专利名称：检测新霉素的试纸条的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种检测新霉素的试纸条，特别是检测牛奶中新霉素的试纸条。
背景技术：
新霉素(neomycin, ΝΕΟ)属于氨基糖苷类抗生素,是由新霉胺和新霉二糖胺结合而成。新霉素作为一种常用兽药，用于抑制家畜、家禽的细菌性胃肠道感染已有30余年的历史。我国和其他一些国家还将新霉素作为饲料抗生素添加剂使用，用于预防畜禽、尤其是幼龄鸡细菌感染引起的肠炎，提高饲料利用率，促进生长。但是由于其对人和动物存在的耳毒性和肾毒性，可损害第VDI对脑神经，造成不可逆性耳聋，所以对食品中新霉素残留进行检测十分必要。我国农业部235号公告规定的新霉素最高残留限量为牛奶、羊奶500μ g/L，鸡蛋500 μ g/kg，牛、羊、猪、鸡、火鸡、鸭的肌肉、脂肪、肝500 μ g/kg，牛、羊、猪、鸡、火鸡、鸭的肾 10000 μ g/kg。·[0003]目前，检测新霉素残留的方法主要有微生物法，理化检验方法有气相色谱法、液相色谱法、离子色谱法、气相质谱联用法、液相质谱联用法及光谱法等。上述方法尽管准确度高，但均需昂贵的仪器设备，要有专业操作的人员，而且样品处理复杂，测定步骤繁琐费时，所有这些阻碍了它们在实际生产过程中的推广应用。仪器方法受限于实验室内进行，难于在基层普及与推广，更不适合于现场、野外的大规模快速检测。目前常用的免疫分析法主要为酶联免疫检测法和放射免疫分析法，需要的检测费用还是较高，不适合企业低成本的检测需要。因此，在实践中有必要建立一种敏感度高、操作简单、成本低、适合大规模推广的检测方法。
实用新型内容本实用新型的目的是提供一种新霉素试纸条，其检测快速、操作简单、不需要辅助的仪器设备、成本低、易于在基层普及与推广应用和现场快速检测。本实用新型的试纸条，包括冻干有新霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸，试纸由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，所述反应膜上具有包被有新霉素半抗原-载体蛋白偶联物的检测线印迹“ I ”和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线印迹“ I ”。检测线和质控线平行，检测线位于距离样品吸收垫一侧5-8mm处，质控线位于距离检测线4_7mm处，试纸上贴有保护膜，保护膜覆盖在样品吸收垫上，为检测端，上面印有MAX标记线，微孔试剂上具有微孔塞。为了便于运输和使用，试纸条盛装于具有密封盖的试剂桶中，试剂桶放置于具有固定用具的盒体中。本实用新型试纸条中的试纸底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；吸水垫为吸水纸；反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；保护膜为PE材质保护膜；试剂桶为塑料试剂桶；固定用具为硬质支撑材料；盒体为硬纸盒。本实用新型试纸条具有如下有益效果[0009]I、操作简便快速。传统的试纸卡检测原料奶必须将原料奶加入稀释液进行稀释才能够检测，原因是由于试纸条被紧固在壳体内，原料奶较粘稠，所以直接将原料奶在试纸卡的加样孔进行点样检测会导致由于壳体与试纸条紧密结合致使粘稠的原料奶无法完全渗透到样品吸收垫和结合物释放垫中，在试纸条上的层析速度缓慢，以至于无法检测。故只能将原料奶稀释后方可检测。使用本实用新型试纸条检测原料奶样品时，无需任何其它试剂，不需要对原料奶进行稀释，只要将待检样品溶液滴加于微孔试剂中，混匀后，室温(20-25°C)孵育5min，将试纸标有MAX标记线的一端向下，插入孵育后的微孔试剂中，室温(20-25 °C)孵育5min，观察结果。2、显示检测结果形象、直观、准确。检测试纸以显示红色线“ I ”及“ Il ”印迹作为阳性和阴性标记，即在硝酸纤维素膜上显示一条红线“ I ”印迹表示被检测样本液中新霉素的含量高于或等于试纸条对新霉素的最低检测限，两条红线“ Il ”印迹表示被检测样本中新霉素的含量低于试纸条对新霉素的最低检测限，结果判定形象、直观、准确、简单明了，不容易出现结果误判。3、成本低，投资少。使用本实用新型试纸条，不需另配仪器设备及其它试剂，使现 场检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快。4、易于大范围推广应用。试纸条操作简单，能较好满足不同层次人员的需要，如专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、食品企业等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
图I为本实用新型试纸结构示意图；图2为本实用新型试纸俯视图；图3为本实用新型微孔试剂图；图4a、4b、4c、4d为本实用新型试纸条检测结果判定图；图5为本实用新型试剂桶结构示意图；图6为本实用新型固定用具俯视图；图7为本实用新型盒体与固定用具侧视图。
具体实施方式
一、检测新霉素试纸条的组装制备(I)试纸样品吸收垫I、反应膜2、吸水垫3和保护膜7依次按顺序黏贴在所述底板6上样品吸收垫位于底板始端，吸水垫位于底板末端，样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，试纸样品吸收垫为检测端，粘贴有保护膜，保护膜上印有MAX标记线，检测线4包被有新霉素半抗原-载体蛋白偶联物，质控线5包被有羊抗鼠抗抗体。底板为PVC底板，样品吸收垫为吸滤纸或滤油纸，反应膜为硝酸纤维素膜，吸水垫为吸水纸，保护膜为PE材质保护膜。(2)微孔试剂[0025]微孔试剂8具有微孔塞9，微孔试剂中冻干有新霉素单克隆抗体-胶体金标记物。(3)将(I)试纸和(2)微孔试剂装入具有密封盖的塑料试剂桶10，将塑料试剂桶放置于盒体12内的固定用具11中。二、试纸条的使用滴加待检牛奶样品溶液200 μ I到微孔试剂中，混匀后，室温(20_25°C )孵育5min，将试纸标有MAX标记线的一端向下插入孵育后的微孔试剂中，室温(20-25 0C )孵育5min，观
察结果。三、检测结果分析新霉素在样本中的含量高于或等于试纸条对其的最低检测限时，新霉素单克隆抗体-胶体金标记物与新霉素结合，金标抗体上的抗原结合位点被封闭，从而在检测线上因为竞争反应，不会与新霉素半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。阴性样本在·检测过程中由于缺少抗原抗体竞争反应，将会在检测线和质控线上出现红色条带。如图4所示。阳性当质控线(C)显示一条红色条带，而检测线(T)不显色，试纸以显示红色线“I”，判为阳性，如图4a所示。阴性当质控线(C)显示一条红色条带，检测线(T)同时也显示出一条红色条带，试纸以显示红色线“ Il ”，判为阴性，如图4b所示。无效当质控线(C)不显示出红色条带，则无论检测线(T)显示出红色条带与否，该试纸均判为无效，如图4c、4d所示。四、检测试纸条中用到的材料制备方法I、新霉素半抗原-载体蛋白偶联物的合成与鉴定( I)新霉素半抗原的制备将O. 61g新霉素加入到三口瓶中，同时加入15ml乙醇溶解，再加入O. Ig琥珀酸酐，加热至60°C，反应2h，用薄层色谱进行跟踪监测反应程度，去除溶剂，重结晶，得到新霉素半抗原一新霉素单琥珀酸酐。(2)免疫原的制备取新霉素半抗原9 mg,溶解于I mL 二甲基甲酰胺(DMF)中，得到溶液I ;取30mg碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)用O. 2 mL水充分溶解后，加入到溶液I中，室温下搅拌24 h，得到溶液II ;称取牛血清白蛋白(BSA)50 mg，使之溶解在3. 8 mL的pH为
7.2的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，得到溶液III，将溶液II逐滴缓慢地滴加到溶液III中，并于室温下搅拌24h，再将搅拌后得到的溶液用O. 01mol/L的PBS于4°C透析3天，每天换3次透析液，最终得到新霉素免疫原。(3)包被原的制备取新霉素半抗原9 mg,溶解于I mL 二甲基甲酰胺(DMF)中，得到溶液I ;取30mg碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)用O. 2 mL水充分溶解后，加入到溶液I中，室温下搅拌24 h，得到溶液II ;称取卵清蛋白(0VA)50 mg，使之溶解在3. 8 mL的pH为7. 2的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，得到溶液III，将溶液II逐滴缓慢地滴加到溶液III中，并于室温下搅拌24h，再将搅拌后得到的溶液用O. 01mol/L的PBS于4°C透析3天，每天换3次透析液，最终得到新霉素包被原。[0042](4)新霉素半抗原-载体蛋白偶联物的鉴定将载体蛋白、新霉素半抗原、新霉素半抗原-载体蛋白偶联物用PH7. 4的PBS配成
O.5mg/ml的溶液，以O. 01mol/L ρΗ7· 4 PBS调零，用紫外分光光度计在波长20(T800nm范围内扫描，得到载体蛋白、新霉素半抗原、新霉素半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明新霉素半抗原与载体蛋白偶联成功。2、新霉素单克隆抗体的制备 ( I)动物免疫将步骤I得到的免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150 μ g/只，使其产
生抗血清。(2)细胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞,按8:1 (数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选得到稳定分泌新霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。(3)细胞冻存和复苏将杂交瘤细胞用冻存液制成5X IO6个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37 °C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。(4)单克隆抗体的制备与纯化增量培养法将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37°C条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，_20°C保存。所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20% (质量百分含量)，碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为
O.2% (质量百分含量)；所述细胞培养基的pH为7. 4。3、羊抗鼠抗抗体的制备以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。4、新霉素单克隆抗体-胶体金标记物的制备(I)胶体金的制备用双蒸去离子水将1%氯金酸(购于sigma公司，产品目录号T09041)稀释成O. 01%(质量百分含量)，取IOOml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2. 5ml 1%柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4°C保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。(2)新霉素单克隆抗体-胶体金标记物的制备在磁力搅拌下，用O. 2mol/L碳酸钾调胶体金的pH值至7. 2，按每毫升胶体金溶液中加入1(Γ20μ g的标准向胶体金溶液中加入上述新霉素单克隆抗体，搅拌混匀，室温静置IOminJPA 10%牛血清白蛋白(BSA)，使其在胶体金溶液中的终浓度为1%(体积百分含量)，静置lOmin。12000r/min，4°C离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4°C备用。 复溶缓冲液含牛血清白蛋白O. 19Γ0. 3% (体积百分含量)、吐温-80 O. 05°/Γ0· 2%(质量百分含量)、ΡΗ7. 2的O. 02mol/L磷酸盐缓冲液。[0062]5、将新霉素单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔试剂上向微孔试剂微孔板中加入50 μ I新霉素单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-50°C条件下，预冻3h后，再真空干燥15h，即可取出，得到冻干有新霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂，密封保存。6、样品吸收垫的准备将样品吸收垫置于含O. 5%牛血清白蛋白(体积百分含量)、pH7. 2,0. lmol/L磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37°C烘2h备用。7、反应膜的制备包被过程用磷酸缓冲液将新霉素-卵清蛋白偶联物稀释到1.0 mg/ml,用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T)，包被量为I. 0μ Ι/cm;用·O.01mol/L、pH7. 4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200 μ g/ml,用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(C)，包被量为1.0 μ Ι/cm。将包被好的反应膜置于37°C条件下干燥2h，备用。
权利要求1.一种检测新霉素的试纸条，其特征在于试纸条包括微孔试剂和试纸，试纸由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成。
2.如权利要求I所述的试纸条，其特征在于所述反应膜上具有包被有新霉素-载体蛋白偶联物的检测线印迹“ I ”和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线印迹“ I ”。
3.如权利要求2所述的试纸条，其特征在于所述检测线和质控线平行，均呈与试纸的长相垂直的条带状。
4.如权利要求1、2或3所述的试纸条，其特征在于所述检测线位于距离样品吸收垫一侧5-8mm处，所述质控线位于距离检测线4_7mm处。
5.如权利要求I所述的试纸条，其特征在于所述试纸上贴有保护膜，保护膜覆盖在样品吸收垫上，为检测端，上面印有MAX标记线。
6.如权利要求I所述的试纸条，其特征在于所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料，样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸，吸水垫为吸水纸，反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，保护膜为PE材质保护膜。
7.如权利要求I所述的试纸条，其特征在于所述微孔试剂上具有微孔塞。
8.如权利要求7所述的试纸条，其特征在于所述微孔试剂中冻干有新霉素单克隆抗体-胶体金标记物。
9.如权利要求I所述的试纸条，其特征在于所述试纸条盛装于具塞试剂桶中，试剂桶放置于具有固定用具的盒体中，试剂桶为塑料试剂桶，固定用具是硬质支撑材料，盒体为硬纸盒。
专利摘要本实用新型提供了一种检测新霉素的试纸条，试纸条包括微孔试剂和试纸，试纸由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，微孔试剂上冻干有新霉素单克隆抗体-胶体金标记物，反应膜上具有包被有新霉素半抗原-载体蛋白偶联物构成的检测线印迹“|”和包被有羊抗鼠抗抗体构成的质控线印迹“|”。试纸条放置于具塞试剂桶中，12个具塞试剂桶放置于具有12个孔的固定用具的盒体中。本实用新型试纸条具有便携性好、灵敏度高、检测时间短等特点，可以在新霉素残留检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/577GK202720234SQ20122038104
公开日2013年2月6日 申请日期2012年8月2日 优先权日2012年8月2日
发明者何方洋, 万宇平, 聂雯莹, 陶光灿, 罗贵昆, 刘玉梅, 何丽霞, 陈娟 申请人:北京勤邦生物技术有限公司