专利名称：γ-氨基丁酸酶联免疫吸附测定试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型属于涉及生物技术领域，具体而言，涉及Y-氨基丁酸酶联免疫吸附测定试剂盒。
背景技术：
Y-氨基丁酸，Y -aminobutyric acid (GABA),化学名称4_ 氨基丁酸，别名:Y-氨基丁酸，氨酪酸，哌啶酸。广泛分布于动植物体内。Y-氨基丁酸是为哺乳动物中枢神经系统中很重要的抑制性神经递质，它是一种天然存在的非蛋白组成氨基酸，它参与多种代谢活动，具有很高的生理活性，它能促进脑的活化性，镇静神经，抗焦虑，健脑益智，治癫痫，抗哮喘，促进睡眠，美容润肤，延缓脑衰老机能，能补充人体抑制性神经递质，具有良好的降血压功效。促进肾机能改善和保护作用。抑制脂肪肝及肥胖症，活化肝功能。在医学上，Y-氨基丁酸可作为诊断酶用于糖尿病的检验以及诊疗型酶制剂。 目前国际已报道的GABA定量测定方法主要有氨基酸分析仪测定法(aminoacid analyzer, AAA)、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)、薄层扫描法(thin layer chromatography scanning, TLCS)、纸层析法(Paper chromatography)、突光分光光度法(Fluorospectrophotometry)、放射性受体法(Radioreceptorassay, RRA)和基于Berthelot反应的比色法、酶联免疫分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。氨基酸分析仪测定法(amino acid analyzer, AAA)方法简单、单样成本低、干扰少、稳定性好，但需要昂贵的仪器设备。高效液相色谱法(highperformance liquid chromatography,HPLC)具有灵敏度高、准确性和重复性好等优势，但需要昂贵的仪器设备，而且检测过程繁琐、样本前处理的技术要求很高，难于操作。检测人员需要具备专业的检测技能和丰富的实验经验。薄层扫描法(thinlayer chromatography scanning,TLCS)易受环境因素影响。纸层析法(Paper chromatography)简便易行,耗费低,但操作起来比较繁琐费时、灵敏度和重现性都差，不易采用。突光分光光度法(Fluorospectrophotometry)灵敏度较低且干扰因素较多。放射性受体法(Radioreceptor assay, RRA)不够稳定，结果重复性也差。基于Berthelot反应的比色法,分析试剂较为便宜，分析成本较低，方法快捷,但在测定中次氯酸钠溶液的使用量是测定结果的主要影响因素，同时色泽的稳定性对测定结果具有较大的影响。而浓度和温度又是色泽稳定性的两个较大影响因素。所测定的结果波动性比较大，实验误差大。酶联免疫分析法(Enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)利用抗原-抗体之间特异性的免疫反应识别生物液体中的靶分子，并利用酶-底物的显色反应定量的反应待测样本中靶分子的含量。由于其特异性强、灵敏度、操作简便及不需大型仪器等优点，现广泛用于生物样本的定量检测实验中。[0012]因此，有必要选用一种快速、简便能够定量且灵敏度、准确度和特异性高的方法来进行Y-氨基丁酸的检测。
实用新型内容本实用新型目的是Y-氨基丁酸酶联免疫吸附测定试剂盒，其操作简便，成本低，稳定性好，可以满足普通实验室的要求。为了实现本实用新型的目的，拟采用如下技术方案本实用新型一方面涉及一种Y-氨基丁酸酶联免疫吸附测定试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体和包被层，其特征在于所述固相载体上设置有多个微孔，所述包被层附着在所述固相载体的微孔表面，所述包被层是由抗Y-氨基丁酸抗体和牛血清白蛋白依次涂布在所述固相载体的微孔表面上形成的复合层。在本实用新型的一个优选实施方式中，所述的多个微孔是指96个微孔。在本实用新型的一个优选实施方式中，所述的固相载体是聚苯乙烯酶标板。本专利通过高效的偶联方法的得到稳定性好的Y-氨基乙酸-戊二醛-BSA，并通过免疫动物得到特异性高及亲和力强的抗体，用来制备Y-氨基丁酸酶联免疫吸附测定试剂盒。通过与HPLC法的比较，其精密度、回收率、准确性和批量检测样本等方面均优于HPLC法。ELISA法比HPLC法样品前处理简单得多，特异性好，无需纯化浓缩。另外，ELISA法比HPLC法操作时间短，一次可处理大量样品，节约了大量的人力、物力，提高了工作效率。而且，ELISA法比HPLC法投资小，仪器的使用不需要专业培训技术人员，更适合基层单位使用。
图I为本实用新型一具体实施例酶标板结构示意图。I固相载体，2微孔,3包被层。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本实用新型作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本实用新型并能予以实施，但所举实施例不作为对本实用新型的限定。如图I所示，本实用新型试剂盒的酶标板，其包括固相载体I和包被层3，固相载体
I采用96孔聚苯乙烯酶标板。固相载体I上有多个微孔2，包被层3附着在固相载体上的微孔2上。包被层3是包括抗Y-氨基丁酸抗体和牛血清白蛋白的复合层。本试剂盒应用竞争抑制酶联免疫分析法测定血清或血浆样本中Y -氨基丁酸的水平。制备过程如下使用96孔聚苯乙烯酶标板作为固相载体，先将其置于紫外光下辐照2小时，使酶标板活化。在酶标板微孔条上预先包被一定浓度的抗体，4°C过夜，经洗板及牛血清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板。检测时，依次加入待测标本及生物素化的Y-氨基丁酸，形成待测标本中的Y-氨基丁酸和生物素化的Y-氨基丁酸竞争结合酶标板上包被的抗体的局面，再通过亲和素化辣根过氧化物酶(HRP)放大信号，以3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)及硫酸分别作为底物及终止液，完成Y-氨基丁酸酶联免疫吸附测定试剂盒的制备。[0023]2、经过对Y -氨基丁酸酶联免疫吸附测定试剂盒-系列的质量指标检测，包括灵敏度、重复性、特异性、回收率及线性测定，表明该检测体系成熟，本试剂盒各项指标检测结果a.标准曲线
浓度(pg/ml) Log (浓度)标准品OD值 OD值平均值
24.691.393 1.573 1.3531.463 74.071.870 1.107 0.9391.023 222.222.347 0.692 0.5680.630 666.672.824 0.373 0.2710.322 20003.301 0.109 0.0970.103 b.灵敏度Y -氨基丁酸酶联免疫吸附测定试剂盒检测血清标本时最低检测限为9.68pg/ml ；c.回收率用同一血清样本分别添加不同量的定值标准品，作回收试验(η = 5)。平均回收率99. 56% (表2)。表2ELISA法测定Y-氨基丁酸的回收试验
定值标准品(pg/ml) 回收率(% )
—1500102. 56
—50097. 85
—15098. 26
—平均回收率99.563、发明专利技术路线I中所述的Y-氨基丁酸酶联免疫吸附测定试剂盒的研制方法，其特征在于本发明的原料的制备和试剂盒的制备方法，比常规的检测方法灵敏度更高、特异性好。技术效果我们对比了 ELISA法(本公司生产的Y _氨基丁酸酶联免疫吸附测定试剂盒)和HPLC法定量检测，可见ELISA法有操作简单、快捷、试验成本低的特点。表3ELISA法和HPLC法比较
~ELISA 法HPLC 法
I丽过程—简单—繁琐
操作时间__短(2. 5小时) 长_
人员—普通实验员专业培训技术H
样本测定数量/次多__^_
试剂)价格I低廉昂贵I.精密度实验用两法对高、中、低值质控品分别进行精密度实验，实验方法为分别用这两个试剂盒测定三个定值样本853. 6pg/ml、356. 3pg/ml、96.8pg/ml，每个样本重复测定20次，表4中结果可见ELISA法精密度较好。表4ELISA法和HPLC法精密度测试
权利要求1.Y-氨基丁酸酶联免疫吸附测定试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体和包被层，其特征在于所述固相载体上设置有多个微孔，所述包被层附着在所述固相载体的微孔表面，所述包被层是由抗Y-氨基丁酸抗体和牛血清白蛋白依次涂布在所述固相载体的微孔表面上形成的复合层。
2.根据权利要求I所述的Y-氨基丁酸酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征是所述的多个微孔是指96个微孔。
3.根据权利要求I所述的Y-氨基丁酸酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征是所述的固相载体是聚苯乙烯酶标板。
专利摘要本实用新型公开了γ-氨基丁酸酶联免疫吸附测定试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体和包被层，其特征在于所述固相载体上设置有多个微孔，所述包被层附着在所述固相载体的微孔表面，所述包被层是由抗γ-氨基丁酸抗体和牛血清白蛋白依次涂布在所述固相载体的微孔表面上形成的复合层。本实用新型的试剂盒操作简便，成本低，稳定性好，可以满足普通实验室的要求。
文档编号G01N33/545GK202710552SQ20122005908
公开日2013年1月30日 申请日期2012年2月11日 优先权日2012年2月11日
发明者杨娟, 李华渊, 童晓玲, 从旭霞, 李庆, 何峰容 申请人:武汉优尔生科技股份有限公司