用于快速检测传染性微生物的方法和设备的制作方法

用于快速检测传染性微生物的方法和设备的制作方法
【专利摘要】微腔室阵列（220），在其中设置有单独的离子敏感场效应晶体管（ISFET）（300），用于在微阵列中监控单独的细胞活性以判断样本（390）中是否存在微生物。除了单独细胞是否存在以外，某些其他实施例预期监控细胞特性。细胞特性包括细胞活性的整个范围，以及对环境条件的变化或由于样本成分的加入引起的变化产生的细胞反应。
【专利说明】用于快速检测传染性微生物的方法和设备 相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求享受2011年12月22日申请的美国临时申请No. 61/579,365的申请 日的权益，其名称为用于快速检测传染性微生物的方法和设备，此处以参考的方式结合其 公开的内容。

【背景技术】
[0002] 由于其在医院的高发生频率和高死亡率，败血症是值得注意的医疗问题。败血症 的特征是全身炎症状态，叫做全身炎症反应综合症（SIRS)，并且存在已知的或疑似的感染。 免疫系统可能引起这种炎症性的反应，作为细菌在例如血液、尿液、肺部、皮肤、或其他组织 中的结果。败血症的主要原因之一是血流感染（BSI)。BSI最普通的是通过血培养诊断的， 其中血样本以介质在被控制为促进细菌生长的气体中进行孵化。目前的自动血培养系统会 用12-48小时来检测血液中传染性微生物的存在，并用长达5天的时间来排除所有的传染 性微生物的存在。通过再次培养（sub-culturing)血培养阳性并进行识别和抗菌剂敏感试 验来识别传染性微生物需要另一个长达12-48小时的时间。这些结果对于改变疗程可能太 晚，并导致患者的死亡。如果能将检测血液中或其他体液或组织中传染性微生物的存在的 时间缩短至少于24小时，优选少于8小时，这将会是非常有利的。从而，需要继续寻求更多 的用于检测在生物样本中是否存在传染性微生物的时效性方法和设备来确定，例如，患者 是否具有BSI。


【发明内容】

[0003]此处描述的是用于在待分析的生物样本（例如，血液）中快速检测微生物生长的 方法和设备，以确定样本中是否存在传染性微生物。在一个实施例中，具有单独的离子敏感 场效应晶体管（ISFET)的微型腔室阵列被用于确定在样本中是否存在甚至一个微生物，该 ISFET被安装于腔室的底部。除了单个的细胞是否存在以外，某些其他实施例预期监控细胞 特性。细胞特性包括细胞活性的整个范围（呼吸、生长、细胞分裂，等等），以及对环境条件 (例如，温度、PH值）的变化或由于样本成分（例如，抗生素、抗真菌剂、培养基等等）的加 入引起的变化产生的细胞反应。可使用各种已知的技术对细胞特性进行监控。例如，可以 生成微生物生长曲线并获得关于细胞反应的数据。这种曲线可以以图表表示细胞生长随时 间的变化或表示样本条件（例如，CO2浓度）值随时间的变化。由于收集（通常是实时的） 了这种数据，也能观察到生长率的变化或由于样本成分（例如，抗生素）的添加造成的细胞 代谢活性的变化。此处公开的方法和设备可被用于，尤其是，微生物检测、微生物识别，以及 微生物对环境条件或样本成分（例如，抗菌剂，如抗生素）的变化的反应的评估。
[0004] 位于单独的ISFET顶部的微型腔室具有从约1毫微微升至1毫升，优选从1微微 升至1纳升的体积范围。选择腔室的体积以确保内容物的体积足够低以能检测到样本环境 中由于腔室中存在的即使一个微生物引起的即使很小的改变（例如，pH)。腔室的形状和腔 室中的开口的形状主要是设计选择的问题。预期的是常见的形状例如，长方体形、立方体、 或圆柱体形。腔室的壁可以是垂直的、倾斜的或任何其他形状或形式。在特定的实施例中， 设计选择将决定腔室的壁是否以及以何种角度形成锥形。锥形的角度会影响腔室将单细胞 保留在腔室中的能力。孔的深度，例如从约5um至约lOOum，也可基于目标进行选择。例如， 但不局限于此，腔室的深度会使被管理的信号的来源局部化或集中化。例如，在具有相对较 小的体积的腔室被置于具有相对较大的体积的腔室的下方用于将大部分的样本（下面会 详细描述）保持特定的垂直性的实施例中，在腔室环境中需要较长时间来变化（例如，由从 细胞代谢活动产生的质子所引起的PH变化）以从传感器散开并从腔室散出，需要给予更多 的时间以检测该变化。在其他例子中，腔室的尺寸可被优化以在腔室中容纳一种、两种或更 多的微生物，增加检测的灵敏度并减少用于检测的时间。还可以选择腔室的尺寸以允许腔 室在接收微生物的同时阻止较大的哺乳动物细胞进入腔室。从而，腔室设计能提供对被感 应的细胞的类型的选择。
[0005] 在一个实施例中，设备由具有5, 000至10, 000个腔室的阵列组成。该阵列可包括 少至100个或更少的腔室，或多至10, 000, 000个或更多的腔室。阵列的尺寸主要是设计 选择的问题。虽然此处描述了典型的阵列尺寸，此处描述的实施例可以很容易地适用其它 阵列尺寸。该阵列可以是单行或多行排列。如上所述，阵列中的每个腔室包括一个单独的 ISFET，其可被，例如，置于腔室的底部。尽管此处描述的实施例中描述了ISFET被置于腔室 的底部，ISFET在腔室中的位置并不是局限性的。ISFET在腔室中的位置是设计选择的问 题。在另一个实施例中，该设备由一个具有高达10, 〇〇〇行和10, 〇〇〇列腔室，优选具有少于 500行和500列的腔室的二维阵列组成，每个腔室都具有一个单独的ISFET，该ISFET可被 装在例如腔室的下面。
[0006] 在一个实施例中，该阵列在测试前和/或后被放置并容纳于还能接收样本的壳体 中。该外壳可提供，例如，一物理结构，其能保持大的样本体积并允许样本中的生物体被导 入阵列的孔中，而不需要将样本手动地分别转移到每个孔中。此外，外壳结构主要是基于阵 列的尺寸和结构、用于将微生物导入下面的腔室的机构等等的设计选择的问题。例如，该外 壳还可额外或替换地包括电子元件，该元件能产生静电场，该静电场能将微生物导入腔室 中。该外壳还可包括产生磁场的元件。通过将微生物捆绑或以其他方式耦合至磁性或顺磁 粒子上，该磁场被用于将微生物导入腔室中。
[0007] 在一个示例中，外壳包括适于接收样本的第一端和用于将样本容纳于其中的体 积。腔室阵列被置于所述体积中，从而所接收的样本位于腔室阵列之上。每个腔室与其上 覆盖的用于接收样本的外壳体积流体连通，且在其中设置有ISFET，其中ISFET被构造为检 测样本中的变化，该变化表征样本中是否存在或响应微生物中的至少一种情况。
[0008] 应当注意的是，在某些应用中，由于元件的安排和样本中微生物的浓度，可以预期 的是，微生物通常会仅在一部分腔室中死亡。"空"的腔室接着可被用作一控件来从被监控 在腔室中微生物活性的变化的腔室中减去背景信号。
[0009] 用于ISFET制造的衬底可由硅、玻璃、陶瓷或塑料材料制成。ISFET是本领域 技术人员所公知的，因此此处不再赘述。ISFET及ISFET的制造记载于Hsiao等人的 W02010/118235,其名称为"DNACellConjugates"，Rothberg等人的美国专利No. 7948015， 其名称为"MethodsandApparatusforMeasuringAnalytesUsingLargeScaleFET Arrays，'，和Gotoh,M.，"ConstructionofAmorphousSiliconISFET，'，Sensorsand Actuators,Vol. 16,ρρ· 55-65(1989)中，这些文献在此处通过引用被结合。典型地，ISFET被构建于η-或P-型硅半导体材料上。此处公开的ISFET设备的实施例还可以经济地被构 建于玻璃基底上，更像用于驱动型现代液晶显示器中的有源矩阵薄膜晶体管（TFT)。在陶瓷 或塑料基底上构建ISFET也是可能的。
[0010] 通常，所提出的方法包括制造具有集成于腔室中的单独的ISFET的微腔室阵列， 该集成的腔室/ISFET，例如，被置于支撑基底上。该方法还包括将微腔室设置为与系统流体 连通，从而允许微生物进入单独的腔室。如上所述，腔室被设计为容纳一个微生物，或两个 或更多的微生物。用于"导入"样本中的微生物（如果存在）的机构包括，例如离心装置。 此处考虑了其他导入机构，例如向前面所述的通过静电场和/或磁场，或通过声波场、亲合 势、或重力。所选的机构会将微生物顺利导入腔室中，而不会不利于微生物的寿命。该方法 还考虑了向样本中添加生长介质，以创造用于微生物生长的条件。小部分体积允许ISFET 检测PH值或其他样本条件的即使很小的变化，该变化表示在腔室中微生物的存在和/或反 映。
[0011] 例如，对不同的介质、抗生素和/或唯一结果的酶作用物（uniquesubstrates) (即，对于特定微生物具有专一性的由酶标志的培养基）不同的微生物的反应不同且可识 另IJ。从而，监控腔室中的条件的变化能产生除了表示存在可存活的微生物的表征以外的关 于微生物特性的信息，所述变化响应于特定的添加剂表征微生物代谢活力。例如，在一个腔 室中的具有抗菌剂的样本中的变化可与另一个腔室中的不具有抗菌剂的样本中的变化进 行比较以确定腔室中的微生物对抗菌剂的敏感度。此外，基于未知的微生物如何对已知的 化合物代谢反应，样本中的未知问诶生物可被识别。本发明的一个实施例还考虑了对样本 添加放大信号检测的化合物。例如，特定的糖的代谢产生相对大量的酸和/或二氧化碳，它 的产物依次生成相匹配的较大的信号用于供ISFET检测。这种糖，此处被称为"诱导酶作用 物"，在微生物中诱导产生特定的反应，其能增强/促进检测或测量。
[0012] 如上所述，多种机构可被用于将微生物导入腔室。将微生物定位至ISFET顶部 的单独的腔室中的方法包括离心法、直接电场和电泳。替换地，固体目标，例如乳胶珠或 磁性珠，其小于ISFET顶部的腔室的尺寸，可职能化为微生物绑定配合基。然后，包含微 生物的样本与该职能化的珠子混合，且该微生物与珠子上的配合基绑定。绑定有微生物 的珠子接着通过重力或外力，例如离心力或磁场，被导入位于ISFET顶部的腔室中。附属 于珠子的配合基可从本领域技术人员所公知的非特异性微生物绑定剂，例如阿朴脂蛋白 H(apolipoproteinH)、纤连蛋白、夕卜源凝集素、和甘露糖绑定外源凝集素中选择。附属于 珠子的配合基还可以是不同的特定微生物绑定剂例如潘革兰氏阳性抗体、潘革兰氏阴性抗 体、潘酵母抗体和病原体特异性抗体的组合。

【专利附图】

【附图说明】
[0013] 图1是在此处所述的BSI检测的方法和设备所结合使用的ISFET的示意图；
[0014] 图2A是在其底部设有微型ISFET容纳腔室阵列的样本采集皿的侧视图；
[0015] 图2B是图2A的微型ISFET容纳腔室阵列的仰视图；
[0016] 图3是置于ISFET上的单独的微腔室的截面示意图；
[0017] 图4是现有技术中的另一个P-型离子敏感场效应晶体管的截面示意图。 优选实施例的详细描述
[0018]具有单独的离子敏感场效应晶体管（ISFET)的微腔室阵列被用于确定在样本中 是否存在甚至一个的微生物。ISFET被置于适合接收样本的腔室中，该样本可能包含一种或 多种微生物。ISFET被置于腔室中。在特定实施例中，ISFET被置于腔室的底部。在一个实 施例中，设备由具有5, 000至10, 000个腔室的阵列组成。该阵列可包括少至100个或更少 的腔室，或多至10, 〇〇〇, 〇〇〇个或更多的腔室。该阵列可以是单行或多行排列。如上所述， 阵列中的每个腔室包括一个单独的ISFET，例如，置于腔室的底部。在另一个实施例中，该 设备由一个具有高达10, 〇〇〇行和10, 〇〇〇列腔室，优选具有少于500行和500列的腔室的 二维阵列组成，每个腔室都具有一个单独的ISFET，该ISFET可被装在例如腔室的下面。在 一个实施例中，该阵列在测试前和/或后被放置并容纳于还能容纳样本的壳体中。该外壳 可提供，例如，一物理结构，其能保持大的样本体积并允许样本中的生物体被导入阵列的孔 中，而不需要将样本手动地分别转移到每个孔中。如上所述，该外壳可包括额外的或替换的 兀件，例如电子器件或磁体，以便向外壳的范围以及外壳中的腔室阵列提供电场或磁场。该 电场或磁场可被用于向腔室内导入微生物。此外，夕卜壳结构主要是基于阵列的尺寸和结构、 用于将微生物导入下面的腔室的机构等等的设计选择的问题。值得注意的是，在某些应用 中，由于预期安排，很有可能微生物仅在一部分腔室中死亡。
[0019]位于单个ISFET顶部的微型腔室具有从1毫微微升至1微升，优选从1微微升至 1纳升的体积范围。选择腔室的体积以确保内容物的体积足够低以能检测到样本环境中由 于腔室中存在的即使一个微生物引起的即使很小的改变（例如，pH)。腔室的形状和腔室中 的开口的形状主要是设计选择的问题。预期的是常见的形状例如，长方体形、立方体、或圆 柱体形。腔室的壁可以是垂直的、倾斜的或任何其他形状或形式。在特定的实施例中，设计 选择将决定腔室的壁是否以及以何种角度形成锥形。锥形的角度会影响腔室将单细胞保留 在腔室中的能力。孔的深度，例如从约5um至约lOOum，也可基于目标进行选择。例如，但不 局限于此，腔室的深度会使被管理的信号的来源局部化或集中化。例如，在具有相对较小的 体积的腔室被置于具有相对较大的体积的腔室的下方用于将大部分的样本（下面会详细 描述）保持特定的垂直性的实施例中，在腔室环境中需要较长时间来变化（例如，由从细胞 代谢活动产生的质子所引起的PH变化）以从传感器散开并从腔室散出，需要给予更多的时 间以检测该变化。在其他例子中，腔室的尺寸可被优化以在腔室中容纳一种、两种或更多的 微生物。控制微生物的数量能增加检测的灵敏度并减少用于检测的时间。还可以选择腔室 的尺寸以允许腔室在接收微生物的同时阻止较大的哺乳动物细胞进入腔室。这在被检测的 细胞的类型方面提供了一些选择。例如，但不局限于此，腔室可具有一约5um级的开口，这 个尺寸可在允许细菌细胞进入腔室的同时充当防止哺乳动物细胞（其为约IOum级的）进 入腔室的过滤器。
[0020] 人们认为样本（例如，血液）中的传染性微生物的浓度在该样本被从患者体内抽 出时可以低至每十毫升（ml) -个。这么低的浓度是低于目前能可靠测定样本中是否存在 微生物的界限的。因而，已知的检测方法需要使微生物的数量生长至能可靠检测的数量/ 浓度或者提高所用的传感器的灵敏度。其他的已知的检测方法使用了分子法（molecular approach),该方法也具有其缺点。使用了核苷酸引物（nucleotideprimers)和探针的分 子检测是本领域所公知的。该引物和探针与一个或多个目标微生物的DNA或RNA杂交。在 这些分子法中，微生物（或多细胞微生物的细胞）通常必然会被破坏以获得待被放大和检 测的核酸。由于这样获得的核酸的数量通常不足以获得可检测的信号，需要放大步骤（这 些步骤是与引物或其它放大试剂，例如聚合酶结合执行的）。由于这种试验是与特定目标 相关的，必然需要至少某些有关目标微生物的特性的概念，以便设计用于检测目标的引物/ 探针集（primer/probeset)。此外，分子测定不能立刻区别来自活的和死的微生物的DNA。 目前的分子方法中的这种缺点需要增加从不是源自活着的目标微生物（例如，传播病原体 DNA(circulatingpathogenDNA))样本中除去核酸的准备步骤，或者必然会做出可能是错 误的假设，即检测到的核酸表示现行感染（currentinfection)。从而这种试验是难以设 计、难以执行且缺乏精确度的。从而，不是与特定目标相关的，但是能产生关于目标的信息 的试验是非常可取的，因为它们适合于广泛部署。
[0021] 如上所述，ISFETs被用于检测离子浓度或离子浓度中或溶液中的集中度的变化。 当离子浓度（例如H+)改变时，通过晶体管的电流将随之而变。根据图1，在这样的设备中， 溶液160被作用栅电极。由于离子层，基底110和栅电极（例如氧化物）表面之间的电压 升高。由于溶液的pH值不同，栅材料160/170的Si-OH群的表面水解在水溶液中不同。典 型的栅极绝缘层材料170包括SiO2,Si3N4,Al2O3和Ta205。ISFET100还具有与掺杂硅的源 极和漏极120和130分别接触的源极和漏极150。绝缘体140被形成于ISFET上，具有用于 源极和漏极150的穿过绝缘体的接触窗。钝化层165被形成于设备上以确保时间长后设备 的完整性。
[0022] ISFET以前就已经被用于在水或食物生产中进行微生物检测。Cambiaso， A. ,etal. ,"AnH+-FET-basedsystemforon-linedetectionofmicroorganismsin waters,''SensorsandActuatorsB34pp. 245-251 (1996)论证了具有Si3N4ISFET的 流过型（flow-through)系统用于在水中在线检测大肠杆菌（E.coli)。Pourciel-Gouzy M.L. ,etal. ,"DevelopmentofpH-ΙSFETsensorsforthedetectionofbacterial activity，'，SensorsandActuatorsB103pp. 247-251 (2004)论证了对pH-ISFET传感 器的适应性改造的设想（concept)，该传感器用于检测嗜乳酸杆菌A菌（Lactobactillus acidophilus)活性，并使用 了树脂玻璃或PDMS微型水槽（microtanks)。Castellarnau,M. etal. ,Integratedcellpositioningandcell-basedISFETbiosensors,，'Sensors andActuatorsB120pp. 615-620(2007)论证了由用于细胞定位的集成电泳（DEP)电 极和ISFETs组成的基于细胞的生物传感器。Castellarnauetal.还论证了当大肠 杆菌（E.coli)通过局部DEP被置于ISFET栅极上，在添加糖后几分钟内局部pH值降 低。相反，本体溶液中通过参考ISFET或商业pH计获得的pH值是最低的。Bettaieb，F. etal.,"ImmobilizationofE.colibecteriainthree-dimensionalmatricesfor ISFETbiosensordesign"，Bioelectrochemistry71pp. 118-125(2007)描述了基于微 生物生物传感器的电化学系统，该传感器使用了大肠杆菌（E.coli)K-12衍生物作为一次 转换器检测生物活性剂。ISFET传感器被用于测量固定于琼脂糖凝胶中的细菌的pH值的 变化。至于使用pH电极的单细胞活性的测量，Ges,I.etal.，"On-chipacidification ratemeasurementsfromsinglecardiaccellsconfinedinsub-nanoliter volumes"，Biomed.MicrodeviceslOpp. 347-354(2008)描述了微流体系统，该系统用于诱 捕（trap)并测量单个心肌细胞的酸化率。在Ges等人所述的设备中，肌细胞的浓缩液通过 正压力流过具有集成的氧化铱电极传感器清洁的PDMS微流体设备中的一通道。一旦细胞 通过该传感器，如以目测确认的那样，施加负压力以停止主液流（mainsolutionflow),且 在传感器的每一端密闭机械阀以停止残余的流体并且将单细胞诱捕至传感器位置处以允 许PH测量。从而，上述参考文献都需要复杂的捕获策略，用于捕获单细胞微生物，且被局限 于他们可以从捕获的微生物收集的大量的信息中。此处所述的所有的参考文献均以结合的 方式被引用。
[0023] 如上所述，离散的ISFET被用于检测样本中大量的微生物（或样本中的变化作为 大量微生物的结果），在大体积（bulk)(毫升）样本溶液中具有通常为108cfu/ml级的微 生物浓度。此处描述的本发明的实施例在复杂的临床标本，例如血液、痰（sputum)、唾液 (saliva)、脑脊髓液、胸膜液、腹膜液和尿液需要较少的微生物来完成检测。此处描述的本 发明的实施例还能对由样本或样本条件或预定条件应用的结果中的扰动引起的微生物的 反应进行检测和动态检测。
[0024] 较小规模的ISFET技术已被用于检测并分析细胞的组成，特别是用于DNA定序。 Rothberg等人的US专利No.7, 948, 015,也通过引用被结合于此，描述了大规模的FET阵 列，该阵列监控氢离子浓度的变化以定序DNA。目标DNA被绑定在小珠子上，其有助于将DNA 放置到阵列的为空中，且不同的核苷酸基顺序流过具有DNA的珠子。绑定的事件在ISFET 上基于PH值的改变被标注，帮助用户确定目标DNA的序列。
[0025] 根据图2A-B，在一个实施例中，提供了样本采集管200。在一个实施例中，采样管 是真空的、无菌的可被离心的（centrifugable)采集管210例如BectonDickinsonand Company的BDVacutaincrli:管。微腔室220阵列被直于贴近管210的底部。在该不例性的实 施例中，ISFET230被置于每个微腔室的底部。
[0026] 根据一个实施例，血液从患者体内抽到其中包含生物-稳定和血液-溶解试剂的 管210中。在其他实施例中，样本被抽出或以其他方式获得（例如在对患者或环境样本使 用棉签的情况下）并且在被加入到管210中之前经过预备或样本处理（例如，从其他样本 组分中分离出来）。如上所述，在这种特定的实施例中，管210具有微米级尺寸的腔室220 的阵列，每个微米级尺寸的腔室在腔室底部都具有ISFET230。微腔室阵列由一基底支撑。
[0027] 在一示例性的结构中，为了将管中的任意微生物导入到微腔室中，该管可受到涡 流和旋转，例如，长达30分钟的时间内以高达12kg的相对离心力（RCF)完成对样本中人体 细胞的溶解，并将样本中的微生物向下导入至管底部的微米级尺寸的腔室的每一个中。如 本领域技术人员所知道的，密度梯度凝胶可被用于将样本中的人体细胞碎片从样本中的微 生物中分离出来。被溶解的人体细胞碎片会残留在表面，其会被丢弃。为了促进微生物新 陈代谢和生长（例如，适合于由ISFET检测的细胞分裂和其他代谢活动），在样本保留在微 米级尺寸的腔室中的部分中会加入生长介质，例如Becton,DickinsonandCompany的BD BACTEC?PlusAerobic介质。如果样本的pH值变化，ISFET会提供一信号，且该pH值的变 化等同于微腔室中的微生物的存在。
[0028] 样本的条件可被优化以便从样本矩阵回收（recover)微生物。例如，当已经以抗 菌剂处理过患者时，需要矩阵或介质将抗菌剂从微生物中分离出来。样本环境也可被控制 以促进检测。例如，样本可与能增加样本中由微生物产生的质子的成分结合。样本能与添加 剂结合，且能被施加一些条件，这些条件驱使某些微生物的选择性生长比其他的强。例如， 当样本包含非致病性基础微生物时，选择条件和培养基以帮助目标微生物的生长优于基础 微生物。在本发明的一个实施例中，由于样本中期望的小浓度微生物，相对于所有数量的 孔，微生物仅占小数量的孔。空的孔可以被用作负控制以从例如细胞碎片的材料中计算，并 减去背景信号，允许在被占用的孔中的PH值变化的检测中得到更大的灵敏度。
[0029] 参考图3-4进行解释。图3示出了一ISFET300。该ISFET被形成于玻璃基底 310上。半导体层（例如硅）340被形成于基底310上，其中形成有源极350和漏极350区 域。源极320和漏极330被形成于源极和漏极区域350上。在硅层340上形成有一层金属 氧化物360。金属氧化物的例子包括氧化铝（Al2O3)、氧化钛（Ta2O5)和氧化硅（SiO2).图4 示出了ISFET的替换的实施例，该实施例被更全面地记载于在Rothberg等人的U.S.专利 No.7, 948, 015中。
[0030] 图4示出了利用传统的CMOS(互补金属氧化物半导体的）工序制造的P-型（P-通 道）ISFET50的横截面。P-型ISFET的制造是基于P-型硅基底52的，其中形成有形成晶 体管"衬底（body) "的η-型孔54。构成ISFET的源极56和漏极58的高掺杂P-型（p+) 区域S和D被形成于η-型孔54中。高掺杂η-型（η+)区域B也被形成于η-型孔中以便 向η-型孔提供导电衬底（或"主体（bulk)"）线路62。氧化层65被置于源极、漏极和衬底 线路区域上，通过该氧化层制造开口以对这些区域提供电连接（通过电导体）；例如，经由 高导电衬底线路62,金属接点66用作导体以向漏极提供电连接，而金属接点68用作导体 以向源极56和η-型孔54提供公共连接。多晶硅栅极64被形成于氧化层上，位于η-型孔 54的区域60之上，处于源极56和漏极58之间。由于被置于多晶娃栅极64和晶体管衬底 (例如，η-型孔）之间，氧化层65经常指的是"栅极氧化物"。
[0031] 像MOSFET-样，ISFET的操作是基于由多晶硅栅极64、栅极氧化物65和η-型孔 54的处于源极和漏极之间的区域60组成的MOS(金属氧化物半导体）电容引起的电荷浓 度的调制。当跨过栅极和源极区域施加负电压（Ves〈0伏）时，"ρ-通道"63通过消耗该区 域的电子而被形成于区域60和栅极氧化物65的界面处。该P-通道63在源极和漏极之间 延伸，且当栅极-源极电势Ves负到足以将空穴从源极吸引到通道中去时，电流导通穿过该 P-通道。通道63开始导通电流时的栅极-源极电势指的是晶体管的阈值电压Vth(当Ves 具有大于阈值电压Vth的绝对值时，晶体管导通）。源极被这样称呼是因为它是流过通道63 的电荷载体（用于P-通道的空穴）的来源；类似地，漏极为电荷载体离开通道63之处。
[0032] 在图4的ISFET50中，从同时与源极56和衬底线路62相连的金属接点68来看， 经由衬底线路62,η-型孔54(晶体管衬底）被迫在与源极56相同的电势（例如，Vsb= 0 伏）处被偏置。这种连接防止了P+源极区域和η-型孔的正向偏置，从而促进了电荷载体 向区域60的范围流动的限制，该区域中可被形成有通道63。源极56和衬底/n-型孔54之 间的任何电势差（非零源极-衬底电压Vsb)根据非线性关系影响ISFET的阈值电压Vth，通 常被称作"衬底效应"，这在很多应用中是不希望有的。
[0033] 仍然如图4所示，ISFET50的多晶硅栅极64被耦合至置于附加的氧化层75的一 个或多个中的复合金属层，所述氧化层被置于栅极氧化物65之上以形成"浮置栅极"结构 70。该浮置栅极结构被这样命名是因为它与其他与ISFET相关联的导体电绝缘；S卩，它被夹 入栅极氧化物65和钝化层72之间。在该ISFET50中，钝化层72组成离子敏感膜，其增加 了设备的离子敏感度；即，在与钝化层72接触的"被分析溶液" 74 (包含感兴趣的离子的溶 液）中，尤其是浮置栅极结构70上方的敏感区域78中的离子的存在，改变了ISFET的电特 性，从而调制通过源极56和漏极58之间的P-通道63的电流。钝化层72可包含多种不同 材料中的任一个以促进对特定离子的灵敏度；例如，包括氮化硅或氮硫化硅的钝化层通常 向被分析溶液74中的氢离子（pH)提供灵敏度，尽管钝化层由包含向被分析溶液中的钾离 子浓度提供灵敏度的缬氨霉素的聚氯乙烯组成（适合于钝化层并对其他离子例如纳、银、 铁、溴、碘、钙和硝酸根敏感的材料）。
[0034] 至于离子灵敏度，通常被称作"表面电势"的电势差在钝化层72和被分析溶液74 的固/液界面处根据由于化学反应产生的敏感区域78的离子浓度而升高（例如，通常包含 由接近敏感区域78的被分析的溶液中的离子对氧化物表面群的离解作用）。该表面电势轮 流影响ISFET的阈值电压VTH;从而，ISFET的阈值电压VTH随着接近敏感区域78的被分析 的溶液74的离子浓度的变化而变化。
[0035] 仍然如图3所示，在该特定实施例中，微腔室370被形成于ISFET300上，且微腔 室370包含样本390的部分被置于ISFET300的金属氧化物区域360上方。微腔室以绝缘 材料380 (例如，氮化娃（Si3N4))形成。在这个实施例中，微腔室的容积（dimensions)为 500um3(10*10*50um)。如图3所示，H+(即质子）的产生是细胞分裂的象征。二氧化碳（CO2) 的产生也可以是细胞代谢的象征。例如，有氧呼吸的方程式为C6H1206+602- 6H20+6C02+ATP。 在其他例子中，葡萄糖的酒精发酵的方程式为C6H1206- 2C2H50H+2C02+2ATP。在另一个例子 中，乳酸发酵的方程式为C6H1206- 2CH3CH0HC00H+2ATP。当0)2在溶解于水中时，产生碳酸， 而碳酸产生相应的PH值变化。在代谢过程中或每次细胞分裂过程中产生的质子的数量或 CO2的量在微生物与微生物之间存在差异，如同细胞分裂的时间一样。微生物的存在的可靠 检测的最小阈值为少于500, 000个质子，也可以低至50, 000个质子。
[0036] 可被此处所述的设备和方法所监控的细胞的状态包括细胞活性（呼吸、生长、细 胞分裂等等），以及对环境条件（例如，温度、PH值）的变化或由于样本成分（例如，抗生 素、抗真菌剂、培养基等等）的加入引起的变化产生的细胞反应。细胞的状态可使用多种已 知的技术进行监控。例如，样本被施加使微生物在样本中生长的条件后，可监控样本在表示 微生物生长的条件方面的变化。如上所述，一种这样的条件变化可以是腔室中检测的二氧 化碳的浓度。可以基于这个数据生成微生物生长曲线。这种曲线可以以图表表示细胞生长 随时间的变化或表示样本条件（例如，CO2浓度）值随时间的变化。由于收集（通常是实时 的）了这种数据，也能观察到生长率的变化或由于样本成分（例如，抗生素）的添加造成的 细胞代谢活性的变化。此外，获得的生长曲线可与已知的微生物的一个或多个标准生长曲 线进行比较，以识别样本中的微生物。
[0037] 应当注意，此处描述的所有的或部分方法可以以手工或自动的方式进行。例如，在 被暴露到ISFET下之前对样本和/或微生物所作的准备可以通过自动的方法实现。在进行 化验分析之前的样本的准备的自动的步骤是本领域所公知的，因而此处不再赘述。此外，将 微生物附着到ISFET上也可以是自动的，作为自动样本准备的一部分或作为一个单独的步 骤。再者，在微量滴定板或其他多孔或多腔室结构中用于将样本引入微孔的自动设备是本 领域所公知的，因而此处不再赘述。更进一步，数据分析和/或整理（interpretation)可 以是自动的。这种自动设备是本领域所公知的。此处所述的一些或所有的方法也可以与其 他自动分析方法结合。
[0038] 尽管此处所述的方法通常与临床样本相关，本发明的方法和设备可结合临床或非 临床样本使用。例如，可被分析的临床样本包括在临床或研究工作实验室中典型测试的样 本的任意类型，包括，但不限于血液、血清、血浆、血液分馏物、关节液、尿液、精液、口水、粪 便、脑脊髓液、胃内容物、阴道分泌物、组织匀浆、骨髓穿刺液、骨均质、唾液、抽出物、药签和 药签冲洗液（swabrinsates)、其他体液，等等。样本可被培养并且可使用培养过的样本。 另一方面，可被测试的非临床样本包括，但不限于粮食、饮料、药物、化妆品、水（例如，饮用 水、非饮用水、和废水）、海水压舱物、空气、土壤、污水、植物物质（例如，种子、叶子、茎干、 根、花、果实）、血液制品（例如，血小板、血清、血浆、白血球分馏物，等等），捐赠的器官或组 织样本、生物战样本、果汁、肉汁或洗涤物、和洗发精以及其他消费品。
[0039] 尽管此处已经根据特定的实施例描述了本发明，应当理解这些实施例仅仅是对本 发明的原理和应用进行了示例。从而应当理解对这些示例性的实施例可以作出许多修改且 可以设计出其他设备而不脱离由所附的权利要求限定的本发明的精神和范围。 工业实用性
[0040] 本发明可被用于微生物检测设备，其中，例如，具有包括ISFET的腔室的阵列的采 样管被用于确定在样本中是否存在微生物。
[0049] 本说明书中所述的只是本发明的较佳具体实施例，以上实施例仅用以说明本发明 的技术方案而非对本发明的限制。凡本领域技术人员依本发明的构思通过逻辑分析、推理 或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在本发明的范围之内。
【权利要求】
1. 用于在样本中确定微生物的存在的设备，该设备包含： 外壳，包括适于接收样本的第一端和用于将样本容纳于其中的体积；和 腔室阵列，被置于所述体积中，从而所接收的样本位于腔室阵列之上，每个腔室与其上 覆盖的用于接收样本的外壳体积流体连通，且在其中设置有离子敏感场效应晶体管，其中 离子敏感场效应晶体管被构造为检测样本中的变化，该变化表征样本中是否存在或响应微 生物中的至少一种情况。
2. 根据权利要求1的设备，其中外壳为可离心的采集管，且其中腔室阵列被贴近采集 管的底部设置。
3. 根据权利要求1的设备，还包括电子器件，配置来向所述体积和置于其中的腔室阵 列提供静电场。
4. 根据权利要求1的设备，还包括磁性元件，配置来向所述体积和置于其中的腔室阵 列提供磁场。
5. 根据权利要求1的设备，其中至少一部分腔室具有在约5um至约10um之间的开口， 用于接收被引入到体积中的样本。
6. 根据权利要求1的设备，其中至少一部分腔室具有在约5um至约10um之间的高度。
7. 用于在样本中确定微生物的存在的方法，包括： 将样本引入到其中设置有腔室阵列的外壳的体积中； 向样本施加条件，该条件引起样本中的至少部分微生物流入到外壳中的至少部分腔室 中，其中至少部分腔室中设置有离子敏感场效应晶体管；和 检测样本中的变化，该变化表征是否存在或响应于微生物中的至少一种情况。
8. 根据权利要求7的方法，其中通过离心法使微生物流向外壳中的腔室阵列，且其中 腔室阵列被置于外壳的底部。
9. 根据权利要求7的方法，其中通过向样本施加电场使微生物流向腔室阵列。
10. 根据权利要求7的方法，其中通过向样本中引入磁性粒子或顺磁粒子使微生物流 向外壳中的腔室阵列，所述磁性或顺磁粒子被配置向其为吸引并捆绑微生物，并在样本中 对样本施加磁场。
11. 根据权利要求7的方法，还包括： 向至少部分腔室添加抗菌试剂； 通过将在包含抗菌试剂的第一腔室中测得的样本的变化与在不包含抗菌试剂的第二 腔室中测得的样本的变化进行对比，确定微生物对该抗菌试剂的灵敏度。
12. 根据权利要求7的方法，还包括： 向样本施加条件，该条件使微生物生长； 监控样本在条件下的表征微生物生长的变化；和 基于样本条件中的变化生成微生物的生长曲线。
13. 根据权利要求12的方法，还包括通过将生成的微生物的生长曲线与已知的微生物 的一个或多个标准生长曲线进行对比以确定微生物的特性。
14. 根据权利要求13的方法，其中生成微生物的生长曲线包括监控细胞随着时间的变 化。
15. 根据权利要求13的方法，其中生成微生物的生长曲线包括监控样本条件值随时间 的变化。
16. 根据权利要求15的方法，其中样本条件为二氧化碳浓度。
17. 根据权利要求12的方法，其中那个生长曲线为实时生成的。
18. 根据权利要求17的方法，还包括： 向样本中添加组分； 确定响应于添加的组分的生长曲线的变化。
19. 根据权利要求18的方法，其中该组分为抗生素。
20. 根据权利要求18的方法，其中该组分为抗真菌剂。
21. 根据权利要求18的方法，其中该组分为微生物培养基。
【文档编号】G01N27/414GK104487834SQ201280069701
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2012年12月19日 优先权日:2011年12月22日
【发明者】石松庆, 詹姆斯.G.纳多, A. 布拉施 迈克尔 申请人:Bd公司