专利名称：一种检测猪尿中盐酸克伦特罗的免疫胶体金试剂板的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种检测盐酸克伦特罗的试剂板，具体涉及一种检测猪尿中盐酸克伦特罗残留的免疫胶体金试剂板。
背景技术：
盐酸克伦特罗(clenbuterol，CLEN)是一种β -兴奋剂类药物，在临床上通常用来防治哮喘、肺气肿等肺部疾病。当其应用剂量达到治疗量的5-10倍时，又具有能量重新分配、改变养分代谢途径的作用，可使肌肉合成增加，脂肪沉积减少，明显促进动物生长，因此，常被用做饲料添加剂。由于用量大、使用的时间长、代谢慢，所以在动物体内的残留量很大。人类食用了残留有盐酸克伦特罗的食品动物后，会出现不同程度的中毒现象。常见有恶心、头晕、四肢无力、手颤等中毒症状，特别是对心脏病、高血压患者危害更大。长期食用则有可能导致染色体畸变，诱发恶性肿瘤，重者甚至会导致死亡。为保障畜牧业的持续健康发展和人民的身体健康，我国农业部已在176号公告《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》中将盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、西马特罗、特布他林列入了禁用清单。2002年农业部发布第193号公告，明确将克伦特罗、沙丁胺醇、西马特罗及其盐、酯及制剂列入食品动物禁用兽药。同年农业部又发布第235号公告，在所有食品动物的所有可食组织中不得检出克伦特罗、沙丁胺醇、西马特罗及其盐、酯。而欧盟在1988年就立法禁止使用盐酸克伦特罗。尽管我国明令禁止使用，然而，受经济利益驱动以及缺乏有效的监测手段，目前仍有不少养殖户违令使用兴奋剂，因此，建立科学、规范的药物残留监控方法十分必要。目前猪尿中有关盐酸克伦特罗的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS-MS)、酶联免疫吸附法(ELISA)以及近几年发展起来的胶体金免疫层析法(GICA)等。高效液相色谱法是目前国内测定β_兴奋剂类药物使用最多、也是比较权威的方法，灵敏度高、重复性强、能同时分析多种β_兴奋剂类药物。关于β_兴奋剂类药物的液相色谱分析法已有多项国家标准及行业标准发布实施，该法检出限可达O. 3 I μ g/kg(ppb)。但该法的样品前处理相对繁琐，检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多、操作时需要专门的技术人员，难以满足现代检测快速、简捷、现场化的要求，不适于大规模样本筛查。免疫分析法是将抗原抗体反应与灵敏的检测系统结合而成的一种简便、快速、敏感的分析方法，一般不需要昂贵的仪器、前处理简化、灵敏、特异性强、快速，越来越多地被用于食品中药物等残留的检测。目前，应用广泛的免疫分析方法主要是酶联免疫吸附法和胶体金免疫层析法。酶联免疫吸附法是应用抗原抗体特异性反应和酶的高效催化作用来测定β -兴奋剂类药物含量的免疫分析方法，具有特异性强、灵敏度高、快速、简便等优点。但是ELISA法中酶的活性易受反应条件影响，由此易造成测定结果重复性较差。而且需要用到昂贵的特殊仪器设备，具有一定的局限性。胶体金免疫层析法是在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术。该方法将反应所需要原料的全部或大部分整合到试剂中，可在5-10min内完成对样品中β_兴奋剂类药物的定性和半定量测定，具有简单、快速、灵敏度高等特点，无须仪器设备配合测定，检测既可在实验室中进行，也可在养殖场等进行实地测定。
实用新型内容本实用新型针对检测需求，研制开发一种检测猪尿中盐酸克伦特罗残留的免疫胶体金快速检测试剂板。本实用新型试剂板操作简便快捷，灵敏度高，特异性好，实验结果肉眼可直观判断，无需配备仪器设备，5-10min即可完成对样品中盐酸克伦特罗药物残留的测
定。 本实用新型试剂板应用层析式抗体免疫竞争原理，通过抗原和金标抗体反应显色，特异性检测猪尿中的盐酸克伦特罗药物残留水平。如果样品溶液中含有盐酸克伦特罗残留，盐酸克伦特罗先和胶体金颗粒上的抗体反应，因此当胶体金颗粒随样品溶液扩散至检测线时，胶体金颗粒上抗体的活性位点因被样品溶液中的盐酸克伦特罗药物占据而无法与检测线上盐酸克伦特罗特异性抗原结合；当样品中的盐酸克伦特罗含量超过试剂板检出限时，试剂板上的检测线无显色，判定为阳性。反之，当样品中盐酸克伦特罗含量在试剂板检出限以下或无残留时，试剂板上的检测线显色，判定为阴性。本实用新型试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，背衬上依次紧密粘贴着样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。相邻各部分间有1_2_的重叠以保证层析作用从样品垫到吸水垫部位的顺利进行。胶体金结合垫上包被有抗盐酸克伦特罗单克隆抗体与胶体金的结合物；硝酸纤维素膜上从样品垫到吸水垫方向依次包被有盐酸克伦特罗-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和控制线。偶联盐酸克伦特罗的载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(0VA)、血蓝蛋白(KLH)等。本实用新型试剂板的各部分组成成分和功能如下塑料模板，起固定背衬和标示各功能区(加样孔、检测区、控制区)的作用。背衬，由一面涂有不干胶的聚氯乙烯(PVC)材料制成，起固定支撑试剂板其他组成部分的作用。样品垫，由玻璃纤维制成，起吸收样品溶液和缓冲样品溶液pH值的作用。胶体金结合垫，由聚酯膜制成，其上有抗盐酸克伦特罗单克隆抗体与胶体金颗粒的结合物，为样品溶液中有效成分和金标抗体反应提供场所。硝酸纤维素膜，从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和控制线，将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。吸水垫，由滤纸制成，吸收反应过程中多余的溶液。本实用新型试剂板具有如下有益效果(I)特异性好。本实用新型试剂板对盐酸克伦特罗的交叉反应率为100%，对如沙丁胺醇、莱克多巴胺等β-兴奋剂类药物的交叉反应率均低于I%。可见，本实用新型试剂板对盐酸克伦特罗反应具有高度专一性。(2)灵敏度高。本实用新型试剂板对猪尿样品中盐酸克伦特罗的检出限为3. Oppb,适用于各类企业及检测机构。(3)操作简单快捷。本实用新型试剂板将反应所需的大部分原料整合到PVC背衬中，滴样后抗原抗体反应在固相膜上快速进行，大大缩短了检样时间，滴样后3-5分钟即可读取结果。本试剂板的使用不需任何专业培训，普通人员均可操作。(4)不依赖于实验设备。本实用新型试剂板在直接滴样跑板后，通过肉眼判断硝酸纤维素膜上的检测线和控制线的颜色深浅来判读结果，整个检测实施过程不依赖任何实验设备，尤其适合于野外及现场操作，易于推广。(5)成本低，易推广。本实用新型试剂板生产工艺简单，可实现单个样本检测，生产 成本低，大大降低了检测费用。
图I为盐酸克伦特罗免疫胶体金试剂板背衬结构示意图，其中I为样品垫，2为胶体金结合垫，3为硝酸纤维素膜,4为检测线,5为控制线,6为吸水垫,7为不干胶,8为PVC背衬。图2为盐酸克伦特罗免疫胶体金试剂板操作示意图，其中S为加样孔，C为控制区，T为检测区。图3为盐酸克伦特罗免疫胶体金试剂板结果判定示意图，其中C为控制区，T为检测区。
具体实施方式
本实用新型试剂板的制备包括载体蛋白偶联物的制备，抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备，胶体金溶液的制备，胶体金标记抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备和盐酸克伦特罗免疫胶体金试剂板的组装。I.半抗原与载体蛋白的偶联称取20mg盐酸克伦特罗，用2mL O. 5mol/L的硫酸溶液溶解，混匀后加入300 μ L10mg/mL的亚硝酸钠,持续反应2h。在搅拌下,将溶液逐滴加入到BSA溶液中(IOOmgBSA溶于IOmL O. lmol/L ρΗΙΟ. O的碳酸钠缓冲溶液)。混匀后，置于4°C下避光反应5h (期间可颠倒混匀)，之后用O. 01mol/LpH7. 4的PBS缓冲液透析4天，期间每间隔8h换液一次。再将溶液离心，收集上清液，-20°C下冻存备用。用卵清蛋白(OVA)替代BSA，采用同样方法制备盐酸克伦特罗半抗原-卵清蛋白偶联物。2.抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备免疫程序将合成的CLEN-BSA抗原作为免疫抗原，通过常规免疫法免疫BALB/c小鼠。首次免疫以弗氏完全佐剂乳化抗原，皮下分点注射，免疫剂量为75yg/只。以后每隔2 3周加强免疫I次，改用CLEN-BSA抗原加不完全佐剂腹腔注射，剂量为85 μ g/只，加强免疫共4次。细胞融合前3天，进行I次强化免疫，免疫剂量加倍。[0038]细胞融合取强化免疫后小鼠脾脏细胞与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞在50% PEG2000作用下按8 I的比例进行融合。将融合后的细胞悬液加到含饲养细胞的96孔细胞培养板上，在37°C、5% CO2的细胞培养箱中培养3 5d后，用HAT培养基换液I次，第10天换成HT培养基培养。阳性杂交瘤细胞筛选及克隆化细胞融合7天后，以CLEN-BSA包被酶标板，采用间接ELISA法对融合细胞分泌的抗体进行特异性筛选。对筛选为阳性的孔用有限稀释法进行克隆化扩大培养，用于腹水制备和液氮保存。腹水制备和纯化采用小鼠体内诱生腹水的方式生产盐酸克伦特罗单克隆抗体。取3月龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡，O. 5mL/只，7 10天后腹腔注射杂交瘤细胞IX 106/只,8天后抽取小鼠腹水。3.胶体金溶液的制备胶体金颗粒的平均大小为30nm，其制备方法为在IOOmL去离子水中加入ImL 1%·柠檬酸三钠，煮沸后迅速加入ImL I %氯金酸，继续煮沸lOmin，冷却后，4°C下保存备用。4.胶体金标记抗盐酸克伦特罗抗体的制备标记前将盐酸克伦特罗单抗溶液以15000r/min 4°C离心30min,取上清液；取已制备好的胶体金溶液IOOmL,用O. ImoVLK2CO3和O. lmol/L HCl将胶体金溶液的pH值调至盐酸克伦特罗单抗的等电点略偏碱(pH = pI+0. 5);边搅拌边加入O. 66mg抗盐酸克伦特罗单抗；在搅拌下加入5%的BSA使其终浓度为I %，或加入3%聚乙二醇(PEG MW20000)使其终浓度为O. 05% ；20000rpm离心15min，弃上清液；加入IOmL O. 01mol/L pH 7. 4的PBS缓冲液(含0. 4mol/L PEG20000)，20000rpm离心15min，弃上清液，如此洗涤2 4次，以彻底除去未结合的蛋白质；将沉淀用IOmL含2% BSA的PBS缓冲液(pH 7. 4,0. 01mol/L)溶解；用0. 22 μ m无菌过滤器过滤后，4°C保存备用。5.盐酸克伦特罗免疫胶体金快速检测试剂板的组装参照图1，用点膜机把适当浓度的载体蛋白偶联物及羊抗鼠IgG喷在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和控制线，37°C烘箱干燥8h。以同样方法，将制备好的胶体金标记盐酸克伦特罗单克隆抗体包被在胶体金结合垫上。试剂板组成为PVC背衬，在其上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。用切割机将贴好的大卡切割成4mm宽的条，装入塑料模板中制成试剂板，再放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。6.盐酸克伦特罗免疫胶体金试剂板检测实施操作方法6. I样品制备用干燥、洁净的离心管或适当容器采集5mL左右尿液，直接作为检测样品，如果尿样出现沉淀或浑浊物，离心后取上清液作为检测样品。6. 2检测步骤从包装袋中取出试剂板，吸取待检样品溶液100 μ L滴加到加样孔中，加样后开始计时；结果应在3 5min读取，其他时间判读无效。观察时，试剂板水平放置于观察者正面。6. 3结果判读读取结果时，将试剂板水平置于观察者正面，如图2右侧所示。[0055]阴性㈠检测线(T线)显色，表示样品中盐酸克伦特罗残留含量低于3. Oppb或不含盐酸克伦特罗残留。如图3. a所示。阳性(+):检测线(T线)无显色，表示样品中盐酸克伦特罗残留含量高于或等于3. Oppb0如图3. b所示。 无效未出现控制线(C线)，可能是操作不当或试剂板已失效。应再次阅读说明书，并用新的试剂板重新测试。如图3. c所示。
权利要求1.一种检测猪尿中盐酸克伦特罗的免疫胶体金试剂板，其特征在于试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，背衬上依次紧密粘贴的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，相邻各部分间有1_2_的重叠以保证层析作用从样品垫到吸水垫部位的顺利进行。
2.如权利要求I所述的试剂板，其特征在于试剂板的硝酸纤维素膜从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和控制线，包被有盐酸克伦特罗-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgGJf反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。
3.如权利要求I所述的试剂板，其特征在于胶体金颗粒的平均大小为30nm。
4.如权利要求I所述的试剂板，其特征在于背衬由一面涂有不干胶的聚氯乙烯材料制成，样品垫由玻璃纤维制成，胶体金结合垫由聚酯膜制成，吸水垫为滤纸。
专利摘要本实用新型涉及一种检测猪尿中盐酸克伦特罗的免疫胶体金试剂板，可用于检测猪尿中是否含有盐酸克伦特罗残留。本实用新型试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，背衬上依次紧密粘贴着样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。硝酸纤维素膜从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和控制线，可将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。该试剂板可进行半定量直观检测，整个操作过程仅需5分钟左右，且无需任何昂贵实验设备辅助，利于大规模样本筛选，适合屠宰企业及政府检测机构检测需求。
文档编号G01N33/577GK202614767SQ201220151620
公开日2012年12月19日 申请日期2012年4月6日 优先权日2012年4月6日
发明者张少恩, 桑丽雅 申请人:杭州南开日新生物技术有限公司