用于检测生物样品中病原体的方法和系统的制作方法
【专利摘要】本文中公开了，除了其他以外，用于检测身体样品中病原体感染的方法、试剂盒和系统，该方法包括(i)用两种或更多种染料染色所述身体样品，所述两种或更多种染料包括主要染色DNA的至少一种染料以由此提供DNA和不同于DNA的至少一种其他细胞组分之间的差别染色；(ii)如果DNA存在于样品中，则鉴定包括DNA的至少第一染色区，以及包括其他细胞组分的至少一个其他染色区；(iii)提取第一染色区和至少一个其他染色区的结构特征，所述结构特征包括以下的至少一个：(i)第一染色区和一个其他染色区的至少一个的大小，和(ii)所述第一染色区和所述至少一个其他染色区关于彼此的位置；以及(iv)如果鉴定了第一染色区且所述结构特征符合预定为表征可疑病原体的结构特征，则确定身体样品中可疑病原体的存在。
【专利说明】用于检测生物样品中病原体的方法和系统
【技术领域】
[0001]本公开内容涉及诊断方法，且特别是用于检测体液中病原体的方法和系统。
【背景技术】
[0002]视为作为背景与本发明公开的主题相关的参考文献列出如下:
[0003]-J.Keiser, J.Utzinger, Z.Premji, Y.Yamagata 和 B.H.Singer 于 Annals ofTropical Medicine&Parasitology 中，卷 ％，号 7，643 - 654 (2002)
[0004]-美国专利号5，470，751
[0005]-Centers for Disease Control and Prevent1n CDC 的在线出版物，DiagnosticProcedures, 2009“Blood specimens:Microscopic Examinat1n，，at http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/Frames/DiagnosticProcedures/body_dp_bloodexamin.htm
[0006]本文中对上述参考文献的承认不应被推断为意指这些以任何方式与本发明公开的主题的专利性相关。
[0007]背景
[0008]染色是生物学和医学中常用的技术以突出生物组织中的结构用于观察，经常借助于不同的显微镜。着色剂(stain)可被用于定义和检查大量组织(bulk tissue)(突出显示，例如，肌纤维或结缔组织)、细胞群(例如，分类不同的血细胞)、或单独细胞内的细胞器。
[0009]使用细胞染色以在显微镜下更好地可视化细胞和细胞组分。通过使用不同的着色齐U，人们可优先染色某些细胞组分，诸如核或细胞壁，或整个细胞。可对固定的、或非活细胞、以及对活细胞使用着色剂。
[0010]细胞染色技术还经常被用于检测血液样品中的病原体。一种重要的病原体是疟疾。
[0011]在1876年，合成了用于通过染色检测的第一种染料(dye)亚甲蓝。六年后，其被用于发现结核杆菌。数年内，采用修饰的MB，包括，与其他染料组合的“成熟的”MB，诸如伊红，其允许区分血细胞和疟疾寄生物的核，以及MB亚甲基蓝去甲基化与作为稳定剂的甘油在甲醇溶剂中的组合，被称为Malachowsk1-赖特-姬姆萨着色剂。
[0012]J.Keiser等人描述了与姬姆萨着色剂相比，吖啶橙用于疟疾诊断，包括其诊断性能、其推广和实施、以及控制疟疾的影响。
[0013]美国专利号5，470，751描述了用于染色疟疾感染的细胞的另一种试剂和使用该试剂检测疟疾感染的细胞的方法，其中试剂是包含金胺类似物，诸如金胺O的至少一种第一染料和稠合的苯衍生物诸如3，3’ - 二乙基-2，2’ -氧杂羰花青碘化物的至少一种第二染料的染色溶液。将试验样品用试剂处理以染色疟疾感染的细胞。然后将染色的疟疾感染的细胞进行光学检测。
[0014]此外，Centersfor Disease Control and Prevent1n CDC, DiagnosticProcedures, 2009 在 “Blood specimens:Microscopic Examinat1n” 的标题下描述了使用染色核酸的荧光染料用于检测血液寄生物，诸如疟原虫的Kawamoto技术。如该出版物中所讨论的，在Kawamoto技术中，将载玻片上的血涂片用吖啶橙(AO)染色，并用荧光显微镜或配备有干涉滤光器系统的光学显微镜来检查。这导致核DNA为绿色且细胞质RNA为红色的差别染色，其允许识别寄生物。
[0015]概述
[0016]本公开内容根据其各方面的第一个方面提供了，检测样品中病原体感染的方法，该方法包括:
[0017]-用两种或更多种染料染色所述身体样品，所述两种或更多种染料包括主要染色DNA的至少一种染料，由此在DNA和不同于DNA的至少一种其他细胞组分之间提供差别染色；
[0018]-如果DNA存在于样品中，鉴定包含DNA的至少第一染色区，以及包含其他细胞组分的至少一个其他染色区；
[0019]-提取第一染色区和至少一个其他染色区的结构特征，所述结构特征包括以下中的至少一个:(i)第一染色区和一个其他染色区的至少一个的大小和(ii)所述第一染色区和所述至少一个其他染色区关于彼此的位置；以及
[0020]-如果第一染色区被鉴定且所述结构特征符合预定为表征可疑病原体的结构特征，则确定样品中可疑病原体的存在。
[0021]根据第二个方面，本公开内容提供了试剂盒，包括:
[0022]-第一染料，所述第一染料主要染色DNA；
[0023]-第二染料，所述第二染料用于染色不同于DNA的至少一种其他细胞组分；
[0024]-说明书，所述说明书用于所述第一染料和所述第二染料用于确定样品中可疑病原体的存在的使用。
[0025]根据第三个方面，本公开内容提供了系统，包括:
[0026]-图像采集组件，所述图像采集组件被配置和可操作以获取样品中的染色区的至少一个光学图像，染色区包括主要相应于DNA的第一染色区和相应于不同于DNA的至少一种其他细胞组分的至少一个其他染色区；
[0027]-图像处理单元，所述图像处理单元被配置以
[0028]i)提取所述至少第一染色区和所述一个其他染色区的结构特征，所述结构特征包括以下中的至少一个:(i)所述第一染色区、和(ii) 一个其他染色区的至少一个的大小；和所述第一染色区和所述一个其他染色区关于彼此的位置；以及
[0029]ii)如果第一染色区被鉴定且所述结构特征符合预定为表征病原体感染的结构特征，则确定身体样品中可疑病原体的存在。
[0030]又，根据第四方面，本公开内容提供了用于鉴定样品中的病原体的处理单元，包括:
[0031]-输入模块，所述输入模块被配置和可操作以接收相应于样品中的染色的对象的数据，该样品中的染色的对象包括主要相应于DNA的第一染色区和相应于不同于DNA的至少一种其他细胞组分的至少一个其他染色区，以及
[0032]-图像处理单元，所述图像处理单元被配置和可操作以处理相应于所述染色的对象的所述数据，所述处理包括:
[0033]-提取染色的对象中的至少第一染色区和第二染色区的结构特征，所述结构特征包括以下中的至少一个:(i)第一染色区和一个其他染色区的至少一个的面积和(ii)所述第一染色区和所述一个其他染色区关于彼此的位置；以及
[0034]-如果所述结构特征符合预定为表征可疑病原体的结构特征，则提供指示样品中可疑病原体的存在或不存在的值或值的组合。
[0035]根据第五方面，本公开内容提供了计算机程序产品，所述计算机程序产品包括计算机可用介质，所述计算机可用介质在其中具有实现在以两种或更多种染料染色的样品中检测病原体感染的计算机可读程序代码，计算机程序产品包括:
[0036]用于导致计算机鉴定染色的对象中主要相应于DNA的至少第一染色区和相应于不同于DNA的至少一种其他细胞组分的至少一个其他染色区的计算机可读程序代码；
[0037]-用于导致计算机提取至少第一染色区和一个其他染色区的结构特征的计算机可读程序代码，所述结构特征包括以下中的至少一个:(i)第一和一个其他染色区的至少一个的面积和(ii)所述第一染色区和所述一个其他染色区关于彼此的位置；
[0038]-用于导致计算机如果所述结构特征符合预定为表征可疑病原体感染的结构特征，则确定指示样品中可疑病原体的存在的值或值的组合的计算机可读程序代码。
[0039]附图简述
[0040]为了更好地理解本文公开的主题并举例说明其可如何在实践中进行，现将通过仅非限制性实例的方式，参考附图，描述实施方案，其中:
[0041]图1A-1F显示了三种不同曝光下获得的图像；白细胞(图1A-1C)和疟疾感染的红细胞(图1D-1F)的明场(图1A、1D)、蓝色荧光(365nm,图1B和1E)和UV荧光(475nm,图1C、1F)的图像。
【具体实施方式】
[0042]本发明是基于用于血液样品中的不同组分的差别染色从而允许几乎即时检测血液中的感染的方法的开发。
[0043]具体地，本发明人已经发现，用吖啶橙(AO)试剂染色血液样品允许区分包含DNA的病原体和，例如，血小板、网织红细胞、豪-乔小体、以及细菌诸如表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。
[0044]还发现了，用AO和Hoechst试剂染色血液样品，并通过采用包括两个不同的染色区(对象是包括所检查的染色区的视野中的图像)的染色的对象的图像分析，允许检测血液样品中的疟疾感染。在这方面，发明人发现了，除了检测在(样品的)观察的染色的对象中的两个不同的染色区，考虑到染色区的一些空间特征，诸如每个染色区的大小或维度和/或其之间的空间位置关系有时也是重要的。
[0045]本发明人还确定了，为检测血液样品中的病原体，至少一种染料应优先于染色其他细胞组分染色脱氧核糖核酸(DNA)。
[0046]本发明人还发现，通过使用两种染料，一种主要染色DNA，所获得的诊断的灵敏度在95%以上，且甚至在97%或99%以上。
[0047]此外，已发现并还显示于以下实施例中，本文公开的方法允许鉴定低计数/μ I的病原体的存在。例如，本文提供的实施例显示了，寄生物，诸如疟原虫可甚至在低于1，000个寄生物/ μ I的计数且甚至以约20个寄生物/ μ I的低计数在血液中检测到。
[0048]因此，本公开内容根据第一个方面提供了，检测样品中病原体感染的方法，方法包括:
[0049]-用两种或更多种染料染色所述身体样品，其中至少一种染料主要染色DNA，由此在DNA和不同于DNA的至少一种其他细胞组分之间提供差别染色；
[0050]-如果DNA存在于样品中，鉴定包含DNA的至少第一染色区，以及包含其他细胞组分的至少一个其他染色区；
[0051]-提取所述第一染色区和至少一个其他的染色区的空间特征，所述空间特征包括以下中的至少一个:(i)所述第一染色区和一个其他染色区的至少一个的大小；以及(ii)第一染色区和至少一个其他染色区关于彼此的位置；
[0052]-如果第一染色区被鉴定且所述空间特性符合(即，匹配、相应于、属于、与其相关)预定为表征可疑病原体感染的值或值的组合，确定样品中的病原体的存在。
[0053]如所理解的，虽然本发明在以下的详细描述中关于检测样品诸如血液样品中病原体感染的方法来描述，应理解，本公开内容还包括，用于执行本发明的试剂盒、系统、处理单元以及其他方面，如本文中公开的，
[0054]本发明的方法适用于各种样品。在一些实施方案中，样品是身体样品。在一些实施方案中，身体样品是液体身体样品，诸如，但不限于此，血液、唾液、精液、汗液、痰、阴道分泌物(vaginal fluid)、粪便、乳汁、支气管肺泡灌洗液、洗胃液、泪液和鼻涕。
[0055]在一些实施方案中，身体样品是血液样品。
[0056]在一些实施方案中，血液样品选自全血样品、红细胞样品、血沉棕黄层样品、血衆样品、血清样品、来自任何其他血液级分的样品、或其任何组合。
[0057]身体样品可以来自任何生物，但优选地来自温血动物。
[0058]在一些实施方案中，身体样品是来自哺乳动物的样品。
[0059]在一些实施方案中，身体样品是取自人体的样品。
[0060]在其他一些实施方案中，样品取自任何家养动物、动物园动物和农场动物，包括但不限于狗、猫、马、牛和绵羊。
[0061]在一些实施方案中，身体样品可取自作为疾病媒介物的动物，包括鹿或大鼠。
[0062]在一些其他实施方案中，样品是环境样品，诸如，但不限于此，水(例如地下水)样品、表面拭子、土壤样品、空气样品、或其任何组合。
[0063]在一些其他实施方案中，样品是血液样品，诸如，但不限于此，肉样品、乳样品、水样品、洗漆液样品(wash-liquid sample)、饮料样品、和其任何组合。
[0064]作为在本文中公开的方法的第一阶段，在适合的条件下，将样品用在样品中提供两种不同染色区的至少两种染料染色。
[0065]除了其他以外，可相对于例如背景或并行的染色(collateral staining)定义染色区。例如，基于强度的阈值、基于对比的阈值、边缘检测、背景减除、标准化、或其组合可被应用于限定染色区。此外，染色区的限定可允许，除了其他以外，发散边界(diffuseboundaries),例如,通过使用亮度加权的总和/积分。
[0066]在一些实施方案中，诸如在膜染色的情况下，存在于第二染色区内的第一染色区可被定义为包括第一区域存在于第二区域内外切的区域(the area circumscribed withinthe second area)内的情况。例如,红细胞的膜染色,可导致类似于围绕细胞圆周的细线条的第二染色区(如在二维显微镜图像中观察的)；在这样的情况下，如果其落入染色的细胞圆周内，则可确定第一区存在于所述第二区域内。
[0067]在一些实施方案中，染色样品可需要标准显微镜样品制备。例如，样品制备可利用用于血涂片制备的熟知的薄涂片或厚涂片法。作为替代的实例，与放置染料一起、之前或之后将一滴样品置于干净的载玻片的中间，并将盖玻片以一定角度，首先使边缘接触载玻片，轻轻地放置在滴上。然后允许液体在两片玻璃之间散开而不施加压力。
[0068]当提及染料时，应当理解为包括能够染色生物细胞的组分，以增强对比和突出是细胞或细胞的一部分的染色对象的结构的任何化学或生物物质。染料可具有类偏好或特异性，例如可具有对染色核酸，以及在核酸之间对DNA或RNA的偏好或特异性，对氨基酸、对脂质、碳水化合物等的偏好或特异性。
[0069]当提及偏好或主要染色时，应理解，染料以其强度比以相同颜色或荧光光谱对另一种细胞组分的染色强度大至少两倍、三倍、四倍或甚至10倍的特定颜色或荧光染色一种其他细胞组分。
[0070]在一些实施方案中，当提及偏好或主要染色时，应理解，染料对一种细胞组分(以特定的颜色或荧光光谱)具有的亲和力(分子引力)是其对另一种细胞组分的亲和力(以相同的颜色或荧光光谱)的至少两倍、三倍、四倍、甚至10倍大。
[0071]在一些另外的实施方案中，当提及偏好或主要染色时，应理解，通过染料染色DNA是稳定的，或与其染色其他组分相比具有更高的稳定性。稳定性可被理解为意指，在用对DNA具有偏好的染料染色样品后，在接触到染料后至少30分钟，有时至少I小时、2小时或甚至5小时后，由染料产生的染色保持基本上一致。另外，稳定性可被理解为意指，由染料所产生的染色，在曝光(例如用于荧光激发的光)至少0.25秒、I秒、或甚至15秒的曝光期间保持基本上一致。
[0072]在此背景下，应理解，对DNA具有偏好的染料还可染色其他细胞组分，但以较低的弓I力或较低强度或以不同的荧光响应(激发光谱和/或发射光谱)，使得其允许染料对其具有偏好的DNA的更大增强。例如，如将在以下进一步讨论的，在某些条件下，染料可主要染色DNA，然而，在一些其他条件下，相同染料可染色RNA。
[0073]类似地，一种其他细胞组分的染色，应理解为包括除了 DNA之外一种或更多种细胞组分的染色。这还可包括除了 DNA之外的一种或更多种细胞组分的染色，但对DNA的染色没有偏好或较低偏好。
[0074]在一些实施方案中，染料不是细胞类型特异性的。换言之，染料不特异于特定病原体或特定病原体的生命周期的特定阶段或由其感染的宿主的特定细胞，并且将染色细胞组分，不论其起源，例如DNA序列或结构本身、RNA序列或结构本身、蛋白本身等。
[0075]第一染色区的存在基于各种因素确定，所述因素可涉及，除了其他以外，染色强度、染色形状、染色的差异性或一致性等。一旦第一染色区被确定存在，则归因于DNA的存在。
[0076]方法还提供了不同于DNA的至少一种其他细胞组分的染色区。染色区可从不同的条件下相同的染料或通过使用不同的染料获得。
[0077]不限于此，至少一种其他细胞组分选自由以下组成的组:RNA、蛋白质、脂质、膜、细胞质、核糖体、碳水化合物、葡聚糖、糖蛋白、内质网、或其任何组合。
[0078]在一些实施方案中，至少一种其他细胞组分为RNA。
[0079]存在可根据本公开内容使用的各种染料。在一些实施方案中，染料是发色团或荧光团。
[0080]染料诸如姬姆萨着色剂被称为发色的一其效应是对样品提供颜色或不透明度并且是可见的，例如，以亮视野显微镜。
[0081]在一些实施方案中，染料提供样品的荧光染色。荧光通过用导致以光的不同光谱“发光”的“激发”光的光谱照射样品来可视化。荧光染料的潜在优势是，未染色的样品区域显示为黑色或近黑，因此通常在染色和未染色区之间比发色斑提供更大的对比。吖啶橙(AO)是用于生物样品的荧光染色的染料的实例。
[0082]在一些实施方案中，染料是细胞渗透染料。
[0083]不限于此，主要染色DNA的染料可以是由以下组成的组的任何成员:吖啶橙(A0，N, N，N’，N’ -四甲基吖啶-3，6- 二胺，绿色染色)、Hoechst家族、DAPI (4’，6- 二脒基_2_苯基吲哚)、溴化乙锭(3，8- 二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴化物)、碘化丙锭(2，7- 二氨基-9-苯基-10 ( 二乙基氨基丙基)-菲啶碘化物甲碘化物)、SYBR家族、YOYO、DRAQ家族、SYTO家族、TOTO家族、或其任何组合。此外，染料包括保留其DNA偏好的任何前述染料的化学改性。
[0084]不限于此，不主要染色DNA的染料可以是由以下组成的组的任何成员:结晶紫(三(4-( 二甲基氨基)苯基)甲基氯)、苏木精着色剂、伊红着色剂、番红(对称的2，8-二甲基_3，7- 二氨基吩嗪的氮鎗化合物)、吖啶橙(A0, N, N, N，，N，-四甲基吖啶_3，6- 二胺，红染色)、酸-希夫着色剂、Masson着色剂、普鲁士蓝、或其任何成分或组合。不主要染色DNA的更多染料是本领域已知的。
[0085]染料诸如AO对不同的细胞组分提供不同的荧光光谱。当AO在中性pH下染色DNA时，其具有502nm下的激发峰(青色)和525nm下的发射峰(绿色)；当其在中性pH下染色RNA时，激发峰移至460nm(蓝色)和发射峰偏移到650nm(红色)。因此，取决于激发波长和样品的条件，其允许在DNA和RNA之间的差别染色。
[0086]Hoechst家族染料由化学式C25H26N6R来已知，其中R代表各种可能的取代基，诸如，不限于此，-OH(Hoechst 33258)、-CH2CH3(Hoechst 33342) , -N(CH3)2(Hoechst34580)、-SO2NH2 (Hoechst S769121)。
[0087]在一些实施方案中，方法包括用至少两种染料组合染色，第一染料为Hoechst家族的成员且第二染料是吖啶橙。
[0088]当提及两种或更多种着色剂的组合时，应理解，可将两种或更多种染料同时或依次地添加至样品。类似地，只要存在允许观看同一样品中两种或更多种不同的染色区的时间点，可以同时或依次得到各自的染色区。
[0089]在一个实施方案中，方法采用AO与本质上特异于核DNA的膜渗透性染料(例如Hoechst 33342，产生蓝色的发光)的组合。
[0090]根据本实施方案，AO允许使用红色发射或绿色和红色发射的组合，以染色病原体的细胞质(并且还可能细胞核，但基本上不干扰Hoechst染色)。
[0091]在一些实施方案中，AO和Hoechst的组合允许检测寄生物。根据本实施方案并不限于此，对于检测寄生物，诸如痕原虫属(Plasmodium)物种的成员，Hoechst试剂诸如Hoechst 33342的浓度可以是10 μ g/mL,但还可使用其他可能的值,例如在3 μ g/mL和250μ g/mL之间的范围内；并且可以以1.5 μ g/mL使用A0，但还可使用其他可能的值，例如在0.2 μ g/mL和125 μ g/mL之间的范围内。
[0092]在一些实施方案中，确定所用的AO和Hoechst试剂的量，以便在生物样品中提供其间的比。因此，HoechstiAO比可在50:1至1:1之间的范围内，有时约7.5:1。
[0093]相同或相似的比还可适用于其他染料组合，第一染料主要染色DNA且其他染料主要染色一种其他组分，如所定义的，即，在第一染料和其他染料之间50:1至1:1之间的范围的比。
[0094]AO可以另外地或替代地被用于染色，例如，疟原虫属细胞质和/或食物泡，但不是寄生物可在其内的红细胞(RBC)的细胞质，允许寄生物的身体被观察到而不被RBC掩盖，SP使寄生物存在于RBC内。
[0095]合适的浓度可相对于因素，诸如特定的染料组合、染色温育的期望持续时间、得到的颜色或荧光的亮度、以及得到的染色的特性来优化。
[0096]在一些实施方案中，本文公开的方法可适用于检测由携带DNA的病原体的感染。如此，如果DNA存在于样品中的话，至少第一染料染色至少DNA，由此提供指示样品中携带DNA的病原体的存在的第一染色区。
[0097]病原体可以是任何传染性微生物。在一些实施方案中，病原体是真核寄生物。在本公开内容的上下文中，当提及真核寄生物时，应理解为包含单细胞寄生物和多细胞寄生物，还有真菌，诸如酵母(例如假丝酵母属(Candida))和曲霉属(Aspergillus)。
[0098]在一些实施方案中，病原体是细菌。这包括，例如并不限于此，大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、结核棒状杆菌(Microbacterium tuberculosis)、沙门氏菌属物种(Salmonella species)、疏螺旋体属物种(Borrelia species)和苍白密螺旋体(Treponema pallidum)以及其他已知的细菌。
[0099]在一些实施方案中，病原体是真核寄生物。根据该实施方案，寄生物可以是单细胞的寄生物，诸如原生动物。这包括生殖器原生动物，例如阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis),神经系统原生动物,例如福氏耐格里阿米巴原虫(Naegleria fowleri),粪便原生动物，例如兰伯贾第虫(Giardia Iamblia)，血液原生动物。在一些实施方案中，病原体可以是多细胞的寄生物，诸如班氏丝虫(Wuchereria bancrofti)、马来丝虫(Brugiamalayi)、帝纹丝虫(Brugia timori)、链尾丝虫(Mansonella streptocerca)、或盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)。
[0100]在一些实施方案中，寄生物是选自由以下组成的属的血液原生动物:锥虫属(Trypanosoma)(导致加斯病(Chagas disease)和非洲昏睡病)原虫属(导致痕疾)；弓形虫属(导致弓形体病)；巴贝斯虫(Babesia)(导致巴贝斯虫病(Babes1sis))。
[0101]具体地说，当提及疟原虫属时，应理解为至少包含由以下组成的组的任何成员:恶性痕原虫(Plasmodium falciparum) (P.falciparum)、间日痕原虫(Plasmodiumvivax) (P.vivax)、卵形痕原虫(Plasmodium ovale) (P.0vale)、三日痕原虫(Plasmodiummalariae) (P.malariae)、和诺氏痕原虫(Plasmodium knowlesi) (P.knowlesi)。
[0102]在一些实施方案中，病原体被理解为意指特定病原体或其组的生命周期的特定阶段。例如，可具体应用本文中公开的本发明以检测疟原虫属物种或特别是恶性疟原虫的滋养体、裂殖体或配子母细胞。
[0103]如可理解的，本文中公开的方法可适用于使用相同条件和/或在同一样品中，例如，染料的相同组合，相同测试条件等，检测多种病原体，以及检测病原体在其生活周期的多个阶段。在一些实施方案中，本文公开的方法可确定所怀疑的多种病原体(或生命阶段)的哪一种或更多种。
[0104]在一些实施方案中，本文公开的方法用于检测人血液样品中的疟原虫感染，方法包括:
[0105]-用至少两种染料在允许至少染色DNA和不同于DNA的至少一种其他细胞组分的条件下染色人血样品；
[0106]-如果DNA存在于血液样品中，鉴定血液样品中包含DNA的至少第一染色区，以及包含一种其他细胞组分的至少一个其他染色区；
[0107]-提取第一染色区和至少一个其他染色区的结构特征，所述空间特征包括第一染色区和一个其他染色区的至少一个的大小以及第一染色区和至少一个其他染色区关于彼此的位置；
[0108]-如果第一染色区被鉴定并且所述结构特征落入预定为表征病原体感染的限定之内，则确定指示血液中可疑疟原虫的存在的值或值的组合。
[0109]在涉及确定血液中疟原虫的存在的一些实施方案中，通过用吖啶橙(AO)和Hoechst染料，特别是Hoechst 33342，以在1:50和1:1的范围内，有时，甚至在1:7.5的范围内的AO和Hoechst 33342之间的浓度比的组合染色血液样品获得染色的对象。
[0110]根据上述实施方案，方法适用于检测人类血液样品中的疟疾感染。
[0111]一旦用一种或更多种染料染色样品，则获得至少一个染色的对象，并且然后方法包括选择样品中的至少一个染色的对象，以及获得染色的对象的结构或空间特征。
[0112]当提及染色的对象的空间或结构特征时，应理解为包含选择的染色的对象中的染色区的任何可测量的特征。特征可以呈现为表征染色区的离散值或值的范围。
[0113]在一些实施方案中，结构特征包括以下的至少一个:染色区的大小(例如，维度、长度、周长、最小宽度、最大宽度、或面积)和/或第一染色区相对于其他一个或更多个染色区的位置的位置。换言之，方法可基于至少一个决定性维度，例如染色区的面积，或第一染色区相对于其他一个或更多个染色区的位置的位置来进行。这些特征还可与一个或更多个另外的特征组合。
[0114]另外的结构特征可包括，但不限于此，染色区的形状、染色区的运动模式、染色区的强度、染色区的颜色、染色区的质地(texture)(轮廓(contour))、染色区的边界清晰度、染色强度或颜色的模式、染色区与其他染色区或图形特征的重叠、染色区与其他染色区或图形特征的相对大小、染色区与其他染色区或图形特征的接近或接触。
[0115]在一些实施方案中，身体样品是血液样品。
[0116]在一些实施方案中，病原体是血液寄生物。
[0117]在一些实施方案中，身体样品是人血液且病原体是引起人类疟疾的疟原虫属物种，诸如选自由以下组成的组的那些:恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫。
[0118]当身体样品是血液样品时，结构特征的提取包括选择血液样品中包括第一染色区和至少一个其他染色区的染色的对象。
[0119]基于染色区和结构特征的分析，确定样品感染可疑病原体的高可能性。因此，在本发明公开内容的上下文中，当提及病原体或可疑病原体的存在的确定时，应理解确定了以下的任何一种:
[0120]-一种或更多种可疑病原体存在于样品中；
[0121]-一种或更多种可疑病原体以高于预定的阈值的置信区间存在于样品中；置信区间可增加或最终确定可疑病原体的存在可需要一个或更多个另外的分析步骤。
[0122]-一种或更多种可疑病原体可以确定的或评估的置信评分或对另外分析步骤可获得的可能性存在于样品中。
[0123]根据一些实施方案，如果鉴定了第一染色区(指示样品中DNA的存在)，且第一染色区邻接、接近、或位于一个其他染色区内并且第一染色区即包含DNA的区域，以及一个其他染色区的至少一个的大小在预定的范围内，则确定可疑病原体存在于样品中。例如，包含DNA的区域常常位于对存在于细胞质中的RNA染色的区域的附近。
[0124]根据一些其他的实施方案，如果鉴定了第一染色区(再次，指示样品中DNA的存在)且第一染色区的大小满足关于一个染色区的大小的预定的关系，则确定可疑病原体存在于样品中。这一标准可以被用于，例如，从细菌中区分靶真核寄生物:在真核细胞中，主要染色DNA的区域应该比染色细胞质的更小，指示不存在于细菌中的明显的细胞核。
[0125]根据还一些实施方案，如果鉴定了第一染色区且第一染色区的维度或面积在与特定病原体或特定病原体的生命周期的特定阶段相关的预定的值的范围内，则确定可疑病原体的存在。例如，如果病原体是引起疟疾的病原体(即疟原虫属)，则第一染色区的面积通常将不低于0.2 μ Hi2或高于20 μ Hi2或将在0.2 μ Hi2至20 μ Hi2的范围内。在一些实施方案中，在检测疟原虫属时第一染色区的面积将不低于0.8 μ m2或高于13 μ Hi2或将在0.8 μ Hi2至
13μ Hi2的范围内。
[0126]根据一些其他实施方案，如果鉴定了第一染色区且一个其他染色区的面积在与特定病原体或特定病原体的生命周期的特定阶段相关的预定的值的范围内，则确定样品中可疑病原体的存在。例如，如果病原体是引起疟疾的病原体(即疟原虫属)，则其他染色区例如细胞质的面积通常将不低于0.8 μ m2或高于65 μ m2或将在0.8 μ m2至65 μ m2的范围内。在用于检测疟疾感染的一些实施方案中，其他染色区的面积不低于1.6μπι2或不超过40 μ m2或在1.6 μ m2至40 μ m2的范围内。
[0127]考虑以上特征，应理解，根据本公开内容的一些实施方案，第一染色区的特定面积不可超过一个其他染色区的特定面积。类似地，第一染色区的维度应该比其他染色区的维度统计学上显著(例如通过t_检验)更小。
[0128]在一些其他的实施方案中，如果鉴定了第一染色区且第一染色区占据所有其他染色区的预定的％体积，则确定样品中可疑病原体的存在。例如，当提及疟疾时，第一染色区通常将占据所述一个其他染色区的12%至60%之间。
[0129]根据一些其他的实施方案，如果鉴定了第一染色区且第一染色区和一个其他染色区具有预定的形状，则确定样品中可疑病原体的存在。例如，已知布氏锥虫(Trypanosomabrucei)的锥鞭毛体阶段具有细长的、杆状的形状。其他的形状可包括，不限于此，螺旋形、椭圆形、细长的和球形的特性。
[0130]根据一些实施方案，如果鉴定了第一染色区且第一染色区具有高于预定的阈值的强度的差异性，则确定样品中可疑病原体的存在。强度的差异性可表现为用第一染色剂染色的多于一个区域的簇(cluster)(多个第一染色区)或为具有颜色或荧光的不同阴影的不规则形状的第一染色区。这可反映，例如原生动物的发育中的多核阶段，诸如疟原虫属的裂殖体。
[0131]还此外，根据一些实施方案，如果鉴定了第一染色区且染色的对象的运动的模式(方向性和/或速度)符合与可疑病原体相关的预定的模式，则确定可疑病原体的存在。例如，当考虑布氏锥虫时，预计其运动(运动性)以典型模式发生。如此，当用AO和Hoechst染色剂染色样品时，可分析AO染色区的运动以证实与预计的模式匹配或预计的相关性。
[0132]在还一些其他实施方案中，如果在染色的对象的运动期间，第一染色区维持在一个其他染色区的边界内，则确定可疑病原体的存在。因此，当提及具有布氏锥虫的以上实例时，可分析Hoechst染色区的运动以确保推定的核在所有时间保持在移动的AO染色区内。
[0133]可通过简单观察样品确定结构特征，然而在一些实施方案中，其优选地基于样品的一个或更多个光学图像被确定。因此，根据一些实施方案，方法包括捕获染色的对象的至少一个光学图像以及从至少一个光学图像中提取结构特征。
[0134]有时，特别是当结构参数包括染色的对象的移动或运动时，捕获多于一个的光学图像，且基于按时间的一系列图像确定移动的结构参数。
[0135]不必要陈述，染色的对象的结构参数的累积(或收集)的信息越多，样品中的病原体的确定和鉴定可越精确。
[0136]结构参数可手动地，或通过使用允许自动化的专用系统来分析，且因此，允许相对快速检测和/或鉴定身体样品中的病原体。分析的结果可检索是/否指示病原体的存在、概率性指示病原体的存在，可疑病原体的图像用于进一步分析(手工或自动的)和/或可提供更具体的结果，包括本发明的病原体的类型、水平等(计数/μ I)。
[0137]自动的系统的使用可以是有意义的，不仅用于克服分析样品中染色的对象中的人为错误且节省时间和劳动力，而且由于身体样品的某些组分可能不立即染色和/或染色的程度可随时间显著地变化，如有时用H0echst33342染色被血液污染的细胞的情况。因此，图像特征可取决于如何快速地分析样品而变化。因此，存在具有允许快速、或甚至几乎瞬时成像和分析染色的样品的自动化系统的优势。
[0138]因此，根据本公开内容的另外方面，提供了系统，包括:
[0139]-图像采集组件，所述图像采集组件被配置和可操作以捕获样品中的染色区的至少一个光学图像，染色区包括主要相应于DNA的第一染色区和相应于不同于DNA的至少一个其他细胞组分的至少一个其他染色区；
[0140]-图像处理单元，所述图像处理单元被配置以提取所述至少第一染色区和所述一个其他染色区的结构特征，所述结构特征包括至少所述第一染色区、和一个其他染色区的至少一个的大小；以及第一染色区和所述一个其他染色区关于彼此的位置；以及，如果鉴定了第一染色区且结构特征符合预定为表征病原体感染的结构特征，则确定病原体存在于样品中。
[0141]在一些实施方案中，系统还包括用于提供输出的输出单元，该输出包括指示样品中可疑病原体的存在或不存在的值或值的组合。
[0142]在一些实施方案中，系统优选地是基于计算机的，使用储存于其中并相应于除了其他以外，与至少一种限定的病原体相关的结构特征的参数的集合。参数，例如，可包括与病原体相关的结构特征的预期的值或值的范围，或控制执行机器学习或数据分析算法的参数。参数可源自在基于参考样品，包括预确定的病原体获得之前或同时收集的信息。
[0143]参数还可包括涉及病原体，或感染了病原体的细胞的行为的信息，诸如运动性和取决于特定病原体的生命周期的特定阶段的特征的变化。
[0144]参数还可包括有关对一种类型的身体样品，例如对血液样品检测病原体使用的条件的信息，有关对特定身体液体使用的一组染料的染色质量和差异性、另外的染料组合或条件组合等的统计学信息。
[0145]在一些实施方案中，储存的参数的集合包括与多种病原体相关的参数。在一些实施方案中，储存的参数的集合包括与确定哪一种或更多种病原体可疑相关的参数。
[0146]在一些实施方案中，参数的集合与血液负荷病原体相关。在一些其他实施方案中，参数的集合与血液寄生物相关。在一些特定的实施方案中，参数的集合与隐匿于人血液的病原体，特别是，引起人类疟疾的疟原虫属物种，诸如选自由以下组成的组的那些相关:恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫。
[0147]本公开内容还提供了用于鉴定样品中的病原体的图像处理单元，包括:
[0148]-输入模块，所述输入模块被配置和可操作以接收相应于样品中的染色对象的(图像)数据，该样品中的染色对象包括主要相应于DNA的至少第一染色区和相应于不同于DNA的至少一种其他细胞组分的至少一个其他染色区，以及
[0149]-图像处理单元，所述图像处理单元被配置和可操作以处理相应于染色的对象的数据，处理包括:
[0150]-提取染色的对象中的至少第一染色区和一个其他染色区的结构特征，所述结构特征包括以下中的至少一个:(i)第一染色区和一个其他染色区的至少一个的大小和(ii)所述第一染色区和所述一个其他染色区关于彼此的位置；以及
[0151]-如果所述结构特征符合预定为表征可疑病原体的结构特征，则提供指示样品中病原体的存在或不存在的值或值的组合。
[0152]可使用关于系统和图像处理单元的多种操作模式。可使用自动以及手动和半自动的系统。
[0153]关于系统，图像捕获组件可以是被配置和可操作以获取被选择的染色的对象的至少一个光学图像的任何装置，例如CXD或CMOS照相机。图像捕获组件可配备有常规功能，诸如聚焦功能。图像捕获组件还可包括镜头、光圈和快门。
[0154]图像捕获组件提供图像数据用于通过图像处理单元处理。在图像分析的上下文中的图像数据是基于基本覆盖一个或更多个感兴趣的区域(ROI)的像素信息的集合。
[0155]通常包括像素信息的图像数据可展示为任何可用格式，包括，不限于此，标签图像文件格式(TIFF)、联合图像专家组(JPEG)、图形图像格式(GIF)、便携式网络图形(PNG)、便携式文档格式(PDF)、位图(BMP)、和原始图像传感器数据。图像数据可呈压缩的数据格式或非压缩的数据格式；可涉及任何灰度或色度；可包括位图数据、或包含位图数据的位图文件的部分。
[0156]捕获一个或更多个图像后，其通过图像处理单元来处理。通过处理单元的处理被配置和可操作以提供染色区的结构特征的一个或更多个值。换言之，基于图像分析技术，确定涉及染色区的结构特征的各种输出值，其可允许鉴定样品中可疑病原体的存在或不存在或评估其中存在的可能性。值可包括ROI中一个或更多个其他染色区的维度，在染色区之间的关系，和/或关于结构特征的值的平均值、组合或统计值。在一些实施方案中，处理可包括，分析相应于结构特征的一个或更多个值或值的组合，该值或值的组合关于已被先验确定表征一个或更多个病原体，或其间的差异的参数(例如值或值的范围或适当的机器学习权重)。
[0157]图像分析可基于一个或更多个常规实践诸如轮廓检测、图像参数导数、形状检测、图形重建、分割、图像差分、模式匹配、匹配滤波、机器学习和几何散列法。
[0158]通过图像处理单元的数据处理可使用分类模块。分类模块可装备有先前对病原体确定的至少一个结构参数。分类模块可分析提供的结构特征并推断一系列被鉴定的可能病原体。通过说明的方式，分类器可鉴定多个可能的病原体或单一类型的病原体。
[0159]在特定的实施方案中，确定的结构特征与预期的病原体相关，且关于预定义的参数分析这些。
[0160]应该注意，单一病原体的鉴定可以是包括不同特征组合的复杂过程。因此，在使用染料的特定组合后确定的结构特征可被用作用于随后分析染料的进一步组合的标准。例如，在先前分析中鉴定的结构特征可被用于继续鉴定方法，而聚焦染料的可能的组合的子集。例如，在鉴定病原体的生物学家族水平中，先前分析的结果可提供可能的最佳过滤选择表以用于下一轮分析。
[0161]在一些实施方案中，可疑病原体的存在、或指示可疑病原体的存在的一个或更多个值的图像分析和确定可利用对多个结构特征或相关的值操作的一个或更多个机器学习算法。此类算法包括不限于，支持向量机(SVM)、人工神经网络、朴素贝叶斯分类器、贝叶斯网络、决策树、最近邻居算法(Nearest Neighbor Algorithms)、随机森林、Boosting、回归分析、线性分类器、二次分类器、k-最近邻居、隐马尔可夫模型以及其任何组合。一个或更多个机器学习算法的结果可包括一个或更多个置信评分、可能性和/或是/否决定。
[0162]如认识到的，在分析中确定的特征越多-鉴定方法越精确。通过使用多种染料诱导多个结构特征，错误检测或错误分类的风险降低。然而，增加的特征还可相应于增加的计算或操作负荷。一些实施方案力求平衡增加的特征的增加的好处与相关负荷缺点。
[0163]基于通过分析获得的值或值的组合，通过处理单元做出关于样品中病原体的存在或不存在，包括，有时，样品中病原体的类型(定性鉴定)和/或病原体的量(定量鉴定)的各种决定。
[0164]处理单元还配置为与输出单元进行通信。因此，基于通过处理单元确定的结构特征的一个或更多个输出值，指示获得的图像中至少一个病原体的存在或不存在，并且在一些实施方案中，病原体的类型的一个或更多个输出信号通过输出单元来提供。
[0165]输出可以以任何可接受的形式来提供，包括，在控制单元的监视器上显示的图表、图形或文本，打印输出，作为语音信息，或用户的智能手机显示，用于从处理功用接收处理的数据并使用列表、表格、图表等展示涉及确定病原体感染的存在和任选地其身份的获得的结构特征和/或相关的值的信息。监视器可与打印机相连以打印输出。
[0166]处理单元还可包括用户界面模块，例如键盘、或触摸屏，用于允许从业者进行本发明的一些实施方案的方法以控制系统的操作，包括，除了其他以外，关于检查的身体液体来源、日期、地点等)，操作系统的条件、使用的染料的类型、将拍摄图像的数量、图像之间的时间间隔等的输入数据。
[0167]有时，图像分析还可包括在样品的染色的程度的基础上调整或标准化图像亮度。这些可基于，例如鉴定图像或一组图像中一种或更多种最亮和/或最昏暗的像素值(例如，相应于特定样品)，最亮和/或最昏暗区域的平均亮度，和/或图像直方图。此类特征可从代表性图像(不必是被标准化的图像)或从多个图像的统计分析中提取。用于标准化的特征可基于单一或多个图像，所述单一或多个图像可使用不同激发波长捕获(如AO在不同的发光波长下提供不同的颜色)。
[0168]图像亮度还可使用其他控制手段，诸如图像捕获组件曝光时间和/或发光的亮度来调整。
[0169]此外，操作系统的条件可允许定时图像采集，例如允许与一种或更多种染料的足够的温育时间以及以激发和/或发射波长的不同光学配置操作，以在各种颜色或荧光光谱下成像染色的样品。
[0170]为了以各种颜色或荧光光谱成像染色的样品，可通过转换照明的颜色实现激发中的变化。这可,例如,通过提供两种或更多种光源(例如对于A0，365nm下的UV LED照明灯以及475nm下的蓝色LED照明灯)以及其光学上组合它们(例如，使用分色镜或光栅)来进行。
[0171]在另一个实例中，单一照明光源(例如365nm下的UV LED照明灯)可被用于同时激发两种染料，且将一种或更多种光学滤波器移进或移出光路以选择相关的发射波长。其他染料组可使用如此处描述的相同入射光同时激发，即使一种或更多种染料非最佳地被激发。作为一个实例，AO可类似地连同Hoechst着色剂、DAPI和DRAQ着色剂被共激发。
[0172]在又另一个实例中，单一照明光源(例如365nm下的UV LED照明灯)可被用于同时激发两种或更多种染料，且发射光路被分开使得在两个或更多个图像捕获组件上捕获两种或更多种发射。
[0173]在又另一个实例中，彩色图像传感器被用于同时捕获两种或更多种荧光信号。彩色图像传感器的使用可，例如，排除对被移进或移出光路以选择相关波长的一个或更多个光学滤波器的需要。
[0174]在本公开内容的上下文中，可使用各种照明光源，这些包括，不限于此，提供白光(如明亮光显微镜)、UV光、蓝光、绿光、黄光、红光、其组合的那些,或适合于激发用于染色的一种或更多种染料的任何光。
[0175]系统的组件，即图像捕获组件、处理单元、输出单元等，可直接彼此连接(例如通过导线直接地)或一个或更多个组件可远离一个或更多个其他组件。例如，图像捕获装置可在内部网或互联网上发送数据至处理单元，以允许在远程位置进行处理。
[0176]可被用于进行本公开内容的方法的系统的实例描述于PCT专利申请公布号WO2012/090198中，其内容通过引用以其整体并入本文。
[0177]处理单元通常可通过运行进行输入数据的分析和存储的指令的专用程序(例如软件应用程序)来操作。软件应用程序可在机器可读的程序存储装置，诸如CD或存储磁盘中来实现。
[0178]根据上述，本发明还提供了机器可读的程序存储装置，所述程序存储装置可触知地实现由机器可执行的指令的程序以进行本文公开的方法，即检测样品中病原体感染的方法，方法包括:
[0179]-用两种或更多种染料染色所述液体样品，所述两种或更多种染料提供至少DNA和不同于DNA的至少一种其他细胞组分的差别染色；
[0180]-鉴定主要相应于DNA的至少第一染色区和相应于至少一种其他细胞组分的至少一个其他染色区；
[0181]-提取至少第一染色区和一个其他染色区的结构特征，所述结构特征包括第一和一个其他染色区的至少一个的至少大小和所述第一染色区和所述一个其他染色区关于彼此的位置；
[0182]-如果所述结构特征符合预定为表征病原体感染的结构特征，则确定指示样品中病原体的存在的值或值的组合。
[0183]又此外，本公开内容提供了计算机程序产品，包括计算机可用介质，所述计算机可用介质在其中具有实现的计算机可读程序代码，所述计算机可读程序代码用于在以两种或更多种染料染色的身体样品中检测身体样品中的病原体感染，计算机程序产品包括:
[0184]-导致计算机鉴定身体样品内的染色的对象的计算机可读程序代码；
[0185]-导致计算机鉴定染色的对象中主要相应于DNA的至少第一染色区和相应于不同于DNA的至少一种其他细胞组分的至少一个其他染色区的计算机可读程序代码；
[0186]-导致计算机提取至少第一染色区和一个其他染色区的结构特征的计算机可读程序代码，所述结构特征包括第一和一个其他染色区的至少一个的至少大小和所述第一染色区和所述一个其他染色区关于彼此的位置；
[0187]-导致计算机如果所述结构特征符合预定为表征病原体感染的结构特征，则确定指示样品中可疑病原体的存在的值或值的组合的计算机可读程序代码。
[0188]最后，本公开内各提供了试剂盒，包括:
[0189]-第一染料，所述第一染料主要染色DNA；
[0190]-第二染料，所述第二染料用于染色不同于DNA的至少一种其他细胞组分；
[0191]-说明书，所述说明书用于所述第一染料和第二染料用于确定身体样品中可疑病原体的存在的使用。
[0192]根据该方面，第一和第二染料可在单一组合物或在包含该第一染料的第一组合物以及包含该第二染料的第二组合物中来提供。除了染料之外，第一和第二组合物还各自包含，在用各自的染料染色身体样品时适合使用的载体。
[0193]本文中公开的试剂盒被用于进行本文中公开的方法的步骤和条件的每一个。
[0194]在一些实施方案中，第一染料包括Hoechst染料。在一些实施方案中，第二染料包括吖啶橙。
[0195]在一些实施方案中，试剂盒包括用于为身体样品以50:1至1:1之间的范围比提供第一染料和第二染料的说明书。
[0196]在一些实施方案中，第一染料包括Hoechst染料，特别是Hoechst 33342且第二染料包括A0，第一染料的浓度在3 μ g/mL和250 μ g/mL之间的范围内；且AO的浓度在0.2 μ g/mL和125 μ g/mL之间的范围内。
[0197]在一些其他实施方案中，第一染料包括Hoechst染料，特别是Hoechst33342且第二染料包括A0，Hoechst 33342的浓度为约10 μ g/mL ;且AO的浓度为约1.5 μ g/mL。
[0198]在一些实施方案中，第一染料和第二染料可与适合的缓冲液，诸如，不限于此，包含1% Tris-EDTA缓冲液、4.5% DDff和92.5%盐水的缓冲液组合。
[0199]不希望受理论束缚，ΑΟ/Hoechst染色提供更稳健并稳定的染色是可能的，这使得染色的样品的快速和有效的机器视觉(machine vis1n)。这允许成像比在显微镜下可用常规方法检查更大量的血液，这反而在低寄生物下提供较高的灵敏度。(另外或替代地)分析的一个或更多个应用的标准提供不取决于人为因素的可靠的结果也是可能的。
[0200]本公开内容的一些实施方案现将以根据公开的方法进行的非限制性实施例的以下说明来例证。应理解这些实施例旨在是说明性质的而非限制性的。显然，根据以上教导，这些实施例的许多修改和变化是可能的。因此，可以理解，在所附权利要求书的范围内，除了如下文具体地描述外，本发明可以以无数可能的方式不同地被实践。
[0201]一些非限制性实施例的描述
[0202]血■液样品中的疟原虫的检测
[0203]获自被鉴定为具有疟疾感染的人受试者的血液样品用包含2 μ g/ml吖啶橙、15μ g/ml Hoechst 33342、I % Tris-EDTA 缓冲液、4.5% DDW和 92.5%盐水的染色溶液来染色。
[0204]染色后,将样品使用不同颜色的照明成像,使用365nm下的UV LED光成像AO染色，且使用475nm下的蓝色LED光成像Hoechst染色)。将样品还在明视场(用白色光照射)中成像。
[0205]所得到的图像提供于图1A-1F中，图1A-1F获自白细胞样品，且图1D-1F获自疟疾感染的红细胞样品。
[0206]具体地，图1A显示了明亮光场图像，其显示了白细胞的边界(由图1A中的箭头所示的膜)，和DNA染色区(图1B中的箭头)以及其他组分染色区(在本情况下是由图1C中箭头所示的细胞质)具有对白细胞是典型的维度(DNA和RNA两者染色比疟原虫寄生物典型的更大)。
[0207]然而，图1D-1F显示了，第一染色区(DNA，由图1E箭头所示)和第二染色区(RNA，图1F中的白点)比细胞的边界(如由图1D中的箭头所示)小得多，指示无核红细胞的感染。
[0208]特别地，在未感染的样品中，未获得相应于图1E和图1F中显示的那些的染色区。
[0209]这些结果显示，通过用至少两种染料染色，一种主要染色DNA (在这种特定情况下是Hoechst 33342)，鉴定红细胞中的疟原虫感染是可能的。
[0210]检测的置信水平
[0211]在本研究中，200个血液样品的组根据本公开内容的实施方案来测试。使用基于标准显微镜方法学的姬姆萨染色确定了这些血液样品中的100个为疟疾阳性，且确定100个为阴性。200个样品的每个的重复用具有在测试的样品中2 μ g/ml吖啶橙和15 μ g/mlHoechst 33342的终浓度的染料溶液来染色，并且然后使用自动化机器视觉在光场、UV光和蓝光下进行分析，基本上如以上描述的。这些结果显示，在常规方法下被鉴定为感染的样品的多于97%使用AO/Hoechst染色也鉴定为如此。使用常规姬姆萨染色认为健康的100个样品中，93个使用AO/Hoechst染色被证实，但七个样品被鉴定为感染。然后使用姬姆萨试剂再一次分析这七个(通过以来自相同供体的新样品重复染色和显微镜检查两者，或通过引起阴性结果的原来的制备物的进一步显微镜检查)。在所有七个病例中，证实确实其被感染，但表面上以低于1，000个寄生物/μ I的低寄生物血症。
[0212]以上显示了，本文公开的方法不仅允许以高置信水平(97%以上)检测(即使由机器视觉)感染，而且还允许在寄生物计数为很低(低寄生物血症)，甚至低于1，000个寄生物/μ 1，或低于500个寄生物/μ I以及甚至以20个寄生物/μ I时检测感染。
【权利要求】
1.一种检测样品中病原体感染的方法，所述方法包括: -用两种或更多种染料染色所述样品，所述两种或更多种染料包括主要染色DNA的至少一种染料，以由此在DNA和不同于DNA的至少一种其他细胞组分之间提供差别染色； -如果所述DNA存在于样品中，鉴定包含所述DNA的至少第一染色区，以及包含所述其他细胞组分的至少一个其他染色区； -提取所述第一染色区和所述至少一个其他染色区的结构特征，所述结构特征包括以下中的至少一个:(i)所述第一染色区和一个其他染色区的至少一个的大小和(ii)所述第一染色区和所述至少一个其他染色区关于彼此的位置； -如果第一染色区被鉴定且所述结构特征符合预定为表征可疑病原体的结构特征，则确定指示所述身体样品中的所述可疑病原体的存在的值或值的组合。
2.如权利要求1所述的方法，其中至少一种其他染料主要染色除了DNA外的细胞组分。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一种其他染料主要染色选自由以下组成的组的细胞组分:RNA、蛋白质、脂质、膜、细胞质、核糖体、碳水化合物、葡聚糖、糖蛋白、内质网、或其任何组合。
4.如权利要求1至3的任一项所述的方法，其中所述一种或更多种染料对细胞类型是非特异的。
5.如权利要求1至4的任一项所述的方法，其中所述一种或更多种染料选自由以下组成的组:吖啶橙(AO)、Hoechst家族、结晶紫、DAP1、伊红、溴化乙锭、碘化丙锭、SYBR家族、YOYO, Τ0Τ0、苏木精、番红、DRAQ-家族、SYTO家族。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述第一染色区由Hoechst染色来提供且所述第二染色区由AO来提供。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述Hoechst染色由选自由以下组成的组的Hoechst着色剂来提供:Hoechst 33258,Hoechst 33342、Hoechst34580、Hoechst S769121。
8.如权利要求1至7的任一项所述的方法，其中所述样品为身体样品。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述身体液体样品选自由以下组成的组:血液、唾液、精液、汗液、痰、阴道分泌物、粪便、乳汁、泪液、鼻涕。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述身体液体样品选自由以下组成的组:全血样品和红细胞样品。
11.如权利要求1至10的任一项所述的方法，其中所述病原体是携带DNA的病原体。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述病原体是寄生物。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述寄生物是原生动物。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述原生动物选自由以下组成的组:锥虫属物种(Trypanosoma species)、利什曼原虫属物种(Leishmania species)、痕原虫属物种(Plasmodium species)、弓形虫(Toxoplasma gondii)、和巴贝斯虫属物种(Babesiaspecies)。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述原生动物为引起人类疟疾的疟原虫属物种且选自由以下组成的组:恶性痕原虫(P.falciparum)、间日痕原虫(P.vivax)、卵形痕原虫(P.0vale)和三日痕原虫(P.malariae)。
16.如权利要求1至15的任一项所述的方法，其中提取结构特征包括选择所述样品中包括所述第一染色区和所述一个其他染色区的染色的对象，以及对于所述染色的对象，如果 -鉴定了第一染色区，且 以下的至少一个出现: i)所述第一染色区邻接或位于所述一个其他染色区的边界内；以及 ?)所述第一染色和所述一个其他染色的至少一个的大小在预定的范围内， 则确定指示所述样品中可疑病原体的存在的值或值的组合。
17.如权利要求1至16的任一项所述的方法，其中提取结构特征包括选择包括所述第一染色区和所述第二染色区的染色的对象，且如果对于所述染色的对象，鉴定了第一染色区且所述第一染色区的大小满足关于所述一个染色区的大小的预定的关系，则确定指示所述样品中可疑病原体的存在的值或值的组合。
18.如权利要求1至17的任一项所述的方法，其中所述病原体为疟原虫，并且提取结构特征包括选择包括至少所述第一染色区的染色的对象，且如果所述第一染色区的面积在0.2 μ m2至20 μ m2的范围内，则确定指示所述样品中疟原虫的存在的值或值的组合。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述病原体为疟原虫，并且提取结构特征包括选择包括所述第一染色区和一个其他染色区的染色的对象且如果所述一个其他染色区的面积在0.8 μ Hi2至65 μ Hi2的范围内，则确定所述样品中疟原虫的存在。
20.如权利要求1至19的任一项所述的方法，其中所述病原体为疟原虫，并且所述提取结构特征包括选择包括所述第一染色区和所述一个其他染色区的染色的对象，且如果所述第一染色区占据所述一个其他染色区的12%至60%，则确定所述样品中疟原虫的存在。
21.如权利要求1至20的任一项所述的方法，其中所述提取结构特征包括选择包括所述第一染色区和所述一个其他染色区的染色的对象，且如果所述第一染色区和所述一个其他染色区具有预定的形状，则确定所述生物样品中可疑病原体的存在。
22.如权利要求1至21的任一项所述的方法，其中所述提取结构特征包括选择包括所述第一染色区和所述一个其他染色区的染色的对象，且如果所述第一染色区包括染色强度中的差异性，则确定所述样品中可疑病原体的存在。
23.如权利要求1至22的任一项所述的方法，其中所述提取结构特征包括选择包括所述第一染色区和所述一个其他染色区的染色的对象，且如果所述染色的对象的运动模式对应与所述可疑病原体相关的预定的模式，则确定所述样品中可疑病原体的存在。
24.如权利要求1至23的任一项所述的方法，其中所述提取结构特征包括选择包括所述第一染色区和所述一个其他染色区的染色的对象，以及如果在所述染色的对象的运动期间所述第一染色区维持在所述一个其他染色区的边界内，则确定所述样品中可疑病原体的存在。
25.如权利要求1至24的任一项所述的方法，所述方法包括获取所述染色的对象的一个或更多个光学图像，以及从所述一个或更多个光学图像提取所述结构特征。
26.—种试剂盒，所述试剂盒包括: -第一染料，所述第一染料主要染色DNA ； -第二染料，所述第二染料用于染色不同于DNA的至少一种其他细胞组分； -说明书，所述说明书用于所述第一染料和所述第二染料用于确定样品中可疑病原体的存在的使用。
27.如权利要求26所述的试剂盒，所述试剂盒用于在进行权利要求1至25的任一项所述的方法中使用。
28.如权利要求26或27所述的试剂盒，其中所述第一染料包括Hoechst染料。
29.如权利要求26至28的任一项所述的试剂盒，其中所述第二染料包括吖啶橙。
30.如权利要求28或29所述的试剂盒，所述试剂盒包括用于为所述身体样品以50:1至1:1之间的范围比提供所述第一染料和所述第二染料的说明书。
31.一种系统，所述系统包括: -图像采集组件，所述图像采集组件被配置和可操作以获取样品中的染色区的至少一个光学图像，所述染色区包括主要相应于DNA的第一染色区和相应于不同于DNA的至少一种其他细胞组分的至少一个其他染色区； -图像处理单元，所述图像处理单元被配置以 i)提取所述至少第一染色区和所述一个其他染色区的结构特征，所述结构特征包括以下中的至少一个:(i)所述第一染色区、和(ii) 一个其他染色区的至少一个的大小；以及所述第一染色区和所述一个其他染色区关于彼此的位置；以及 ii)如果第一染色区被鉴定且所述结构特征符合预定为表征病原体感染的结构特征，则确定指示所述身体样品中可疑病原体的存在的值或值的组合。
32.一种用于鉴定样品中的病原体的处理单元，所述处理单元包括: -输入模块，所述输入模块被配置和可操作以接收相应于所述样品中的染色的对象的数据，所述样品中的染色的对象包括主要相应于DNA的至少第一染色区和包括另一种细胞组分的至少一个其他染色区，以及 -图像处理单元，所述图像处理单元被配置和可操作以处理相应于所述染色的对象的所述数据，所述处理包括: -提取所述染色的对象中的所述至少所述第一染色区和第二染色区的结构特征，所述结构特征包括以下中的至少一个:(i)所述第一染色区和所述一个其他染色区的至少一个的大小，和(ii)所述第一染色区和所述一个其他染色区关于彼此的位置；以及 -如果所述结构特征符合预定为表征可疑病原体的结构特征，则提供指示所述身体样品中所述可疑病原体的存在或不存在的值或值的组合。
33.一种机器可读的程序存储装置，所述程序存储装置可触知地实现由所述机器可执行的指令的程序以进行检测样品中的病原体感染的方法，所述方法包括: -用一种或更多种染料染色所述身体液体样品，所述一种或更多种染料提供至少DNA和不同于DNA的至少一种其他细胞组分的差别染色； -鉴定主要相应于DNA的至少第一染色区和相应于不同于DNA的至少一种其他细胞组分的至少一个其他染色区； -提取所述至少第一染色区和所述一个其他染色区的结构特征，所述结构特征包括至少(i)所述第一染色区和一个其他染色区的至少一个的大小和(ii)所述第一染色区和所述一个其他染色区关于彼此的位置； -如果所述结构特征符合预定为表征病原体感染的结构特征，则确定指示所述身体样品中病原体的存在的值或值的组合。
34.一种计算机程序产品，所述计算机程序产品包括计算机可用介质，所述计算机可用介质在其中具有实现的计算机可读程序代码，所述计算机可读程序代码用于在以一种或更多种染料染色的样品身体样品中检测病原体感染，所述计算机程序产品包括: 导致所述计算机鉴定所述样品内的染色的对象的计算机可读程序代码； 导致所述计算机鉴定所述染色的对象中主要相应于DNA的至少第一染色区和相应于不同于DNA的至少一种其他细胞组分的至少一个其他染色区的计算机可读程序代码；导致所述计算机提取所述至少第一染色区和一个其他染色区的结构特征的计算机可读程序代码，所述结构特征包括以下中的至少一个:(i)所述第一染色区和一个其他染色区的至少一个的面积和(ii)所述第一染色区和所述一个其他染色区关于彼此的位置； 导致所述计算机如果所述结构特征符合预定为表征可疑病原体感染的结构特征，则确定指示所述身体样品中所述可疑病原体的存在的值或值的组合的计算机可读程序代码。
【文档编号】G01N33/52GK104169719SQ201280070778
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2012年12月27日 优先权日:2011年12月29日
【发明者】约瑟夫·乔尔·波拉克, 丹尼尔·莱夫纳, 约纳坦·毕鲁, 阿尔农·亚芬, 诺姆·约拉夫-拉斐尔, 尤沃·格林菲尔德 申请人:赛特诊断有限公司