血浆中肌苷含量的测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种测定人体血浆中肌苷含量的方法，它包括如下步骤：（a）在人体空白血浆250ul中加入肌苷标准品溶液25ul，配制成至少五份不同浓度的肌苷血浆溶液，再分别加入0.1ug/ml拉米夫定标准液25ul和4.25%磷酸溶液250ul，涡流混合，得混合溶液；将所述混合溶液分别加入经活化的HLB固相萃取柱中进行洗脱，弃洗脱液，再用1ml流动相溶液洗脱，收集洗脱液，离心，取上清液；（b）将经步骤（a）制得的上清液在特定的质谱和色谱条件下进行LC/MS/MS分析（c）基于步骤（b）的分析结果，用同样的方法建立当日的标准曲线及定量下限进行计算，得到待测人体血浆中的肌苷含量。
【专利说明】血浆中肌苷含量的测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学检测领域，特别是涉及一种人体血浆中肌苷含量的测定方法。
【背景技术】
[0002]肌苷(Inosine)，也称为次黄苷、次黄嘌呤核苷等。肌苷是人体的正常成分，为腺嘌呤的前体，能直接透过细胞膜进入体细胞，参与体内核酸代谢、能量代谢和蛋白质的合成。
[0003]研究证实:肌苷能活化丙酮酸氧化酶系，提高辅酶A的活性，活化肝功能，并使处于低能缺氧状态下的组织细胞继续进行代谢，有助于受损肝细胞功能的恢复。并参与人体能量代谢与蛋白质合成。肌苷能提高ATP水平并可转变为各种核苷酸。可刺激体内产生抗体，还可提高肠道对铁的吸收，活化肝功能，加速肝细胞的修复。有增强白细胞增生的作用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的旨在提供一种建立人体血浆肌苷LC/MS/MS测定标准曲线及定量下限的方法。
[0005]本发明的另一目的是提供一种测定人体血浆中肌苷含量的方法。
[0006]具体地说，本发明第一方面是提供了一种建立人体血浆肌苷LC/MS/MS测定标准曲线及定量下限的方法，它包括如下步骤:
[0007](a)在人体空白血浆250ul中加入肌苷标准品溶液25ul，配制成至少五份不同浓度的肌苷血浆溶液，再分别加入0.lug/ml拉米夫定标准液25ul和4.25%磷酸溶液250ul，涡流混合，得至少五份混合溶液；将所述混合溶液分别加入经活化的HLB固相萃取柱中进行洗脱，弃洗脱液，再用Iml流动相溶液50mM CH3COONH2: CH3OH=1:1洗脱，收集洗脱液，离心，取上清液；
[0008](b)将经步骤(a)制得的上清液在下述条件下进行LC/MS/MS分析
[0009]质谱条件:
[0010]Compound (化合物参数):
[0011]肌昔母子离子对:269.1/137.1, time:400msec
[0012]拉米夫定母子离子对:230.2/112.2, time:200msec
[0013]Duration:4min
[0014]Cycles:393
[0015]DP=26
[0016]CE=15
[0017]CXP=4
[0018]CEP=4
[0019]Qlresolution:Unit
[0020]Q2resolution:Unit,
[0021]Source/Gas (离子源 / 气参数):[0022]1n Source:Turbo Spray
[0023]Curtain Gas (CUR):10
[0024]Collision Gas (CAD):Medium
[0025]1n Spray Voltage (IS):5000
[0026]Temperature (TEM):700
[0027]1n Source Gasl (Gasl):60
[0028]1n Source Gas2 (Gas2):10
[0029]Interface Heater (ihe):0N,
[0030]液相色谱条件:
[0031]色谱柱:WatersXBridge? C18，规格:3.5um，2.1 X 100mm，Part N0.:186003022,S/N:01453030814045
[0032]流动相:50mMCH3COONH2: CH3OH=1:1
[0033]流速:0.2ml/min
[0034]进样量:IOul
[0035]进样时间:4min ；
[0036](c)基于步骤(b)的分析结果，建立人体血浆肌苷LC/MS/MS测定的标准曲线及定量下限。
[0037]在一优选例中，所述步骤(a)中还包括将所述混合溶液_70°C冻存的步骤。
[0038]在另一优选例中，所述不同浓度的肌苷血浆溶液为六份，其浓度分别为18.58ug/ml、37.16ug/ml、74.31ug/ml、148.6ug/ml、297.25ug/ml 和 594.5ug/ml。
[0039]在另一优选例中，所述经活化的HLB固相萃取柱的活化步骤包括:使用VARIAN?VAC ELUT SPS24固相萃取装置，将HLB固相萃取柱插入固定位置，先后使用Iml甲醇、Iml水进行洗脱活化。
[0040]在另一优选例中，所述步骤(c)包括:以待测人体血浆肌苷浓度(X，ug/ml)为横坐标，以待测人体血浆肌苷色谱峰面积(As)与内标色谱峰面积(Ai )的比值(Y=As/Ai )为纵坐标，进行线性回归运算，求得人体血浆肌苷LC/MS/MS测定的标准曲线及定量下限。
[0041]本发明的第二方面是提供了一种测定人体血浆中肌苷含量的方法，它包括如下步骤:
[0042](a)在待测人体血浆250ul中加入0.lug/ml拉米夫定标准液25ul和4.25%磷酸溶液250ul，涡流混合，得混合溶液；将所述混合溶液加入经活化的HLB固相萃取柱中进行洗脱，弃洗脱液，再用Iml流动相溶液50mM CH3COONH2: CH3OH=1:1洗脱，收集洗脱液，离心，取上清液；
[0043](b)将经步骤(a)制得的上清液在下述条件下进行LC/MS/MS分析
[0044]质谱条件:
[0045]Compound (化合物参数):
[0046]肌昔母子离子对:269.1/137.1, time:400msec
[0047]拉米夫定母子离子对:230.2/112.2, time:200msec
[0048]Duration:4min
[0049]Cycles:393[0050]DP=26
[0051]CE=15
[0052]CXP=4
[0053]CEP=4
[0054]Qlresolution:Unit
[0055]Q2resolution:Unit,
[0056]Source/Gas (离子源 / 气参数):
[0057]1n Source:Turbo Spray
[0058]Curtain Gas (CUR):10
[0059]Collision Gas (CAD):Medium
[0060]1n Spray Voltage (IS):5000
[0061]Temperature (TEM):700
[0062]1n Source Gasl (Gasl):60
[0063]1n Source Gas2 (Gas2):10
[0064]Interface Heater (ihe):0N,
[0065]液相色谱条件:
[0066]色谱柱:ffatersXBridge? C18，规格:3.5um, 2.1 X 100mm, Part N0.:186003022,S/N:01453030814045
[0067]流动相:50mMCH3COONH2: CH3OH=1:1
[0068]流速:0.2ml/min
[0069]进样量:IOul
[0070]进样时间:4min ；
[0071](c)基于步骤(b)的分析结果，用所述的建立人体血浆肌苷LC/MS/MS测定标准曲线及定量下限的方法建立当日的标准曲线及定量下限进行计算，得到待测人体血浆中的肌
苷含量。
[0072]在一优选例中，所述步骤(a)中还包括将所述混合溶液_70°C冻存的步骤。
[0073]在另一优选例中，所述经活化的HLB固相萃取柱的活化步骤包括:使用VARIAN?VAC ELUT SPS24固相萃取装置，将HLB固相萃取柱插入固定位置，先后使用Iml甲醇、Iml水进行洗脱活化。
[0074]本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。
【具体实施方式】
[0075]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按
重量计。
[0076]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0077]本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
[0078]实施例1:建立人体血浆肌苷LC/MS/MS测定的标准曲线及定量下限
[0079]一、仪器与试药
[0080]1.仪器:
[0081]I)液质联用仪:AB Sciex3200Q TRAP LC/MS/MS SYSTEM(SER.No:AF22091001)，ABSCIEX公司
[0082]2)固相萃取装置:VARIAN? VAC ELUT SPS24，WATERS 公司
[0083]3)离心机:BECKMAN Avanti?30 Centrifuge (SER.No:GEY95G02)，美国 BECKMAN公司
[0084]4)电子天平:Mettler — AE240双量程分析天平，Mettler公司
[0085]5)漩涡混合器:XW_80，上海医科大学仪器厂
[0086]2.试药、试剂及耗材:
[0087]I)空白血浆(O型Rh阳性，上海市血液中心，批号:20130100000031825)
[0088]2)肌苷标准品(中国药品生物制品检定所，批号:140669-201104)
[0089]3)拉米夫定(葛兰素史克，批号:12040022)
[0090]4)甲醇(色谱纯，Tedia公司，批号:1205441)
[0091]5)氨水(江苏昆山金城实际有限公司，批号:040608)
[0092]6)磷酸(色谱纯，Tedia公司，批号:101026)
[0093]7)乙酸(苏州振亚化工厂，批号:010517)
[0094]8)重蒸水(仁济医院自制)
[0095]9)色谱柱(Waters XBridge? C18,规格:3.5um, 2.1 X 100mm), WATERS 公司
[0096]10)HLB 固相萃取柱:0ASIS? HLB Cartridge (Part N0.WAT094225)，WATERS 公司
[0097]二、HLB固相萃取柱的活化
[0098]使用VARIAN? VAC ELUT SPS24固相萃取装置，将HLB固相萃取柱插入固定位置，先后使用Iml甲醇、Iml水进行洗脱活化，备用。
[0099]三、将空白血浆置于常温水浴5分钟，分别取出250ul放于6个不同的试管中，每个试管分别加入肌苷标准液25ul，依次配成相当于肌苷血浆浓度为18.58ug/ml、37.16ug/ml、74.31ug/ml、148.6ug/ml、297.25ug/ml 和 594.5ug/ml 的样品，并加入 0.lug/ml 拉米夫定标准液25ul，涡旋30秒，再加入4.25%磷酸溶液250ul并涡旋30秒。将6管混合液分别加入之前已完成活化的HLB小柱中，洗脱，洗脱液弃之，再用Iml流动相溶液(50mMCH3COONH2 = CH3OH=1:1)洗脱，此时收集洗脱液。将收集液在4°C下20000rpm高速离心10分钟，取上清液，样品即得。
[0100]以下述质谱、色谱条件进行LC/MS/MS分析
[0101]质谱条件:
[0102]Compound (化合物参数):[0103]肌苷母子离子对:269.1/137.1，time:400msec
[0104]拉米夫定母子离子对:230.2/112.2，time:200msec
[0105]Duration:4min
[0106]Cycles:393
[0107]DP=26
[0108]CE=15
[0109]CXP=4
[0110]CEP=4
[0111]Qlresolution:Unit
[0112]Q2resolution:Unit,
[0113]Source/Gas (离子源 / 气参数):
[0114]1n Source:Turbo Spray
[0115]Curtain Gas (CUR):10
[0116]Collision Gas (CAD):Medium
[0117]1n Spray Voltage (IS):5000
[0118]Temperature (TEM):700
[0119]1n Source Gasl (Gasl):60
[0120]1n Source Gas2 (Gas2):10
[0121]Interface Heater (ihe):0N,
[0122]液相色谱条件:
[0123]色谱柱:ffatersXBridge? C18，规格:3.5um, 2.1 X 100mm, Part N0.:186003022,S/N:01453030814045
[0124]流动相:50mMCH3COONH2: CH3OH=1:1
[0125]流速:0.2ml/min
[0126]进样量:IOul
[0127]进样时间:4min ；
[0128]基于LC/MS/MS分析结果，建立肌苷的标准曲线，即分别以待测物肌苷的浓度(X，ug/ml)为横坐标，以待测物肌苷的色谱峰面积(As)与内标拉米夫定色谱峰面积(Ai)的比值(Y=As/Ai)为纵坐标，进行线性回归运算，求得标准曲线Y=0.0480X-0.0649。肌苷在18.58?594.5ug/ml范围内线性关系良好(r=0.9998)。肌苷的定量下限为18.58ug/ml。
[0129]实施例2:测定人体血浆中的肌苷含量
[0130]一、仪器与试药
[0131]1.仪器:
[0132]I)液质联用仪:AB Sciex3200Q TRAP LC/MS/MS SYSTEM (SER.No: AF22091001)，ABSCIEX公司
[0133]2)固相萃取装置:VARIAN? VAC ELUT SPS24，WATERS 公司
[0134]3)离心机:BECKMAN Avanti?30Centrifuge (SER.No:GEY95G02)，美国 BECKMAN 公司
[0135]4)电子天平:Mettler — AE240双量程分析天平，Mettler公司[0136]5)漩涡混合器:XW_80，上海医科大学仪器厂
[0137]2.试药、试剂及耗材:
[0138]I)空白血浆(O型Rh阳性，上海市血液中心，批号:20130100000031825)
[0139]2)肌苷标准品(中国药品生物制品检定所，批号:140669-201104)
[0140]3)拉米夫定(葛兰素史克，批号:12040022)
[0141]4)甲醇(色谱纯，Tedia公司，批号:1205441)
[0142]5)氨水(江苏昆山金城实际有限公司，批号:040608)
[0143]6)磷酸(色谱纯，Tedia公司，批号:101026)
[0144]7)乙酸(苏州振亚化工厂，批号:010517)
[0145]8)重蒸水(仁济医院自制)
[0146]9)色谱柱(Waters XBridge? C18，规格:3.5um, 2.1 X 100mm), WATERS 公司
[0147]10)HLB 固相萃取柱:0ASIS? HLB Cartridge (Part N0.WAT094225)，WATERS 公司
[0148]二、收集待测人体血浆
[0149]从待测者上臂静脉抽取新鲜血液5ml，将存有新鲜血液的试管插入碎冰中，待所有血液收集完毕，4°C、20000rpm高速离心10分钟，取上清液，得受试者血浆。
[0150]三、待测人体血浆的预处理
[0151]取受试者血浆250ul于1.5mlEP管内，加入0.lug/ml拉米夫定标准液25ul，涡旋30秒，再迅速加入4.25%磷酸溶液250ul，涡旋30秒，得预处理样品。将EP管置于试管架上，放于低温冰箱_70°C冻存。若取血现场没有低温冰箱，可将存有预处理样品的EP管放于试管架上，缓慢放入存有适当容量液氮的泡沫容器内(液氮的液面不宜超过EP管的高度)速冻，存放至少2min。操作过程必须做好防护措施，注意安全。(在相对密闭的操作室内，并带好防冻手套，缓慢放入。)待混合液完全冻干后，将EP管放于充满干冰的泡沫容器中，迅速运至拥有低温冰箱的实验室中_70°C冻存，预处理样品放于干冰的时间不宜超过I天。
[0152]将存于低温冰箱的上述预处理的样品取出，置于室温下水浴溶解lOmin。待完全溶解后将混合液加入之前已完成活化的HLB小柱(同实施例1)中，洗脱，洗脱液弃之，再用Iml流动相溶液(50mM CH3COONH2: CH3OH=1:1)洗脱，并收集。将收集液在4°C下20000rpm高速离心10分钟，取上清液，即得。
[0153]四、检测待测人体血浆中的肌苷含量
[0154]以上述质谱、色谱条件(同实施例1)进行LC/MS/MS分析，按实施例1的方法建立当日的标准曲线及定量下限进行计算，得到待测人体血浆中的肌苷含量。
[0155]实施例3:本发明的肌苷测定方法的方法学验证
[0156]3.1.专属性
[0157]分别取6份不同健康人的空白血浆各250ul，除不加内标拉米夫定溶液25ul而改用甲醇水溶液25ul以外，其余按实施例2的方法操作；取一定浓度的肌苷标准液25ul替代加入空白血浆，其余按实施例2的方法操作；取受试者给药后的血浆样品，按实施例2的方法处理。结果表明，在选用条件下，血浆中内源性物质不干扰被测物和内标的测定，专属性良好。
[0158]3.2.精密度和准确度
[0159]按实施例1的方法制备血衆浓度为28.5ug/ml、57ug/ml、228ug/ml的质控样品，每个浓度进行6份样本分析，连续测定3d，根据当日标准曲线，计算QC样品测得的浓度。根据QC样品结果计算本法的精密度和准确度，结果表明，日间、日内相对标准差(RSD)〈15%，准确度均在85%?115%范围内。表明血浆样品分析的精密度和准确度良好。详见表I。
[0160]表1.肌苷测定方法的精密度与准确度(n=6)
[0161]
【权利要求】
1.一种建立人体血浆肌苷LC/MS/MS测定标准曲线及定量下限的方法，其特征在于，它包括如下步骤: (a)在人体空白血浆250ul中加入肌苷标准品溶液25ul，配制成至少五份不同浓度的肌苷血浆溶液，再分别加入0.lug/ml拉米夫定标准液25ul和4.25%磷酸溶液250ul，涡流混合，得至少五份混合溶液；将所述混合溶液分别加入经活化的HLB固相萃取柱中进行洗脱，弃洗脱液，再用Iml流动相溶液50mM CH3COONH2:CH3OH=1:1洗脱，收集洗脱液，离心，取上清液； (b)将经步骤(a)制得的上清液在下述条件下进行LC/MS/MS分析 质谱条件: Compound (化合物参数): 肌音母子离子对:269.1/137.1，time:400msec 拉米夫定母子离子对:230.2/112.2，time:200msec
Duration:4min
Cycles:393
DP=26
CE=15`
CXP=4
CEP=4
Qlresolution:Unit
Q2resolution:Unit， Source/Gas (离子源/气参数):
1n Source:Turbo Spray
Curtain Gas (CUR):10
Collision Gas (CAD):Medium
1n Spray Voltage (IS):5000
Temperature (TEM):700
1n Source Gasl (Gasl):60
1n Source Gas2 (Gas2):10
Interface Heater (ihe):0N， 液相色谱条件:
色谱柱:Waters XBridge? C18，规格:3.5um，2.1 X 100mm，Part N0.: 186003022，S/N:01453030814045
流动相:50mM CH3COONH2: CH3OH=1:1
流速:0.2ml/min
进样量:10ul
进样时间:4min ； (c)基于步骤(b)的分析结果，建立人体血浆肌苷LC/MS/MS测定的标准曲线及定量下限。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中还包括将所述混合溶液-70°C冻存的步骤。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述不同浓度的肌苷血浆溶液为六份，其浓度分别为 18.58ug/ml、37.16ug/ml、74.31ug/ml、148.6ug/ml、297.25ug/ml 和594.5ug/ml。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述经活化的HLB固相萃取柱的活化步骤包括:使用VARIAN? VAC ELUT SPS24固相萃取装置，将HLB固相萃取柱插入固定位置，先后使用Iml甲醇、Iml水进行洗脱活化。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(c)包括:以待测人体血浆肌苷浓度(X，ug/ml)为横坐标，以待测人体血浆肌苷色谱峰面积(As)与内标色谱峰面积(Ai )的比值(Y=As/Ai)为纵坐标，进行线性回归运算，求得人体血浆肌苷LC/MS/MS测定的标准曲线及定量下限。
6.一种测定人体血浆中肌苷含量的方法，其特征在于，它包括如下步骤: Ca)在待测人体血浆250ul中加入0.lug/ml拉米夫定标准液25ul和4.25%磷酸溶液250ul，涡流混合，得混合溶液；将所述混合溶液加入经活化的HLB固相萃取柱中进行洗脱，弃洗脱液，再用Iml流动相溶液50mM CH3COONH2: CH3OH=1:1洗脱，收集洗脱液，离心，取上清液； (b)将经步骤(a)制得的上清液在下述条件下进行LC/MS/MS分析 质谱条件: Compound (化合物参数)·: 肌昔母子离子对:269.1/137.1, time:400msec 拉米夫定母子离子对:230.2/112.2，time:200msec
Duration:4min
Cycles:393
DP=26
CE=15
CXP=4
CEP=4
Qlresolution:Unit
Q2resolution:Unit, Source/Gas (离子源/气参数):
1n Source:Turbo Spray
Curtain Gas (CUR):10
Collision Gas (CAD):Medium
1n Spray Voltage (IS):5000
Temperature (TEM):700
1n Source Gasl (Gasl):60
1n Source Gas2 (Gas2):10
Interface Heater (ihe):0N, 液相色谱条件:色谱柱:ffaters XBridge? C18,规格:3.5um, 2.1 X 100mm, Part N0.:186003022, S/N:01453030814045
流动相:50mM CH3COONH2: CH3OH=1:1
流速:0.2ml/min
进样量:10ul
进样时间:4min ； (c)基于步骤(b)的分析结果，用如权利要求1所述的方法建立当日的标准曲线及定量下限进行计算，得到待测人体血浆中的肌苷含量。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中还包括将所述混合溶液-70°C冻存的步骤。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述经活化的HLB固相萃取柱的活化步骤包括:使用VARIAN? VAC ELUT SPS24固相萃取装置，将HLB固相萃取柱插入固定位置，先后使用Iml甲醇、Iml 水进行洗脱活化。
【文档编号】G01N30/88GK103439442SQ201310365873
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月21日 优先权日:2013年8月21日
【发明者】孙黎, 金冠钦 申请人:上海交通大学医学院附属仁济医院