通过提高铁的生物利用度来预防或治疗障碍的方法及相关的药物制剂的制作方法
【专利摘要】本公开内容涉及治疗、改善或预防障碍的方法，该方法包括向对有此需要的受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含能够提高受试者中铁的生物利用度的脂质运载蛋白突变蛋白或其片段或变体。
【专利说明】通过提高铁的生物利用度来预防或治疗障碍的方法及相关的药物制剂
发明领域
[0001]本公开内容涉及治疗、改善或预防障碍的方法，该方法包括向对有此需要的受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含能够提高受试者中铁的生物利用度的脂质运载蛋白突变蛋白或其片段或变体。可以提高例如体液如血液中的铁的生物利用度。所述障碍优选地与受试者中铁的水平改变相关。在进一步的实施方案中，所述疾病或障碍包含铁动态平衡(homeostasis)的障碍或与例如体液如血液中铁水平降低相关的炎性病症。本公开内容还涉及至少一种脂质运载蛋白突变蛋白的浓缩的、稳定的药物制剂，该至少一种脂质运载蛋白突变蛋白能够提高有此需要的受试者的体液如血液中铁的生物利用度。所述浓缩的制剂可以例如适于通过许多常规递送装置如注射器进行皮下施用。另外，包含脂质运载蛋白突变蛋白的组合物可以包括大范围的延长半衰期的部分(包括基于蛋白或非蛋白的部分)中的任一种，从而在受试者中得到具有不同半衰期(药代动力学曲线)的不同组合物。
【背景技术】
[0002]通常，通过非共价相互作用的方式选择性结合至选定靶标的蛋白质作为生物技术、医药、生物分析以及生物和生命科学中的试剂扮演着重要角色。抗体，即免疫球蛋白都是这类蛋白的典型实例。尽管对这种蛋白在配体/靶点的识别、结合和/或分离中具有多方面需求，但目前使用的几乎完全是免疫球蛋白。
[0003]具有抗体样功能的另外的蛋白质性结合分子是脂质运载蛋白家族的成员，其已经自然地进化从而结合配体。脂质运载蛋白存在于许多生物体中，包括脊椎动物、昆虫、植物和细菌。脂质运载蛋白蛋白家族(Pervaiz, S., &Brew, K.(1987)FASEB J.1, 209-214)的成员通常是小的分泌蛋白且具有单一的多肽链。它们的特征在于具有一系列不同的分子识别特性:它们结合至各种(主要是)疏水分子(如类视黄醇、脂肪酸、胆固醇、前列腺素、胆绿素、信息素、促味剂和增味剂)的能力，它们结合至特异性细胞表面受体及它们大分子配合物的形成。尽管在过去主要将它们归类为转运蛋白，现在已经明确了脂质运载蛋白能够完成多种生理功能。这些功能包括在视黄醇转运、嗅觉、信息素信号传导和前列腺素的合成中的作用。脂质运载蛋白还与免疫反应的调节和细胞内动态平衡的介导有关联(例如，在Flower, D.R.(1996) Biochem.J.318, 1-14 和 Flower, D.R.等人(2000) Biochim.Biophys.Actal482, 9-24 中的综述)。
[0004]脂质运载蛋白具有特别低水平的全序列保守性，通常具有低于20%的序列同一性。与其形成强烈对比的是，它们整体折叠形式是高度保守的。脂质运载蛋白结构的中心部分由单个八股反平行β折叠组成，所述β折叠自身闭合形成连续的氢键合的β桶。该β桶形成中央腔体。桶的一个末端被穿过其底部的N端肽段以及连接β折叠股的三个肽环立体封闭。β桶的另一个末端对溶剂开放并包含由四个柔性肽环形成的靶标结合位点。正是所述环在本应刚性的脂质运载蛋白骨架中的这种多样性产生了多种不同的结合模式，每一种模式能容纳不同大小、形状和化学特征的靶标(例如在Flower，D.R.(1996),上文；Flower, D.R.et al.(2000),上文，或 Skerra, A.(2000) Biochim.Biophys.Actal482, 337-350 中的综述)。
[0005]许多PCT 公开(如 TO99/16873、TO00/75308、TO03/029463、W003/029471 和W02005/19256)都公开了如何构建各种脂质运载蛋白的突变蛋白(如NGAL脂质运载蛋白)从而针对靶标表现出与野生型脂质运载蛋白天然配体不同的高亲和力和特异性。这可以通过例如对四个肽环中的至少一个进行一个或多个氨基酸位置突变实现。此外，PCT公开W02012/022742中教导了针对铁调素的脂质运载蛋白突变蛋白的产生方法。
[0006]铁调素，是一种通常由20或25个氨基酸形成的以两种形式存在的肽激素，其主要在肝的肝细胞中产生，在铁动态平衡的调节中起到主要作用，其作为一种抗菌肽并直接或间接参与大多数铁缺乏/过载综合症的发展。铁调素的一个主要作用是内化和降解铁输出体膜铁转运蛋白(ferroportin),所述膜铁转运蛋白在所有输出铁的细胞上表达。铁调素直接结合至膜铁转运蛋白。低浓度的铁调素水平导致从巨噬细胞和肝细胞的铁释放加速。
[0007]分离、分析和量化铁调素的方法以及用于治疗与铁水平降低相关的疾病和/或病症的药剂已经被描述于国际专利申请W02008/011158、W02008/097461、W02009/094551A1、W02009/139822、W02009/058797和W02010/017070中。然而，在以前的描述中没有具有本公开内容提供的蛋白所赋有的特征的蛋白。
[0008]因此，人们希望具有涉及治疗有效量的组合物的改进的治疗方法,该组合物包含人NGAL脂质运载蛋白的至少一种突变蛋白，所述突变蛋白能够提高体液如血液中铁的生物利用度并在有此需要的受试者中表现出体内治疗活性。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1示出了以10mg/kg单剂量静脉给予(iv)的脂质运载蛋白突变蛋白的PEG化形式的二室药代动力学(PK)分析在小鼠(图1a)、大鼠(图1b)、称猴(cynomolgous monkey)(图1c)中的血浆浓度曲线和关键的药代动力学参数如分布容积Vd和清除率CJ图1d)。数据表明，脂质运载蛋白突变蛋白的PK特性可以通过如PEG的选择而改变。此外，通过小鼠、大鼠和非人灵长类动物的PK数据的异速增长比率(allometric scaling)可以推测人的PK特性如半衰期。
[0010]图2示出了在采用脂质运载蛋白突变蛋白的PEG化形式的单剂量PK研究中在小鼠、大鼠和猕猴(cyno)(图2a和2b)中获得的分布容积Vd值和清除率Q值的异速增长比率、线性回归分析的拟合优度(R2)(图2c)和PEG化的脂质运载蛋白突变蛋白的人分布容积Vd和清除率Q的换算值(图2d)。此外，消除速率常数和人半衰期是根据估算的人的Vd值和Cli值按照kel = CiZvd和t1/2 = ln2/kel计算出来的。
[0011]图3示出了基于溶液竞争ELISA的对生物素化的铁调素结合至铁调素特异性单克隆抗体的抑制(抗体12B9公开于W02008/097461，其可变的轻链和重链区分别示于SEQ IDN0:6和7)。该实验测量游离/未结合的铁调素并且是高度敏感的，因而可以在该实验中使用浓度很低的铁调素_25(25pM)。脂质运载蛋白突变蛋白的四种PEG缀合物在溶液中以皮摩尔亲和力IC50值结合铁调素-25，所述IC50值不会被不同半衰期延长形式所影响。
[0012]图4示出了根据铁调素与脂质运载蛋白突变蛋白的PEG缀合物之间的相互作用而开发的药代动力学和药效学(PK/PD)模型结构。Alf和A2f是指游离的缀合物衍生物在药代动力学模型的中央室和外周室中的量。HP是指游离铁调素在体循环中的量，HPA表示缀合物-铁调素复合物。k21、kl2和klO或一阶速率常数kin, h和kout, h是铁调素的转化速率常数。kon和koff是缀合物-铁调素复合物的形成和解离的结合常数。Vc表示缀合物在中央室的分布容积。D表示剂量。
[0013]图5示出了向猕猴(η = 3)单次静脉给予10mg/kg剂量后，连接至PEG12、PEG20、PEG30或PEG40的脂质运载蛋白突变蛋白的总(红色)的和游离(绿色)浓度的测得(记号)和模型预测(线)浓度-时间曲线。另外，示出了相应模型得到的参数。特别地，在向猕猴(η = 3)中单次静脉给予10mg/kg剂量后，连接至PEG12、PEG20、PEG30或PEG40的脂质运载蛋白突变蛋白的总(红色)的和游离(绿色)浓度的测得(记号)和模型预测(线)浓度-时间曲线示于图5a。突变蛋白PEG缀合物的药代动力学和药效学参数KoruKoff和Kout, h建立在这一分析之前测定的值的基础上。相应模型得到的参数示于图5b。
[0014]图6示出了向猕猴单次施用10mg/kg的PEG化的脂质运载蛋白突变蛋白后，总(结合的和未结合的)脂质运载蛋白突变蛋白(红色)、铁调素-突变蛋白复合物(蓝色)、游离脂质运载蛋白突变蛋白(绿色)及游离铁调素(红色)的模拟的浓度-时间曲线(nMol)。图6还示出了向猕猴单次施用10mg/kg剂量的脂质运载蛋白突变蛋白的四种PEG缀合物后，总(结合的和未结合的)缀合物(红色)、铁调素-缀合物复合物(蓝色)、游离缀合物(绿色)及游离铁调素(红色)的模拟的浓度-时间曲线(nMol)。
[0015]图7示出了向猕猴重复施用10mg/kg的PEG化的脂质运载蛋白突变蛋白后，总(结合的和未结合的)脂质运载蛋白突变蛋白(红色)、铁调素-突变蛋白复合物(蓝色)、游离脂质运载蛋白突变蛋白(绿色)及游离铁调素(红色)的模拟的浓度-时间曲线(nMol)。图7还不出了每48小时向称猴重复施用10mg/kg的脂质运载蛋白突变蛋白的两种PEG缀合物后，总(结合的和未结合的)缀合物(红色)、铁调素-缀合物复合物(蓝色)、游离缀合物(绿色)及游离铁调素(红色)的模拟的浓度-时间曲线(nMol)。
[0016]图8示出了向猕猴(η = 3)单次静脉给予10mg/kg剂量的连接至PEG12、PEG20、PEG30或PEG40的脂质运载蛋白突变蛋白的血清铁浓度随时间变化的曲线。特别地，图8示出了向猕猴(η = 3)单次静脉给予10mg/kg剂量的脂质运载蛋白突变蛋白的四种PEG缀合物的血清铁浓度随时间变化的曲线。曲线下血清铁的面积值以h* μ moIe^1标示在相应曲线下。
[0017]图9示出了脂质运载蛋白突变蛋白的三种PEG缀合物在不同摩尔浓度下的粘度。
[0018]图10示出了依赖于静脉给予连接至PEG30的脂质运载蛋白突变蛋白的猕猴(η =3)中铁应答。特别地，图10示出了在猕猴(η = 3)中单次静脉给予0.5-10mg/kg剂量的与PEG30连接的脂质运载蛋白突变蛋白或10mg/kg的与PEG40连接的亲代野生型脂质运载蛋白后，血清铁浓度随时间变化的曲线。曲线下(若有的话)血清铁的面积值以h^ymole*!/1标示在相应曲线下。
[0019]图11示出了当一次静脉或皮下(s.c.)给予大量连接至PEG30的脂质运载蛋白突变蛋白后各个猕猴中铁应答。特别地，图11示出了在猕猴中单次静脉给予20/40/80/150mg/kg剂量和单次皮下给予20mg/kg剂量的连接至PEG30的脂质运载蛋白突变蛋白后，血清铁浓度随时间变化的曲线。[0020]图12示出了当重复静脉或皮下给予大量连接至PEG30的脂质运载蛋白突变蛋白时各个猕猴中铁应答。特别地，图12示出了在分别重复(5x Q2D)静脉或皮下给予150mg/kg或20mg/kg的连接至PEG30的脂质运载蛋白突变蛋白后，血清铁浓度随时间变化的曲线(平均值+/ - SEM, η = 3，每组排除一个非应答者)。
[0021]图13示出了使用Biacore对具有SEQ ID NO:1的序列的脂质运载蛋白突变蛋白的亲和性和特异性的分析。特别地，图13示出了脂质运载蛋白突变蛋白与铁调素-25及其它相关和非相关分子的动力学参数和结合亲和力。
【具体实施方式】
[0022]本公开内容涉及治疗、改善或预防障碍的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用优选治疗有效量的能够提高受试者中铁的生物利用度的脂质运载蛋白突变蛋白或其片段或变体，所述脂质运载蛋白突变蛋白或其片段或变体优选地为药物组合物的形式。同样地，本公开内容涉及能够提高受试者中铁的生物利用度的脂质运载蛋白突变蛋白或其片段或变体，其用于治疗、改善或预防障碍的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用。在一些优选的实施方案中，将所述组合物按照一定频率施用于有此需要的受试者，所述频率例如选自:达到每日两次、达到每日一次、达到每隔一日一次、达到每隔两日一次、达到每周两次、达到每周一次和达到每隔一周一次和达到每月一次。
[0023]优选治疗、改善或预防的障碍与有此需要的受试者中铁的水平改变相关。
[0024]在相关的实施方案中，所述疾病或障碍包含铁动态平衡的障碍或与例如体液如血液中铁水平降低相关的炎性病症。
[0025]在各种优选的实施方案中，所述障碍是炎症性贫血或缺铁性贫血，优选的所述炎症性贫血是与慢性疾病贫血(ACD)或慢性障碍贫血相关。
[0026]本文提供的药物组合物包含能够提高受试者中铁的生物利用度的脂质运载蛋白突变蛋白。在一些实施方案中，本文所述能够提高受试者中铁的生物利用度的脂质运载蛋白突变蛋白是能够抑制铁调素与铁调素特异性单克隆抗体的结合的脂质运载蛋白突变蛋白(抗体12Β9公开于W02008/09746，可变轻链区和可变重链区分别示于SEQ ID NO:6和7，而在W02008/097461中12Β9的可变轻链区和可变重链区示于SEQ ID NO: 158和160)。因此推测脂质运载蛋白突变蛋白与所述单克隆抗体结合至/识别相同的表位。因此，本发明还提供一种脂质运载蛋白突变蛋白，其与12Β9抗体竞争结合至铁调素，所述12Β9抗体具有分别示于SEQ ID Ν0:6和7的可变轻链区和可变重链区。这种脂质运载蛋白突变蛋白优选地应用于本文描述的方法和用途中。在一些实施方案中，本文所述能够提高受试者中铁的生物利用度的脂质运载蛋白突变蛋白可以是人NGAL脂质运载蛋白(也称为“hNGAL”)突变蛋白，该人NGAL脂质运载蛋白突变蛋白在对应于成熟人泪脂质运载蛋白线性多肽序列的位置96、100和/或106的相应任意两个或更多个氨基酸位置具有突变的氨基酸。该脂质运载蛋白突变蛋白进一步在对应于hNGAL线性多肽序列的位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132 和 / 或 134 的任意一个或多个氨基酸位置具有突变的氨基酸。在一个特别优选的实施方案中，本文所述脂质运载蛋白突变蛋白与成熟人NGAL脂质运载蛋白序列具有至少75%的同一性。
[0027]在一些进一步的实施方案中，能够提闻受:试者中铁的生物利用度的脂质运载蛋白突变蛋白为由SEQ ID NO:1所示的脂质运载蛋白突变蛋白或其片段或变体。优选地，所述片段或变体与SEQ ID NO:1所示氨基酸具有至少75%、80%、85%、90%或95%的序列同一性或同源性。就这一点而言，W02012/022742中公开的SEQ ID NO: 1-14以引用方式全文并入本文。从而，这些脂质运载蛋白突变蛋白可以应用于本文所述方法和用途中。
[0028]在各种优选的实施方案中，将改变半衰期的部分连接至本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白是可能的，从而改变脂质运载蛋白突变蛋白的半衰期，并因此改变其药代动力学特性。一种实施这一点的方法是突变或在脂质运载蛋白突变蛋白中添加至少一个能够作为改变半衰期的部分的连接点的氨基酸残基。例如，所述方法可以是例如半胱氨酸的添加(或取代)来引入反应性基团，例如，用于缀合至其它化合物，如聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、生物素、肽或蛋白质，或用于形成非天然存在的二硫键。关于人NGAL的突变蛋白，将半胱氨酸残基引入hNGAL突变蛋白的氨基酸序列的这种突变的示例性可能性包括在对应于hNGAL野生型序列的序列位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146或158的序列位置中的至少一个处引入半胱氨酸(Cys)残基。在一些其中hNGAL突变蛋白的序列相比于SWISS-PROT/UniProt数据库登录号为P80188的序列，半胱氨酸已被另一氨基酸残基替换的实施方案中，所述相应的半胱氨酸可被重新引入所述序列。作为一个说明性实例，在这种情况下，通过恢复到最初存在于SWISS-PR0T登录号P80188序列中的半胱氨酸，可以引入氨基酸位置87处的半胱氨酸残基。在氨基酸位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146和/或158中任一处的一侧生成的硫醇部分可用于PEG化或HES化hNGAL突变蛋白，例如，以增加相应hNGAL突变蛋白的血清半衰期。
[0029]在这方面，本文提供的脂质运载蛋白突变蛋白可被修饰从而改变其在受试者中的药代动力学特性。例如，脂质运载蛋白突变蛋白的终末半衰期可包含从5千道尔顿至40千道尔顿或甚至更大的PEG部分。本文公开的药物组合物在受试者中的半衰期(经修饰以增加其半衰期)优选为至少约1、2、4、6、7、14或21天。根据实施例中进行的研究，技术人员可以在以下方面对PEG长度的影响做三角测量:(i)在动物和人中的PK特性，和(ii)药效学(PD)反应(如多长的脂质运载蛋白突变蛋白能够抑制铁调素或在给定剂量下增加血清铁及铁调素转化率)。如所述研究的数据显示，需要某个半衰期来保持受试者体内脂质运载蛋白突变蛋白的足够高的浓度，从而脂质运载蛋白突变蛋白在被清除之前，脂质运载蛋白突变蛋白将具有结合铁调素的机会。
[0030]在各种优选的实施方案中，在具有正常肾过滤的动物/人中建议使用PEG30或PEG40而非较短的PEG，因为即PEG12或PEG20的较快消除限制了其有效性及铁调素中和的持续时间。如实施例7和图8所示，PGE12缀合物导致了较低峰值的血清铁水平和较短持续时间的提高的高于基线的血清铁水平。
[0031]此外，如实施例6和图7所示，铁调素至脂质运载蛋白突变蛋白的结合促成了观测到的不含铁调素的脂质运载蛋白突变蛋白的清除率。这一过程的速度取决于(i)不同疾病中铁调素的血浆浓度(nM)和(ii)不同疾病中潜在的生产速率。在正常的动物/人中，生产速率相对高，因此不含铁调素的脂质运载蛋白突变蛋白的清除是由铁调素结合控制的，而非如通过脂质运载蛋白突变蛋白的肾过滤的清除，正如其它具有长血清半衰期的拮抗剂(如抗体)的情况。因此，在一个进一步优选的实施方案中，建议使用PEG30。一方面，低于阈值InM的血清铁调素的恒定抑制可以通过脂质运载蛋白突变蛋白-PEG30缀合物和脂质运载蛋白突变蛋白-PEG40缀合物实现，另一方面，与没有造成更多功效的缀合到PEG30的脂质运载蛋白突变蛋白相比，缀合到PEG40的脂质运载蛋白突变蛋白的重复施用会导致大约5X高的缀合物/铁调素复合物的积累。
[0032]然而，由于在不同疾病中两个变量(肾过滤和铁调素生产速率)是变化的，脂质运载蛋白突变蛋白可针对患有特定疾病的特定患者人群进行优化。例如，在患有慢性肾脏疾病(CKD)或特定癌症的患者中受损的肾脏过滤可能会降低较短PEG变体的清除速率，且在这些情况下，较短的PEG变体与公开的正常动物/人体内的PEG30或PEG40具有较相当的半衰期。因此，在各种优选的实施方案中，较短的PEG是优选的。另外，本公开内容的PEG化的脂质运载蛋白突变蛋白的粘度随PEG大小而增加。因为较短的PEG部分能够支持仍为可注射的具有较高浓度的制剂，例如，皮下注射，在各种特定的实施方案中，较短的PEG是优选的。
[0033]在各种优选的实施方案中，PK的特性，如本公开内容的包含脂质运载蛋白突变蛋白的组合物的半衰期也可通过自身延长突变蛋白的血清半衰期的蛋白而改变。例如，突变蛋白可以是缀合的或表达为融合蛋白，所述融合蛋白具有选自免疫球蛋白(immunoglubolin)的Fe部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白(immunoglubulin)的CH4结构域、白蛋白结合肽和白蛋白结合蛋白的部分。
[0034]当根据本公开内容使用时，术语“位置”是指本文描述的氨基酸序列内的氨基酸的位置或本文描述的核酸序列内的核苷酸位置。本文使用的术语“对应的”还包括不仅由前面的核苷酸/氨基酸的数量决定的位置。因此，可以被替换的根据本公开内容的给定氨基酸的位置可以由于在(突变或野生型)脂质运载蛋白中别处缺失或添加氨基酸而改变。类似地，可以被替换的根据本公开内容的给定核苷酸的位置可以由于在突变蛋白或包含启动子和/或任意其它调节序列或基因(包括外显子和内含子)的野生型脂质运载蛋白的5’-非翻译区(UTR)中别处缺失或添加核苷酸而改变。
[0035]因此，根据本公开内容在“对应的位置”下，优选地理解为核苷酸/氨基酸在所示的数字方面可以不同，但是仍然可以具有相似的邻近核苷酸/氨基酸。可以交换、缺失或添加的所述核苷酸/氨基酸也被术语“对应的位置”所包含。当本文使用“在对应于一个位置的位置处”时，在“查询”氨基酸(或核苷酸)序列中的位置是指对应于“主体”氨基酸(或核苷酸)序列中的位置。
[0036]本公开内容与本公开内容的突变蛋白联合使用的术语“片段”涉及源自N-末端和/或C-末端缩短的(即，缺少N-末端和/或C-末端氨基酸的至少一个)全长成熟人泪脂运载蛋白的蛋白质或肽。这种片段优选地包含成熟人泪脂质运载蛋白一级序列的至少10个、更优选20个、最优选30个或更多个连续氨基酸，并且在成熟人泪脂质运载蛋白的免疫测定中通常是可检测的。
[0037]本公开内容所用术语“变体”涉及包含氨基酸序列修饰的蛋白质或多肽的衍生物，例如通过置换、缺失、插入或化学修饰。优选地，这种修饰不会降低蛋白质或多肽的功能性。所述变体包括蛋白质，其中一个或多个氨基酸已被其各自的D-立体异构体或被不同于天然存在的20个氨基酸的氨基酸替换，如，例如，鸟氨酸、羟脯氨酸、瓜氨酸、高丝氨酸、羟赖氨酸、正缬氨酸。然而，这种置换也可是保守的，即一个氨基酸残基被在化学上相似的氨基酸残基替换。保守性置换的实例是下列组中成员之间的替换:1)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸；2)天冬氨酸和谷氨酸；3)天冬酰胺和谷氨酰胺；4)精氨酸和赖氨酸；5)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；6)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。
[0038]本文所用术语“人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白”或“hNGAL”或“脂质运载蛋白2”或“Lcn2”是指SWISS-PROT/UniProt数据库登录号为P80188的成熟人NGAL或示于SEQ ID NO:4的成熟人NGAL。由于1_20位氨基酸的信号肽被切掉,这一蛋白的成熟形式具有完整序列的21至198位氨基酸。所述蛋白进一步具有在成熟蛋白的位置76与175处的氨基酸残基之间形成的二硫键。
[0039]铁代谢是一系列保持铁动态平衡的化学反应。在人体内，铁存在于几乎所有的细胞中并涉及于许多重要的功能，例如，其可以以血红蛋白的形式作为将氧从肺运送至组织的载体，以细胞色素的形式作为细胞内电子的传输介质，和/或在各种组织中作为酶反应的组成部分。因此，铁的调节是人健康许多方面的重要部分。铁代谢的紊乱可导致不同的疾病，例如，贫血。
[0040]铁调素是铁动态平衡的核心负调节器。铁调素的生成随铁过载和炎症而增加，在低铁条件和低氧下减少。铁调素通过与唯一已知的哺乳动物细胞铁输出物(膜铁转运蛋白)结合发挥作用，并且诱导其内化和降解。因为膜铁转运蛋白在十二指肠的肠细胞、脾脏和肝中表达，铁调素的增加，以及随后膜铁转运蛋白的减少，导致十二指肠铁吸收的抑制、循环铁从巨噬细胞的释放和肝中铁储存的动员。铁调素被认为在炎性疾病相关性贫血的发展中发挥关键作用。急性或慢性炎性病症导致铁调素表达上调，造成缺铁，其可以引起炎性疾病相关性贫血(ACD)、癌症(AC，CIA)和慢性肾脏疾病(CKD) (CKD贫血)。
[0041]术语“铁调素”是指也被称为肝表达抗菌肽I或假定的肝肿瘤抑制剂(regressor)的蛋白，其人形式具有UniProtKB/Swiss-Prot登录号P81172。在一般基础上，术语“铁调素”指已知存在于脊椎动物物种中的铁调素蛋白的任意形式，所述脊椎动物包括哺乳动物，但是优选的是灵长类动物(如猕猴或人类)。人的未加工蛋白具有84个氨基酸的长度并且由基因“HAMP”编码，也被称为“HEPC”或“LEAP1”。其被切割成两条链，本文中也包括在术语“人铁调素”中。这两条链分别为具有氨基酸60 - 84的铁调素-25 0fepc25)和具有氨基酸65 - 84的铁调素-20(Hepc20)。铁调素-25以弯曲的发夹形式排列，通过四个二硫键稳定。天然变体也包括在术语“人铁调素”中，其具有例如氨基酸替换59R — G(VAR_0425129)；氨基酸替换70C — R(VAR_042513);氨基酸替换71G — D(VAR_026648)或氨基酸替换78C — Y(VAR_042514)。另一天然变体为铁调素_22，是铁调素-25的另一 N端截短的同种型(除了铁调素-20)。
[0042]本文所用术语“成熟的铁调素”是指任意成熟的、生物活性形式的铁调素蛋白，其在脊椎动物如哺乳动物中表达。术语“人铁调素”是指存在于人中的铁调素蛋白的任意形式。表达“铁调素-25”指具有描述于SEQ ID NO:5中的氨基酸序列的人铁调素的成熟形式。在一些实施方案中，本公开内容的一个或多个脂质运载蛋白突变蛋白能够结合人铁调素的每一给定形式，包含其蛋白水解的片段，无论相应的铁调素分子是否显示生物的/生理的活性。因此，铁调素分子可以只存在于生物样品中，而无需具有任何可测量的生理相关性。例如，到目前为止铁调素-22只有在尿液中检测到，迄今为止被认为仅仅是铁调素-25的一种尿降解产物(综述于 Kemna 等人,Haematologica.2008Jan ；93: (1)90-97)。当然，本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白也与生理活性物质如成熟的、生物活性的铁调素-25结合。因此，可以在各种制药应用中使用本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白，这取决于所选定的要识别的人铁调素的形式。
[0043]因此，根据本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白可通过阻断与铁调素受体膜铁转运蛋白的相互作用来增加体液如血液中铁的水平。结果是膜铁转运蛋白的内化和降解受到阻止。因此，所述脂质运载蛋白突变蛋白通过允许贮存铁的动员和改善的肠铁吸收而支持红细胞生成。因此，需要应用本公开内容的受试者的示例性例子是这样的受试者:所述受试者对红细胞生成刺激剂(ESA)治疗反应低(大约40-50%的患者)，这被认为是由于铁调素上调而导致用于血红蛋白合成的可用的铁减少引起的。根据本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白也可用于增加受试者如人中的网状红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白和/或血细胞比容。包含本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白的药物组合物可用于这方面。
[0044]本公开内容的另一方面涉及一种治疗受试者的方法，所述受试者患有与体液如血液中铁水平降低相关的疾病或障碍，所述方法包含向有此需要的受试者施用本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白或包含本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白的药物组合物。相应疾病或障碍可包括引起铁缺乏或过载的遗传或非遗传疾病/障碍。疾病状态或障碍可包括感染性疾病，包括如细菌、真菌、酵母或病毒。如上面已经解释的，在一些实施方案中，所述疾病或障碍是贫血，包括、但不限于，感染、炎症、慢性疾病、和/或癌症造成的贫血。在一些实施方案中，其可包括炎性疾病如关节炎和某些癌症类型、肝疾病或血液疾病。在一些实施方案中，与铁水平降低相关的疾病为贫血或慢性肾脏疾病或与慢性肾脏疾病相关的贫血。
[0045]例如，一个或多个本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白也可以用于治疗具有降低水平的铁、铁动态平衡障碍、贫血或与降低水平的铁相关的炎性病症的受试者。例如，所述受试者可为患有以下疾病的哺乳动物，如人:非洲铁过载，α地中海贫血，阿尔兹海默氏病，贫血，癌症性贫血，慢性疾病贫血，炎症性贫血，动脉硬化或动脉粥样硬化(包括冠状动脉疾病，脑血管疾病或外围闭塞性动脉疾病)，共济失调，铁关联共济失调，转铁蛋白缺乏症，癌症，血浆铜蓝蛋白缺乏，化学治疗诱导贫血，慢性肾/肾脏疾病(尤其是与慢性肾脏疾病相关的贫血)包括晚期肾疾病或慢性肾/肾脏衰竭，肝硬化，经典血色沉着病，胶原诱导性关节炎(CIA)，涉及铁调素过量(提高的铁调素)的病症，先天性异常红血球生成贫血，充血性心力衰竭，克罗恩氏病，糖尿病，铁生物分布障碍，铁动态平衡障碍，铁代谢障碍，膜铁转运蛋白疾病，膜铁转运蛋白突变血色素沉着症，叶酸缺乏，弗里德利希共济失调，缆索骨髓组织病，纤弱综合征，细菌感染如H.pyelori感染,Hallervordan Spatz疾病,血色沉着病，转铁蛋白受体2中突变造成的血色沉着病，血红蛋白病，肝炎，肝炎(Brock)，丙型肝炎，肝细胞癌，遗传性血色沉着病，病毒性感染如HIV，亨廷顿氏舞蹈病，高铁蛋白血症，底色小红细胞性贫血，血铁过少，胰岛素耐受性，缺铁性贫血，缺铁性障碍，铁过载障碍，铁调素过量的铁缺乏病症，少年血色素沉着症(HFE2)，多发性硬化，铁代谢中涉及的基因的突变(所述基因例如表达本文涉及的蛋白，如转铁蛋白受体2、HFE、铁调素调节蛋白或膜铁转运蛋白)，新生儿血色沉着症，铁相关的神经退行性疾病，骨质缺乏，骨质疏松胰腺炎，泛酸酯激酶相关神经退行性变，帕金森氏病，糙皮病，异食癖，叶啉症，迟发性皮肤卟啉病，假脑炎，肺含铁血黄素沉着症，血红细胞障碍，类风湿性关节炎,败血症,铁粒幼红细胞性贫血,系统性红斑狼疮,地中海贫血，中间型地中海贫血,输血性铁过载,肿瘤,血管炎，维生素B6缺乏，维生素B12缺乏，威尔逊氏病，或与铁水平降低相关的炎性病症。[0046]作为进一步的示例性例子，根据本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白在一些实施方案中可以用于与促红细胞生成素结合。患有癌症(AC)和/或慢性疾病(ACD)的贫血患者与高浓度铁调素(约30nmol/L)相关，导致血清铁缺乏，从而降低红细胞生成。已报道血清中基线铁调素浓度低于13nmol/L的受试者比浓度大于13nmol/L的受试者对促红细胞生成素(EPO)治疗显示出更好的应答。因此，用能够提高受试者中铁的生物利用度的脂质运载蛋白突变蛋白治疗这些患者可以提高他们对促红细胞生成素的应答。
[0047]有应用本公开内容需要的受试者可以是哺乳动物，例如人、狗、小鼠、大鼠、猪、猿如猕猴，仅举出几个示例性例子。术语“受试者”是指脊椎动物，包括哺乳动物，尤其是人(在这种情况下，也可以使用术语“患者”)。在一些实施方案中，受试者可发生障碍，其将受益于血清中铁生物活性、网织红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白和/或血细胞比容的增加。
[0048]在本公开内容的方法中可以施用于受试者的药物组合物的量应当足以使所述受试者得到满意的治疗结果(readout)。如本文所用，“满意的治疗结果”可以是下列中的一个或多个:(i)显著增加受试者中的血清铁水平，(ii)在受试者中拮抗铁调素与其受体的结合并阻断细胞的膜铁转运蛋白(FPN)的内化和降解，(iii)显著增强受试者中受铁限制的红细胞生成，(iv)显著增加受试者中的血液血红蛋白水平，(V)增强受试者对ESA的应答和(vi)降低受试者中必要的输血频率。
[0049]然而，可以施用于受试者的药物组合物的定量的数量可以跨越很宽的范围和频率。例如，施用的药物组合物的量可以低至每四周lmg/kg或高至每隔一天40mg/kg。优选地，所述每一剂量的量选自:在受试者中至少0.lmg/kg、至少lmg/kg、至少5mg/kg、至少10mg/kg、至少20mg/kg、至少40mg/kg,而施用频率可不少于选自下列的时间段的频率:每
四周、每两周、每周、一周两次、每隔一天或每天。
[0050]本公开内容还涉及在所公开的方法中使用药物组合物，所述药物组合物包含至少一种本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白或其融合蛋白或缀合物以及任选的药学上可接受的赋形剂。
[0051]在公开的方法中，药物组合物可以多种方式施用于/给药于受试者，包括通过对于蛋白质性药物是治疗有效的任何胃肠外或非-胃肠外(肠)途径。胃肠外应用方法包括，例如，皮内、皮下、肌内或静脉注射和输注技术，如以注射溶液、输注溶液或酊剂的形式。当施用是通过静脉输注时，所述药物组合物可以施用一段时间，所述一段时间选自:长达15分钟、长达30分钟、长达I小时、长达2小时和长达3小时。
[0052]因此，使用药学上可接受的成分以及已建立的制备方法(Gennaro和Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Lippincott Williams&ffilkins, Philadelphia, PA),本公开内容的一种或多种脂质运载蛋白突变蛋白可被制成组合物。为了制备所述药物组合物，可以使用药学上惰性的无机的或有机的赋形剂。
[0053]在各种优选的实施方案中，包含所述一种或多种脂质运载蛋白突变蛋白的制剂可以是高度浓缩的、稳定的包含下述物质的药物制剂:约50至350mg/ml的脂质运载蛋白突变蛋白；提供5.5至8的pH的约I至IOOmM的缓冲剂；约I至500mM的稳定剂或两种或更多种稳定剂(如，NaCl2、蔗糖、山梨糖醇或甲硫氨酸)的混合物；约0.01至0.08%的非离子表面活性剂；和有效量的至少一种透明质酸酶。[0054]本说明书的全文引用了一些参考文献。无论是在上文还是下文，本文所引用的每一文献(包括所有的专利、专利申请、科学出版物、SffISS-PROT数据库登录号、Swiss-ProtID,UniProt ID等)，都以引用的形式全文并入本文。本文的任何内容都不应解释为承认本公开内容因在先公开而无权早于所述公开。
[0055]下述非限制性实施例和附图将进一步阐明本发明的各个方面。
[0056]实施例
[0057]实施例1:小鼠、大鼠和猕猴中PEG化的抗-铁调素脂质运载蛋白突变蛋白的药代动力学(PK)参数的测定。
[0058]向小鼠、大鼠和猕猴(食蟹猕猴(Macacca fascicularis))静脉单次推注施用10mg/kg剂量且三种动物在每个采样时间点采样，测定具有SEQ ID NO:1序列的连接到PEG12、PEG20、PEG30或PEG40的hNGAL突变蛋白的主要药代动力学(PK)参数。利用在预定时间点采集的血液样品制备血浆且总的脂质运载蛋白突变蛋白的浓度通过夹心ELISA测定，该实验采用亲和性纯化的hNGAL-特异性兔抗体制备物(Pieris，PL854)作为捕获步骤和生物素化的亲和性纯化的hNGAL-特异性兔抗体制备物(Pieris，PL1047)用于结合的缀合物的检测。药代动力学的计算通过药代动力学软件程序包WinNonlinProfessionals.2 (Pharsight Corporation, USA ；2007)的方式进行。四种实验物质的平均血浆水平(算数平均数)随时间变化曲线都示于半对数图(图la、图1b和图1c)中。在静脉施用10mg/kg后通过二室模型分析计算小鼠、大鼠和猕猴中四种实验物质的主要药代动力学参数的总结示于图1d所示的表中。结果表明，脂质运载蛋白突变蛋白的PK特性可以通过PEG的选择进行调节且三个物种的PK参数如分布容积和清除率可用于通过异速增长比率(allometric scaling)预测人的半衰期。
[0059]实施例2:人PK参数。
[0060]按照实施例1中单次剂量PK研究测定，针对每一 PEG化形式的具有SEQ ID NO:1序列的脂质运载蛋白突变蛋白在小鼠、大鼠和猕猴中分布容积Vd和清除率Q实验测得值用于通过异速增长比率(allometric scaling)预测人PK参数。分布容积Vd或清除率Clj对用于研究的动物的体重以双对数标度绘图并线性回归拟合。线性回归用来推断PEG化的脂质运载蛋白突变蛋白的人分布容积Vd和清除率Q的值。此外，消除速率常数和人半衰期可以按照kel = CiZVd和t1/2 = ln2/kel计算。如图2c所示,分别地,各种PEG化形式的脂质运载蛋白突变蛋白预测的人的半衰期的范围从约5.6,17,50到298小时。
[0061]实施例3:溶液中PEG化的抗-铁调素脂质运载蛋白突变蛋白的结合亲和性测定。
[0062]为了实现定点PEG化，在具有SEQ ID NO: 2序列的hNGAL突变蛋白的位置87的丝氨酸通过定点诱变(Quick-change突变试剂盒,Stratagene)回复突变为半胱氨酸,所述半胱氨酸最初存在于hNGAL野生型中。得到在氨基酸位置87具有自由半胱氨酸残基的hNGAL突变蛋白(SEQ ID NO:1)用于被线性(如PEG12、PEG20、PEG30)或支链的(PEG40)PEG马来酰亚胺PEG化。在PEG化反应之前，自由半胱氨酸残基以脂质运载蛋白突变蛋白与TCEP摩尔比为1:1在RT下还原3小时。之后，通过用> 2摩尔过量的PEG-马来酰亚胺试剂与蛋白质在RT下混合1.5h来进行PEG化。
[0063]在溶液竞争电化学发光(ECL)检测中，具有SEQ ID NO: 2序列的hNGAL突变蛋白的结合亲和性与具有SEQ ID NO:1序列的连接至PEG12、PEG20、PEG30或PEG40的hNGAL突变蛋白的亲和性相比较。将给定摩尔浓度的包含C-末端生物素基团的铁调素-25 (25pM，铁调素-25-C-bio)用不同浓度的脂质运载蛋白突变蛋白在室温下培养30min。然后将溶液转移至涂覆本文所述(和W02008/097461中公开)的人铁调素特异性单克隆抗体12B9的ECL板上来测定溶液中游离铁调素-25-C-bio的残留浓度。12B9-结合的铁调素-25-C-bio通过处于中规模ECL平板上的链霉亲和素磺酸基标记检测试剂检测并通过铁调素-25-C-bio标准曲线确定浓度。当采用极低浓度的25pM铁调素-25时，该溶液结合实验对于区分较低PM范围的亲和性是足够敏感的。例如，该实验能够将一脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ IDNO:2)的结合亲和性与另一脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:3)的结合亲和性相区分。另夕卜，该实验允许不同高亲和性的脂质运载蛋白突变蛋白及具有不同长度PEG链的缀合物的直接比较。将该实验实施数次，平均IC50值和标准偏差列于图3。结果表明，具有SEQ IDNO:1序列的脂质运载蛋白突变蛋白可与不同尺寸的PEG通过自由半胱氨酸缀合而不会实质上影响脂质运载蛋白突变蛋白的结合亲和性。
[0064]实施例4:猕猴中抗-铁调素脂质运载蛋白突变蛋白的不含铁调素的PEG缀合物的测定。
[0065]向三个猕猴(食蟹猕猴)静脉单次推注施用10mg/kg剂量后，测定不含铁调素的PEG缀合物(具有SEQ ID NO:1序列的与PEG30连接的脂质运载蛋白突变蛋白)的血浆浓度。利用在预定时间点采集的血液样品制备血浆且不含铁调素的缀合物的浓度通过夹心ELISA测定，该实验采用由链霉亲和素固定的铁调素-25-C-bio作为捕获步骤，多克隆兔hNGAL-特异性兔抗体制备物(Pieris，PL713)用于结合的缀合物的检测。此外，总缀合物的浓度通过夹心ELISA测定，该实验采用亲和性纯化的hNGAL-特异性兔抗体制备物(Pieris，PL854)作为捕获步骤和生物素化的亲和性纯化的hNGAL-特异性兔抗体制备物(Pieris，PL1047)用于结合的缀合物的检测。在不同时间点于各个动物中测得的总缀合物及不含铁调素的缀合物的血浆浓度示于半对数图(图5a，左下方)中。总的与游离的脂质运载蛋白突变蛋白-PEG30缀合物的浓度分布比较表明，靶标的结合显著地有助于不含铁调素的缀合物的清除。基于游离脂质运载蛋白-突变蛋白-PEG30缀合物的饱和率，所述数据还可用于预测铁调素的生产速率，并为临床前及临床情况下重复剂量研究的剂量水平和给药方案的选择提供合理依据。
[0066]实施例5:PK/PD模型
[0067]根据 Xiao 等人(Pharmacokinetics of Ant1-hepcidin Monoclonal AntibodyAbl2B9m and Hepcidin in Cynomolgus Monkeys, AAPS J2010, 12(4):646-57)中描述的模型开发了铁调素与PEG缀合物之间的相互作用的PK/ro模型，所述PEG缀合物具有分别连接至PEG12、PEG20、PEG30或PEG40的SEQ ID NO:1的hNGAL突变蛋白。该模型包括缀合物的二室药代动力学模型、内源性铁调素的转换模型和缀合物与铁调素之间相互作用的可逆结合模型。所述模型的结构示于图4。由Xiao等人公开的药代动力学参数用于铁调素的转换动力学的建模。通过表面等离子体共振测定的缀合物与猕猴铁调素25之间相互作用的结合常数Kon3.74106M-ls-l、Koff2.4510_4s_l、Kd0.066nM作为模型中的附加输入。采用非线性回归分析，将所述建立的ρκ/ro模型拟合至在猕猴中实验的总缀合物浓度。在缀合物-铁调素复合物的消除途径(其中采用与对于游离蛋白相同的一阶消除速率常数)纳入后，该模型能很好地描述图5a所示的观察到的数据。通过保持kout，h的预测值和测得的铁调素基线恒定，所开发的建模方法可描述所有四种PEG缀合物的浓度-时间曲线。相应的模型导出的参数示于图5b。由于没有可得的铁调素分布容积的数据，该模型假设其与突变蛋白的Vc是相同的(类比于Xiao等人)。
[0068]实施例6:PK/PD模拟
[0069]在假设游离铁调素和铁调素复合物，这些部分二者的分布容积与游离缀合物的分布容积相同的情况下，在建立的ρκ/ro模型和模型导出的四种缀合物(具有分别连接至PEG12、PEG20、PEG30或PEG40的SEQ ID NO:1的hNGAL突变蛋白)各自的参数的基础上实施模拟来探究时程。模拟向猕猴施用每种缀合物10mg/kg后总(结合的和未结合的)缀合物(红色)、铁调素-缀合物复合物(蓝色)、游离缀合物(绿色)及游离铁调素(红色)的浓度-时间曲线(nMol)并示于图5和图6。单剂量模拟清楚地表明，游离铁调素的浓度是由可用于结合铁调素的缀合物的绝对量决定的，且游离缀合物的消除大部分由铁调素合成速率(kin，h)而不是缀合物的消除速率常数驱动的，尤其是对于那些具有较长终末半衰期的缀合物。PEG30和PEG40缀合物的曲线比较展示了 PEG40缀合物的降低的清除率且因此的较长半衰期仅延长了循环及增加了铁调素-缀合物复合物的累积，但是没有延长对铁调素的抑制时间(例如，低于InM)。如图7所示，该模型进一步预测低于阈值InM的血清铁调素的恒定抑制可以通过重复给药PEG30和PEG40缀合物实现。然而，与PEG30缀合物相t匕，PEG40缀合物的重复施用导致缀合物/铁调素复合物在稳态近5X高的积累。
[0070]实施例7:在脂质运载蛋白突变蛋白的PEG12、PEG20、PEG30和PEG40缀合物单次静脉剂量施用后，猕猴中血清铁浓度的测定。
[0071]在静脉单次推注施用10mg/kg剂量的具有SEQ ID NO:1的脂质运载蛋白突变蛋白的PEG12、PEG20、PEG30或PEG40缀合物(每一缀合物η = 3只动物)后，测定猕猴中血清铁浓度。三只动物的平均血清铁浓度相对于时间的曲线示于图8。
[0072]结果证明，单次剂量的铁调素-特异性脂质运载蛋白突变蛋白的PEG缀合物能在延长的一段时间内显著增加正常(非贫血)猕猴血液中铁的血清浓度(生物利用度)。结果进一步表明，在体内脂质运载蛋白突变蛋白通过阻止铁调素诱导的膜铁转运蛋白内化和降解有效拮抗铁调素的功能活性，并因此增强铁从铁组织贮存器中的动员(细胞的输出)。在PEG20、PEG30和PEG40缀合物中能看到类似的应答，而PEG12缀合物导致了较低峰值的血清铁水平和较短持续时间的提高的高于基线的血清水平。
[0073]实施例8:相对于赛妥珠单抗(Cimzia)的粘度，脂质运载蛋白突变蛋白的PEG20、PEG30和PEG40缀合物在不同摩尔浓度下粘度的测定。
[0074]如图9所示，采用离心柱以逐步方式浓缩缀合物且不优化制剂(pH，缓冲系统或赋形剂)，而已经被制成临床用200mg/ml的赛妥珠单抗(certolizumab pegol, UCB)用磷酸盐缓冲盐水稀释。蛋白质聚集的缺乏(<2%二聚体或聚集体)由未稀释样品的HP-SEC确证。采用 100 μ I 样品及 10-200 μ 1/min 的流速用 RheoSense m-VROC 粘度计(RheoSense)测定粘度。平均粘度值由2-3个分析运行计算得出。在观察到的赛妥珠单抗的粘度基础上，将SOmPa-s定义为粘度/可注射性阈值，该值允许使用25G1/2英寸薄管针用于皮下注射，所述赛妥珠单抗为40kDa PEG化的Fab片段，制成200mg/ml溶液用于采用25G1/2英寸薄管针用于皮下注射。结果表明，铁调素-具有SEQ ID NO:1序列的特异性突变蛋白的PEG化形式可容易地浓缩至150mg/ml以上。脂质运载蛋白突变蛋白的PEG缀合物的粘度随PEG尺寸而增加。
[0075]因此，较短的PEG部分支持具有较高浓度的制剂，所述较高浓度的制剂仍是可注射性的，例如用于皮下注射。
[0076]实施例9:依赖于静脉给药连接至PEG30的脂质运载蛋白突变蛋白的称猴(η = 3)的铁应答的测定。
[0077]在静脉单次推注施用0.5/l/3/6/10mg/kg剂量的铁调素-具有SEQ ID NO:1序列的连接至PEG30的特异性脂质运载蛋白突变蛋白(每一剂量水平η = 3只动物)后，和在静脉单次推注施用10mg/kg剂量的连接至PEG40的hNGAL(SEQ ID NO:4)后，测定猕猴中血清铁浓度。三只动物的平均血清铁水平随时间变化曲线示于图10。结果证明了关于铁动员的剂量依赖的药理活性并表明l_3mg/kg构成最小生物效应水平。
[0078]实施例10:当一次静脉或皮下给予高剂量水平的连接至PEG30的脂质运载蛋白突变蛋白后，各个猕猴中铁应答的测定。
[0079]在单次静脉输注30min20/40/80/150mg/kg的剂量后和在各个动物中皮下单次推注施用20mg/kg剂量的铁调素-具有SEQ ID NO:1序列的连接至PEG30的特异性突变蛋白后，测定猕猴中血清铁浓度。20mg/ml的标准制剂用于两种给药途径(静脉和皮下)。使用交错的方法，其中第一组动物用20mg/ml给药，然后是6天的清除时间段，之后是用SOmg/ml给药，而第二组动物用40mg/ml给药,然后是6天的清除时间段,之后是用150mg/ml给药。各个动物的铁水平随时间变化的曲线示于图U。示于图10和图11的结果表明，通过脂质运载蛋白突变蛋白的铁调素抑制诱导的高铁血症被限制在最高血清铁为65 μ M (Cmax)。在剂量水平为3-6mg/k g时，就已经达到血清铁Cmax且当采用较高的剂量10-150mg/kg血清铁Cmax不会增加。然而，即使在高剂量下铁应答仍是瞬时的和可逆的。另外，图11所示的结果表明，以至少20mg/kg的饱和剂量水平的皮下和静脉给药之间铁应答的开始、幅度和持续时间是可比较的。
[0080]实施例11:当重复静脉或皮下给药大量连接至PEG30的脂质运载蛋白突变蛋白时，各个猕猴中铁应答的测定。
[0081]在各个动物中重复静脉输注(30min)和皮下推注给药分别为150mg/kg和20mg/kg剂量的铁调素-具有SEQ ID NO:1序列的连接至PEG30的特异性突变蛋白后，测定猕猴中总的血清铁浓度。20mg/ml的标准制剂用于两种施用途径(静脉和皮下)。在按照实施例10所述单次静脉和皮下施用后至少14天的清除时间段后，每隔一天向每组的四只动物给药5次。如图12所示，在第5次剂量施用后总的血浆铁曲线(平均值+/— SD，n = 3，每组排除一个非应答者)为直到48小时的尸检。结果表明，与如图11所示的第一次给药相比，在重复给药后可观察到相似的铁应答。再次，重复施用后，总的血清铁Cmax被限制在65 μ M。此外，未出现耐受性或反调节机制来降低脂质运载蛋白突变蛋白介导的铁调素抑制的药理作用和相应的血楽 闻铁症。
[0082]实施例12:采用Biacore的脂质运载蛋白突变蛋白的特异性测量。
[0083]在动力学实验中使用表面等离子体共振测定脂质运载蛋白突变蛋白的亲和性和结合特异性。使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare, BR-1000-50)将铁调素-具有SEQ ID N0:1序列的特异性脂质运载蛋白突变蛋白和具有SEQ ID N0:4序列的hNGAL脂质运载蛋白固定于750-1100水平的共振单元(RU)，所述共振单元位于CM5传感芯片(GE Healthcare, BR-1005-30)上。采用乙醇胺将剩余的活化基团饱和。在乙醇胺(空白固定)处理后用EDC/NHS处理参比通道。将铁调素-25 (PeptaNova)、Fe-肠杆菌素(Genaxxon Bioscience, S4035.0001)、防御素(Sigma Aldrich, D9565)、VEGF8^109 (Pieris,截短的 VEGF)和 HSA (Sigma Life sciences, A1653)在 HBS-EP+缓冲液(GE Healthcare, BR-1006-69)中的稀释液施加于制备的芯片表面。下述的参数用于结合实验:接触时间60s、解离时间600s、流速30 μ L/min。所有的测定在Biacore T200仪器(GEHealthcare)于25°C下实施。固定的脂质运载蛋白突变蛋白表面的再生通过随后注射2M胍-HCl (600s)和pH为2.0的IOmM甘氨酸-HCl (210s)实现，然后使用运行缓冲液的额外洗涤及210s的稳定期。为了调节的目的，在蛋白质测定之前实施三启动循环。数据用BiacoreT200评估软件(V1.0)进行评估。使用双重参考。1:1的结合模型用于拟合原始数据。对于所有靶标没有检测到与参比通道的结合。图13a示出了脂质运载蛋白突变蛋白以皮摩尔亲和性结合铁调素-25，而其对其它被测定的分析物并没有表现出任何可测量的亲和性。如图13b所示，当以相同的实验形式测试时，与铁调素-25相比，脂质运载蛋白突变蛋白对猕猴铁调素25的亲和性是相同的，包括相同的Km和Ktjff速率。选择细菌的含铁细胞Fe-肠杆菌素用于这一分析中，因为其组成脂质运载蛋白的天然配体中的一个，其中脂质运载蛋白突变蛋白源自所述脂质运载蛋白。选择哺乳动物的抗菌的36个氨基酸肽β-防御素用于这一分析，因为其表现出一些与铁调素的结构相似性，即3个二硫键、反向平行β折叠和β转角，尽管序列同一性非常低即24%。HSA和VEGF用作非相关蛋白的例子。与脂质运载蛋白突变蛋白相比，以相同方式固定于CM5芯片上的hNGAL脂质运载蛋白用作Fe-肠杆菌素分析物的阳性对照。如文献中所述，hNGAL脂质运载蛋白以亚纳摩尔亲和性结合Fe-肠杆菌素，然而没有结合任何其它的 分析物包括铁调素。
[0084]本发明在治疗与铁水平下降有关的疾病和/或病症方面有工业应用。本文示例性描述的发明可以在任何未在本文具体公开的元素、限制不存在的情况下适当地进行实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应该广泛地理解而无限制。并且，本文采用的术语和表达方式用作描述性的而非限制性的术语，并且无意使用排除所示和所描述特征或其部分的任何等同方式的此类术语和表达方式，但是应理解，在本发明要求保护的范围内，多种修饰方式是可行的。因此，应该理解，尽管本发明已经通过优选的实施方案和任选特征予以具体公开，但是本领域技术人员可以寻求本文在此公开的实施发明的修饰和改变，并且认为此类修改和改变在本发明的范围内。本文已经广泛和通用地描述了本发明。本文所述的所有的专利、专利申请、教科书及经同行审查的公开文献都以引用的方式全文并入本文。另外，当通过引用方式结合在本文的参考文献中定义的或使用的术语与本文所提供的术语的定义相反或不一致时，应用本文提供的术语的定义而不应用该术语在参考文献中的定义。落在通用公开内容之内的每个较窄种类和亚类集合也形成本发明的一部分。这包括具有从该通类去除任何主题的先决或负面限制的本发明的通用描述，无论该排除的物质是否在本文具体描述。并且，在本发明的特征或方面以马库什组的方式进行描述的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明还由此以马库什组的任何单独成员或成员子集的形式进行了描述。本发明进一步的实施方式将从以下的权利要求书变得显而易见。
【权利要求】
1.一种脂质运载蛋白突变蛋白或其片段或变体，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白、片段或变体能够提高有此需要的受试者中铁的生物利用度，其用于治疗、改善或预防障碍的方法中，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的包含所述脂质运载蛋白突变蛋白、片段或变体的药物组合物的步骤，并且其中所述量足以在所述受试者中产生满意的治疗结果。
2.根据权利要求1所述的应用的脂质运载蛋白突变蛋白或其片段或变体，其中所述组合物通过胃肠外途径或非-胃肠外途径施用。
3.根据前述权利要求中任一项所述的应用的脂质运载蛋白突变蛋白或其片段或变体，其中所述组合物通过肠途径施用。
4.根据前述权利要求中任一项所述的应用的脂质运载蛋白突变蛋白或其片段或变体，其中所述组合物的施用为达到每日两次、达到每日一次、达到每隔一日一次、达到每隔两日一次、达到每周两次、达到每周一次和达到每隔一周一次和达到每月一次。
5.根据前述权利要求中任一项所述的应用的脂质运载蛋白突变蛋白或其片段或变体，其中所述组合物每次以选自下述的剂量水平向有此需要的受试者施用:0.1-lmg/kg、0.l_40mg/kg、l_20mg/kg、l-10mg/kg、3_20mg/kg 和 l_3mg/kg。
6.根据前述权利要求中任一项所述的应用的脂质运载蛋白突变蛋白或其片段或变体，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白能够抑制铁调素与铁调素特异性单克隆抗体的结合，所述铁调素特异性单克隆抗体具有示于SEQ ID No:6的可变轻链区和示于SEQ ID No:7的可变重链区。
7.根据前述权利要求中任一项所述的应用的脂质运载蛋白突变蛋白或其片段或变体，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白与抗体竞争结合至铁调素，所述抗体具有分别示于SEQ IDNO:6和7的可变轻链区和可变重链区。
8.根据前述权利要求中任一项所述的应用的脂质运载蛋白突变蛋白或其片段或变体，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白与SEQ ID NO:1具有至少75%的序列同一性或同源性。
9.根据前述权利要求中任一项所述的应用的脂质运载蛋白突变蛋白或其片段或变体，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白缀合至延长所述突变蛋白的血清半衰期的化合物。
10.根据权利要求8所述的应用的脂质运载蛋白突变蛋白或其片段或变体，其中所述延长血清半衰期的化合物选自:聚亚烷基二醇分子、羟乙基淀粉、蛋白质结构域、免疫球蛋白的Fe部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白结合肽和白蛋白结合蛋白。
11.一种缀合的脂质运载蛋白突变蛋白，其用于根据权利要求9或权利要求10中所述的任一方法中，所述缀合的脂质运载蛋白突变蛋白能够提高铁的生物利用度。
12.根据权利要求11所述的缀合的突变蛋白，其中所述聚亚烷基二醇是聚乙二醇(PEG)或其活化的衍生物。
13.根据权利要求12所述的缀合的突变蛋白，其中所述聚乙二醇(PEG)的分子量为30千道尔顿。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白或其片段或变体，其用于治疗或诊断下述的方法中:贫血、炎症性贫血、慢性炎性贫血、缺铁性贫血、铁加载贫血、败血症、遗传性血色沉着病、慢性肾脏疾病(CKD)相关贫血、癌症性贫血(AC)、化疗所致贫血(ClA)、抗ESA相关贫血、膜铁转运蛋白疾病、血色沉着症、晚期肾障碍、慢性肾脏疾病、炎症、糖尿病、类风湿性关节炎、动脉硬化、血管炎、系统性红斑狼疮和血红蛋白病。
15.一种至少一种脂质运载蛋白突变蛋白的高度浓缩的、稳定的药物制剂，所述制剂能够提高有此需要的受试者中铁的生物利用度，所述制剂包含: a.约50至350mg/ml的所述脂质运载蛋白突变蛋白； b.提供ρΗ5.5至8的约I至IOOmM的缓冲剂； c.约I至500mM的稳定剂或两种或更多种稳定剂的混合物； d.约0.01至0.08%的非离子表面活性剂；和 e.有效量的至少一种透明质酸酶。
16.根据权利要求15所述的制剂，其用于治疗障碍的方法中，所述障碍适于采用能够提高有此需要的受试者中铁的生物利用度的脂质运载蛋白突变蛋白或其片段或变体治疗，所述方法包括向所述受试者施用有效治疗所述障碍的量的步骤。
17.一种包含一个或多个小瓶的试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求15所述的制剂和用于向患者皮下施 用所述制剂的注射装置。
【文档编号】G01N33/68GK103998937SQ201280061110
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2012年12月12日 优先权日:2011年12月12日
【发明者】安德里亚斯·霍尔鲍姆, 昂德里克·伊勒, 斯蒂芬·特伦特曼, 劳伦·奥多利, 安德里亚·阿勒斯多菲尔 申请人:皮里斯股份公司