专利名称：牛病毒性腹泻病毒抗体快速检测试纸条及其制备方法
技术领域：
本发明涉及动物病毒学和动物传染病学领域，具体是一种用于检测牛病毒性腹泻病毒抗体的快速检测试纸条及其制备方法。
背景技术：
牛病毒性腹湾(Bovine viral diarrhoea, BVD)又称为牛病毒性腹湾/粘膜病(Bovine viral diarrhoea-mucosal disease, BVD-MD),是由牛病毒性腹湾病毒(Bovineviral diarrhoea virus,BVDV)引起的主要发生于牛的一种接触性传染病。BVDV与猪痕病毒(classical swine fever virus, CSFV)、羊边界病病毒(border disease virus’BDV)及部分未分类痕病毒同属于黄病毒科痕病毒属，均为单股正链RNA病毒。痕病毒属成员中的病毒过去被认为是宿主特异性的，但后来的研究表明BVDV与BDV可以感染更广泛的宿主，它们不但可以感染牛和羊，并且可以感染包括猪在内的多种偶蹄类动物。目前，BVD广泛分布于世界各国，如美国血清学阳性率约50%，加拿大82%，澳大利亚89%，法国76%，英格兰54% 74%，芬兰大于50%，瑞士 78% 80%，印度17.3%，南美6国(巴西、智利、阿根廷、哥伦比亚、乌拉圭和秘鲁)阳性率达84%。该病在我国绝大多数省份均有报道，在部分地区，BVDV血清抗阳性率达80%以上。在国际动物贸易中，很多国家规定BVD是必须检疫的动物疫病之一。BVD的广泛存在严重影响着动物养殖业的健康发展和国际动物贸易，造成巨大的经济损失。BVDV引起的牛病毒性腹泻-黏膜病迄今尚无有效的治疗方法，且疫苗预防效果不理想。BVDV可以造成免疫耐受和持续性感染，这给该病的检疫带来了很大的困难。目前，检测BVD的方法主要为病毒分离、中和试验、琼脂扩散试验，这些方法操作繁琐、费时。RT-PCR方法虽然特异性和敏感性都很高，但需要专门的仪器设备和技术人员，只能用于实验室检测。因此，这些方法均不适用于现场检测和基层兽医诊断部门临床检测。另外，由于BVDV可造成持续感染，这给BVDV临床检测带来了很大的困难。因此，建立BVDV抗体快速检测方法，用于BVDV抗体的快速检测和现场检测，有利于对感染BVDV的动物进行及时的清除，达到种群净化的目的，有利于动物养殖业的健康发展。胶体金免疫层析试纸条(immunochromatographic strip)是20世纪90年代初期的发展起来的一种快速免疫学检测方法，该方法的核心技术是以条状纤维层析材料(常用硝酸纤维素膜、尼龙膜等)为固相载体。用胶体金标记的蛋白质作为探针，在吸水垫的作用下，通过毛细作用使样品溶液反应物和胶体金标记物在固相载体以一定的速度向一端定向移动泳动(Lateral flow)。通过在硝酸纤维素上形成的检测线和对照线来判定结果。这种检测方法具有快速、方便、特异、敏感、安全等特点。本发明是用基因工程表达的截短的BVDV NS蛋白抗原、胶体金标记的链球菌G蛋白(SPG)、硝酸纤维素膜等为主要材料，建立BVDV抗体免疫层析试纸检测方法并制备BVDV抗体快速检测试纸条，可以用于BVDV抗体的快速检测和现场检测，解决目前国内缺乏BVDV抗体快速检测和现场检测方法和检测工具的现状。
发明内容
本发明的目的在于克服BVDV抗体现有检测方法的不足，提供一种具有敏感性高、特异性强、检测快速、操作方便BVDV抗体检测方法。如图1所示，牛病毒性腹泻病毒抗体免疫层析快速检测试剂纸条由背衬⑴、硝酸纤维素膜(2)、金标复合物垫(3)、样品垫(4)、吸水垫(5)、检测线(6)和对照线(7)组成。本发明是通过以下技术方案实现的:1、BVDV NS蛋白抗原表位分析及目的基因的扩增:通过检索BVDV NS蛋白序列(NP_776266)，利用在线软件对其主要抗原表位进行分析，确定选择抗原表位位于NS3蛋白中第165 425氨基酸，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID N0.1，其对应的核苷酸序列为GeneBank公布的BVDV基因组序列(NC_001461.1)中第4286 5068位核苷酸。并根据该核苷酸序列设计特异性引物，在引物5'端人工添加LIC粘性末端。用RT-PCR方法从BVDV基因组中扩增该片段，并进行DNA测序。2、PET52/LIC-BVDV NS重组表达载体的构建:用T4DNA聚合酶处理的上述PCR产物，并与商品化线性pET52/LIc载体连接，构建pET52/LIC-BVDV NS重组表达载体。通过PCR方法鉴定和DNA测序分析对构建的表达载体进行鉴定。3、BVDV NS重组蛋白的表达和纯化:将经鉴定为DNA序列无突变的重组表达载体PET52/LIC-BVDV NS转化(DE3)pLacI E.coli感受态细胞，在IPTG诱导下，进行蛋白表达，用SDS-PAGE和Western blot分析表达产物，并用相关病毒阳性血清与表达产物进行Western blot试验,分析表达的物特异性。使用6 XHis标签融合蛋白纯化试剂盒对表达产物进行纯化。4、金标复合物的制备垫:采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，调胶体金溶液的PH值为6.5，冷却至室温后。采用室温搅拌法将适量SPG溶液加入胶体金溶液中进行标记，用卵白蛋白(OVA)进行封闭，标记结束后，采用差速离心对标记物进行纯化，用XYZ3050点样平台将胶体金标记的SPG溶液喷于玻璃纤维棉上，制作成金标复合物垫。5、兔抗SPG的制备:用SPG免疫2月龄家兔，制备兔抗SPG多克隆抗体，用蛋白A/G抗体纯化试剂盒从多克隆抗体中纯化IgG，作为对照线试剂。6、检测线和对照线的制备:首先将硝酸纤维素膜粘贴于背衬表面，再将浓度为lmg/mL的BVDV NS3重组蛋白溶液和浓度为1.5mg/mL的兔抗SPG抗体分别点在硝酸纤维膜上，作为检测线和对照线试剂。7、试纸条的组装和切割:按图1所示，将背衬(I)和已点样检测线和对照线的硝酸纤维膜(2)、金标垫(3)、样品垫(4)、吸水垫(5)粘在一起，并于CM4000切条机中，将其切成3mm宽的试纸条，于4°C干燥保存备用。8、试纸条的特异性、敏感性分析:用试纸条分别检测份BVDV (I型和2型)标准阳性血清样品、其它相关病毒(CSFV、AKV、BRV、O型FMDV)阳性血清样品及阴性对照样品。结果表明试纸条检测BVDV(1型和2型)标准阳性血清样品时为阳性反应，与其它病毒阳性血清及阴性对照样品时均为阴性。用试纸条检测5份系列稀释的BVDV阳性血清样品，同时用进口 ELISA试剂盒作对照，结果显示试纸条检测5份样品抗体滴度与ELISA检测结果相当。9、试纸条与进口试剂盒检测之间比对:用试纸条和进口 ELISA试剂盒同时检测临床血清样品568份。根据检测结果计算得出，试纸条特异性为99.24，敏感性为98.69%，试纸条和ELISA试剂盒检测结果之间的符合率为98.94%。本发明的特点和优点:本发明所制备的基因工程表达的截短的BVDV NS蛋白，具有与BVDV抗体特异性结合的活性，并且不与相关病毒阳性血清发生反应。表明基因工程表达的BVDV NS蛋白可以用于建立BVDV抗体免疫学检测方法。利于基因工程表达的截短的BVDV NS蛋白和胶体金标记的SPG作为主要材料，建立BVDV抗体检测试纸条，与国外进口 ELISA试剂盒相比，该试纸条具有良好的特异性和敏感性，两种方法检测结果符合率为98.69%。该试纸条具有检测快速、操作简便、不需要专门的仪器设备和专业技术人员。另外，该试纸条易于保存和运输，使用检测样品量小，检测成本较低，操作安全，不造成环境污染。因此该方法特别适用于BVDV抗体现场检测、基层兽医诊断部门临床检测和养殖企业自行检测等。该试纸条的研制，为BVDV抗体检测、BVD检疫和BVD流行病学调查提供良好的工具。
四
图1为牛病毒性腹泻病毒抗体快速检测试纸条结构示意图1:背衬，2:硝酸纤维素膜，3:金标复合物垫，4:样品垫，5:吸水垫，6:检测线，7:对照线。
五具体实施方式
:实施例1:截短的BVDVNS3蛋白的表达(I)BVDV NS蛋白抗原表位分析及目的蛋白的筛选:通过检索BVDV NS蛋白序列(NP_776266)，利用在线软件对其主要抗原表位进行分析，选择抗原表位位于NS3蛋白中第165 425氨基酸作为目的蛋白片段，其序列为序列表中SEQ ID N0.1。其对应的核苷酸序列为GeneBank公布的BVDV基因组序列(NC_001461.1)中第4286 5068位核苷酸。(2)NS引物的设计:根据GeneBank公布的BVDV基因组序列(N0.NCOO1461.1)基因片段第4286 5068位核苷酸序列，设计了扩增BVDV NS3基因的特异性引物，在引物的5'端添加LIC粘性末端。引物序列如下:上游引物(Pl):5/ -CAGGGACCCGGT-CTGCCTACCTATGAATTGG-3'下游引物(P2):5/ -GGCACCAGAGCGTT-AGCACAAGCACAGTATCTG-3'(3) BVDV核酸提取:使用病毒RNA提取试剂盒(Invitrogen公司产品)从BVDVOregon株细胞培养上清中提出病毒RNA。(4)RT-PCR扩增BVDV NS基因:用一步法RT-PCR试剂盒(Takara公司产品)，从BVDVRNA中扩增目的基因片段。在PCR管中加入以下组分:IOxRT-PCR 缓冲液5pL
MgCl2 (25 mmol/L)ΙΟμ
dNTP (各 lOmmol/L)5μ
RNase 抑制剂(40U/pL)lμL
AMV 反转录酶(5U/pL)Ιμ
Taq (5υ/μ )Ιμ
Pl (20μηιο1/υΙμ
Ρ2 (20μιηο1/ω\μΙ
病毒RNA8μ
无RNA酶水17μ
总体积50μ 将上述组分混合后置于PCR仪中，进行扩增。反应程序为:45°C反转录30min ；95°C予页变性 5min ;95°C lmin, 55°C Imin, 72°C lmin, 30 个循环,72°C IOmin0 经琼脂糖凝胶电泳分析，PCR扩增产物约为783bp，用DNA快速回收试剂盒回收PCR产物。将PCR产物送到TAKARA公司进行DNA序列测定,其序列为序列表中SEQ ID N0.2。(5)重组表达载体的构建和鉴定:用T4DNA聚合酶对PCR产物进行处理，依靠T4DNA聚合酶外切酶活性，切去3丨端约11-12个碱基，即形成与LIC位点序列互补的粘性末端。反应体系如下:
PCR产物(纯化)ΙΟμ
10ΧΤ4 DNA聚合酶缓冲液2μ
dATP (25mmol/L)2μL
DTT (10mmol/L)1μΙ>
Τ4 DNA 聚合酶(2.5 υ/μ )0.4μ
无DNA酶/RNA酶水4.6μ
总体积ΙΟμ 将上述反应物混合后，于22°C反应30min，然后于75°C反应20min。在1.5mL离心管中，加入线性PET52/LIC质粒I μ L、经T4DNA聚合酶处理的PCR产物2 μ L和25mmol/LEDTALy 1，混合后，于22°C反应5min。取上述反应物I μ L转化NovaBlue E.coli感受态细胞(Invitrogen公司产品)，冰浴5min，42°C热激30s，冰浴2min。加入250 μ L SOC液体培养基，37°C震荡(250r/min)培养60min后，5，000r/min离心5min,弃去400 μ L上清，用加样器吹打数次，重悬菌体后涂布含Ampicillin (50 μ g/mL)的LB平板上，37°C培养12h后，随机挑取6个单菌落，分别接种至3mL含Ampicillin (50 μ g/mL)的LB培养液中，37°C震荡培养过夜。取1.5mL培养物，用质粒DNA提取试剂盒(TARAKA公司产品)提取质粒DNA，用该DNA作为模板，进行PCR鉴定。PCR反应体系如下:IOXPCR 缓冲液2.5μ
Pl (20μιηο1/υΙμ
Ρ2 (20μιηο1/υΙμ
dNTP (2μιηο1/υ 质粒DNAΙμ
Taq0.5pL
水18μ
总体积25pL反应程序为:95°C预变性 5min ;95°C lmin, 55 °C lmin, 72 °C lmin，30 个循环，72°C IOmin0 PCR反应结束后，取8 μ LPCR产物进行电泳分析。并将PCR产物送至TAKARA公司进行DNA序列测定。基因序列为序列表中SEQ ID N0.2。(6)BVDV NS蛋白在原核细胞中的表达及鉴定:将上述经鉴定含有DNA序列无突变的重组表达载体PET52-BVDV NS的菌株扩大培养后，用质粒提取试剂盒(TARARA公司产品)提出质粒DNA,并转化(DE3)pLacI E.coli感受态细胞(Invitrogen公司产品)，涂于含Ampicillin (50 μ g/mL)的LB固体培养基，37°C培养12 16h，挑取6个单菌落，接种于5mL LB培养基，于37°C震荡培养2h后，加入IPTG (终浓度为lmmol/L)进行诱导表达BVDVNS蛋白。收集上述菌液,5000r/min离心IOmin,取上清,加入原体积约1/10的PBS(pH7.2),用超声波破碎仪对菌体进行破碎处理。经SDS-PAGE分析，表达产物大小约为35KD。用牛抗BVDV阳性血清和HRP标记的兔抗牛IgG(SIGMA公司产品)进行Western blot分析，结果表明表达产物可以和BVDV阳性血清反应。用猪瘟病毒(CSFV)、赤羽病病毒(AKV)、边界病病毒(BDV)、O型口蹄疫病毒(FMDV O)、蓝舌病病毒(BTV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)阳性血清进行Western blot分析时,结果表明表达产物不与其反应,表明该表达产物特异性良好。(7) BVDVNS蛋白的纯化:使用6 XHis标签融合蛋白纯化试剂盒对表达BVDVNS表达产物进行纯化，用核酸/蛋白分析仪检测蛋白浓度，并用50mmol/LPBS(pH7.2)将其蛋白浓度调至lmg/mL。实施例2:胶体金标记试纸条的制备(I)胶体金的制备及胶体金标记SPG:采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液。向99mL三蒸水中加入ImL I %氯金酸溶液,加热至沸腾,迅速加入2.4mL新鲜配制的1.05%(m/v)柠檬酸三钠溶液，并充分混匀，继续加热约5 lOmin，溶液颜色由蓝色变为红色即可。冷却至室温后，用0.22 μ m滤膜过滤。首先用I %碳酸钠溶液调胶体金溶液的pH值为
6.5。向50mL胶体金溶液中缓慢地加入20 μ L浓度为lmg/mL的SPG溶液，室温搅拌30min，缓慢加入10%卵白蛋白(OVA)至其终浓度为10mg/mL，继续搅拌30min。4，000r/min离心IOmin,将上清转移至另一离心管中，12, 000r/min离心30min,小心弃去上清。用5mL(即1/10原体积)50mmol/L PBS(pH7.2)重悬沉淀。加入1% (w/v)的叠氮钠(NaN3)溶液至终浓度为0.02%。(2)金标复合物垫的制备:用XYZ3050点样平台将胶体金标记的SPG溶液喷于300mmX 5mm玻璃纤维棉上，速度为50 μ L/cm,并于4°C真空抽干。(3)兔抗SPG多克隆抗体的制备及IgG纯化:用SPG免疫2月龄家兔，每隔2周免疫I次，共免疫3次，注射剂量分别为Img/只、Img/只和2mg/只。首免时加等体积弗氏完全佐剂乳化，二免和三免时加等体积弗氏不完全佐剂乳化。三免后15d，颈静脉采血并分离血清，56°C水浴作用30min。用蛋白A/G抗体纯化试剂盒(Pierce公司产品)从兔血清中纯化抗SPG IgG，用DU-800核酸/分析蛋白分析仪测定蛋白含量，用50mmol/L PBS (pH7.2)稀释至1.5mg/mL。(4)检测线和对照线的制备:首先将硝酸纤维素膜(35mm X 300mm)粘贴于背衬(70mmX 300mm)正中表面，用基因工程表达的BVDV NS蛋白(lmg/mL)和兔抗SPGIgGd.5mg/mL)分别作为检测线和对照线试剂。将两种试剂分别点在硝酸纤维膜上，点样速度为0.75 μ L/cm。点样时，检测线位于硝酸纤维素膜中线，对照线与检测线之间距离为5mm。371:干燥211，41:密封保存备。(5)试纸条的组装和切割:按图1所示，将背衬(I)和已点样检测线(6)和对照线(7)试剂的硝酸纤维膜(2)、金标垫(3)、样品垫(4)、吸水垫(5)粘在一起，压实后，于CM4000切条机中，将其切成3_宽的试纸条。(6)试纸条的反应原理、结果判定标准和检测步骤:制备试纸条时，将胶体金标记的SPG固定于金标复合物垫上，检测线为基因工程表达的BVDV NS蛋白，对照线为兔抗SPGIgG。检测时，阳性样品中的IgG与胶体金标记SPG结合，形成G-SPG-1gG复合物，在吸水垫的作用下，该复合物在硝酸纤维膜上向吸水垫端移动，若样品中含有BVDV抗体，则BVDV抗体会与检测线上的BVDV NS蛋白特异性结合，胶体金颗粒聚集于此，形成红色的条带，即检测线。相反，若样品中不含BVDV抗体，则G-SPG-1gG复合物不与检测线试剂BVDV NS蛋白结合而继续向吸水垫端移动，并与对照线试剂兔抗SPG结合，形成红色条带，即对照线。无论样品中是否含有BVDV抗体，G-SPG-1gG复合物均能与对照线试剂结合，形成对照线。在判定结果时，若检测线和对照线同时显红色，则为阳性，若检测线不显色，对照线显红色，则为阴性。若检测线和对照线均不显色或检测线显红色且对照线不显色，均为无效结果，需更换试纸条重新检测。检测时，将试纸条平放于实验台上，取100μ L用50mmol/LPBS(ph7.2)作10倍稀释的样品加于样品垫上，室温静置反应，在15min内进行结果判定。实施例3:试纸条的特异性、敏感性和符合率试验(I)试纸条的特异性:用试纸条分别检测份BVDV(I型和2型)标准阳性血清样品、其它相关病毒包括猪瘟病毒(CSFV)、赤羽病病毒(AKV)、边界病病毒(BDV)、0型口蹄疫病毒(FMDV O)、蓝舌病病毒(BTV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)阳性血清样品及阴性对照样品。结果显示试纸条检测BVDV(1型和2型)标准阳性血清样品时为阳性反应，与其它病毒阳性血清及阴性对照样品时均为阴性。表明试纸条特异性良好。(2)试纸条的敏感性:用试纸条检测5份系列稀释的BVDV阳性血清样品(编号为I 5)，同时用进口 ELISA试剂盒作对照，结果显示试纸条检测5份样品抗体滴度分别为 I: 512,1: 512,1: 256,1: 512 和 I: 512，ELISA 检测极限为 I: 256,1: 512、
I: 512,1: 512和1: 512。表明试纸条与ELISA检测敏感性相当。(3)试纸条与进口试剂盒检测之间比对:用试纸条和进口 ELISA试剂盒同时检测临床血清样品568份，结果如下表。根据检测结果计算得出，与进口 ELISA试剂盒相比，试纸条特异性为99.24(261/263)，敏感性为98.69% (302/305)，试纸条和ELISA试剂盒检测结果之间的符合率为98.94% [(301+261)/568]。详细数据见表1:表1:临床样品检测结果
权利要求
1.一种用于牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体检测的快速检测试纸条。其特征在于使用了截短的BVDV NS基因工程表达抗原作为检测线试剂。
2.根据权利要求1中所述的，截短的NS片段是通过使用抗原表位分析软件分析后选择长度为261个氨基酸的片段，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID N0.1。
3.根据权利要求1中所述的，截短的BVDVNS抗原是通过对PCR扩增BVDV NS基因片段，该基因片段序列为序列表中SEQ ID N0.2，将扩增的基因片段插入pET52/LIC载体中，构建pET52/LIC-BVDV NS重组表达载体，将载体转化BL21大肠杆菌，进行表达所得到的重组蛋白抗原，该重组抗原可用于BVDV抗体检测。
4.根据权利要求3所述的截短的BVDVNS抗原，是根据其对应的核苷酸序列，设计特异性引物，并在引物的5'端分别加入LIC位点，其序列为序列表中SEQ ID N0.3和SEQ IDN0.4。
5.根据权利要求1中所述的BVDV抗体检测的快速检测试纸条可以用于BVDV抗体的快速检测。
全文摘要
本发明公开了一种用于牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体检测的重组抗原及其快速检测试纸条。其主要针对于BVDV抗体检测的截短的BVDV NS表达抗原和用于检测BVDV抗体的快速检测试纸条。利用抗原表位分析软件，对BVDV NS蛋白氨基酸序列分析，取含有主要抗原表位的片段，根据其对应核苷酸序列设计引物，通过PCR扩增、重组表达载体构建和原核表达，获得了截短BVDV NS重组抗原，纯化后可用于BVDV抗体检测。基于截短的BVDVNS抗原建立的快速检测试纸条，该试纸条具有操作方便、检测快速，且不需专门实验室和设备等优点，克服了现有检测方法的局限，可用于BVDV抗体的快速检测和血清流行病学调查。
文档编号G01N33/68GK103197082SQ20131013606
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月16日 优先权日2013年4月16日
发明者杨俊兴, 花群义, 曹琛福, 张彩虹, 吕建强, 卢体康, 孙洁, 陈兵, 阮周曦, 秦智锋, 刘建利, 胡运发, 唐金明 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心