂盒的使用方法，其特征在于其中在步骤(3)中，苯乙醇胺A标准品和处理好的样品同时添加到对应微孔中。
4.根据权利要求2所述检测残留苯乙醇胺A的酶联免疫试剂盒的使用方法，其特征在于其中所述处理后的样品是经过以下处理的样品 尿样取待检尿样，若样品比较混池时，可5000 r/min以上,离心5 min或过滤。
5.根据权利要求2所述检测残留苯乙醇胺A的酶联免疫试剂盒的使用方法，其特征在于其中所述处理后的样品是经过以下处理的样品 血清取待检血清样，若样品比较混池时，可5000 r/min以上,离心5 min或过滤。
6.根据权利要求2所述检测残留苯乙醇胺A的酶联免疫试剂盒的使用方法，其特征在于其中所述处理后的样品是经过以下处理的样品 对于猪肉、猪肝 准确称取2. 0±0. 05 g匀浆样品至50 mL离心管中； 先加入3%三氯乙酸4 mL，用涡旋仪涡动至均匀后再加入2mL乙腈并充分振荡摇匀；4000 r/min 离心 10 min ； 取上清液3mL至另一离心管中，向其内加入I 11101/1似20)3溶液400 mL，并混匀调节pH值至 9. 8±0. 2 ； 加入5 mL乙酸乙酯,振荡30 s, 4000 r/min离心5 10 min ;取3 mL上层液体于50 60°C氮气流下吹干； 加入I mL稀释后的样品稀释液并充分振荡摇匀； 取50 mL用于分析。
7.根据权利要求6所述检测残留苯乙醇胺A的酶联免疫试剂盒的使用方法，其特征在于其中的样品稀释液用去离子水将苯乙醇胺A浓缩样品稀释液按I: I体积比进行稀释，即I份苯乙醇胺A浓缩样品稀释液+1份去离子水。
全文摘要
本发明公开了检测残留苯乙醇胺A的酶联免疫试剂盒及其使用方法，属于酶联免疫吸附分析方法技术领域。所述试剂盒包括包被苯乙醇胺A抗原的酶标板、苯乙醇胺A标准品工作液、苯乙醇胺A抗体工作液、苯乙醇胺A酶标二抗工作液、底物液、终止液、浓缩洗涤液和浓缩样品稀释液。本发明的试剂盒采用间接竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)方法，标准品或待测样本残留的苯乙醇胺A和酶标板上预包被的抗原共同竞争苯乙醇胺A抗体。该方法可以用于直接检测动物源性食品、尿样、动物组织和血清样品中的苯乙醇胺A，具有方便、快速、灵敏等特点，适用于大批量样品检测，本试剂盒灵敏度0.1ng/mL。
文档编号G01N33/544GK102901813SQ201210368968
公开日2013年1月30日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年9月27日
发明者杜道林, 洪霞, 张祯, 薛永来 申请人:江苏维赛科技生物发展有限公司