一种基于金纳米棒聚集的圆二色光谱检测dna的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于金纳米棒聚集的圆二色光谱检测DNA的方法，具体是将DNA修饰的金纳米棒与待检测DNA混合进行退火反应；检测圆二色光谱，当检测到退火后相比退火前在600-800nm波段出现正负对称圆二色光谱的信号增强时，说明金纳米棒发生聚集，待检测DNA与金纳米棒上修饰的DNA完全互补或者互补并含有粘性末端。本发明的方法相比于基于纳米材料的紫外可见吸收光谱检测DNA的方法，信号更强，检出限低；而且检测方法简单，重复性好。
【专利说明】—种基于金纳米棒聚集的圆二色光谱检测DNA的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及应用纳米技术检测DNA的领域，尤其涉及一种基于金纳米棒聚集的圆二色光谱检测DNA的方法。
【背景技术】
[0002]DNA (Deoxyribonucleicacid,脱氧核糖核酸)承担着生物体的遗传信息,在生物遗传中起到不可替代的作用，每一种生物的核酸序列都是独一无二的。因此在诊断和识别各种疾病时，对于细菌、病毒、病原体的核酸序列的检测就显得尤为重要。现有的PCR技术可以将部分DNA序列进行复制，信号放大，在灵敏度方面代表了检测的极限。
[0003]贵金属纳米粒子在尺寸小于电子平均自由程时，光照射条件下，粒子表面导带的自由电子谐振产生表面等离子共振效应(Surface Plasmon Resonance, SPR)。金纳米棒具有两个表面等离子共振吸收峰，短轴吸收峰(TSPR)和长轴吸收峰(LSPR)。当贵金属表面连有手性分子时，能够诱导出贵金属纳米粒子的手性信号。当金纳米棒在手性分子的诱导下聚集时，会出现特有的圆二色信号。
[0004]基于纳米技术的DNA检测手段在定位、可视化和多重检测等方面具有不可比拟的优势。目前，已有相关研究报道，比如文献Elghanian, R.等人(1997).Selectivecolorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependentoptical properties of gold nanoparticles.Science277(5329):1078-1081.；Park, S.-J等人(2002).Array-Based Electrical Detection of DNA with Nanoparticle Probes.Science, 295(5559):1503-1506.;和 He, L.等人(2000).Colloidal Au-Enhanced SurfacePlasmon Resonance for Ultrasensitive Detection of DNA Hybridization.Journal ofthe American Chemical Societyl22 (38): 9071-9077均公开了基于纳米材料的DNA检测手段，但是目前基于纳米材料的DNA检测手段大多利用紫外可见吸收光谱进行检测，存在信号变化不明显及检出限高等问题。
【发明内容】
[0005]针对目前基于纳米材料的DNA检测手段存在信号变化不明显及检出限高的问题，本发明的目的在于提供一种基于金纳米棒聚集的圆二色光谱检测DNA的方法，该方法相比于基于纳米材料的紫外可见吸收光谱检测DNA的方法，信号更强，检出限低。
[0006]本发明人经过深入地研究发现，将金纳米棒用巯基DNA (SH-DNA)修饰后与待检测DNA序列进行培养，检测圆二色光谱信号；当待检测DNA序列与修饰到金纳米棒上的SH-DNA序列互补时，可在600-800nm波长处观察到正负对称的圆二色信号的明显变化，否则无明显变化，从而完成了本发明。
[0007]本发明提供以下技术方案:
[0008]一种基于金纳米棒聚集的圆二色光谱检测DNA的方法:将DNA修饰的金纳米棒与待检测DNA混合进行退火反应；检测圆二色光谱，当检测到退火后相比退火前在600-800nm波段出现正负对称圆二色光谱的信号增强时，说明金纳米棒发生聚集，待检测DNA与金纳米棒上修饰的DNA完全互补或者互补并含有粘性末端。
[0009]本发明是基于互补DNA退火杂交引起金纳米棒聚集，从而导致600_800nm波段出现正负对称圆二色光谱的信号增强的现象，而完成的发明。因此，对于金纳米棒的修饰方式不作特别限定，目前已有的任何能够将DNA修饰到金纳米棒上的技术，以及未来开发出来的任何能够将DNA修饰到金纳米棒上的技术均可以用来为本发明提供DNA修饰的金纳米棒。
[0010]虽然如此，本发明还是提供了一种特别的DNA修饰的金纳米棒，即巯基DNA修饰的金纳米棒，所述巯基与金通过共价键连接将DNA修饰在金纳米棒上；优选地，所述巯基修饰在DNA的3’末端。
[0011]本发明提供的基于金纳米棒聚集的圆二色光谱检测DNA的方法中，所述退火温度范围可以是从 60-90 V 任一温度(例如 60°C、62 °C、64 V、66 °C、68 °C、70°C、72 °C、74 V、76°C、78°C、80°C、82°C、84V、86°C、88 V或 90°C )降至 20-50V任一温度(例如 20°C、22°C、24。〇、26。〇、28。〇、30。〇、32。〇、34。〇、36。〇、381:、401:、421:、441:、461:、481:或50。0，优选为从60°C降至20°C。
[0012]本发明提供的基于金纳米棒聚集的圆二色光谱检测DNA的方法中，所述DNA修饰的金纳米棒与待检测DNA的摩尔比可以是1:10-200，例如1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:110、1:120、1:130、1:140、1:150、1:160、1:170、1:180、1:190 或 1:200，优选为 1:50-100。
[0013]优选地，所述DNA修饰的金纳米棒的浓度为0.6-0.8nM，例如0.6nM、0.62nM、0.64ηΜ、0.66ηΜ、0.68ηΜ、0.70ηΜ、0.72ηΜ、0.74ηΜ、0.76ηΜ、0.78ηΜ 或 0.8ηΜ。
[0014]本发明对DNA修饰 的金纳米棒与待检测DNA混合进行退火反应环境不作特别限定，只要能够提供退火反应的适宜条件即可。虽然如此，本发明还是特别提供一种退火反应的溶液环境为含0.25Μ氯化钠(NaCl)、0.05%十二烷基磺酸钠(SDS)和0.05Μ磷酸缓冲溶液(PBS)且pH为7.4的溶液。
[0015]本发明提供一种巯基DNA修饰的金纳米棒的制备方法，包括:
[0016](a)制备金纳米棒；
[0017](b)用SH-DNA修饰步骤(a)得到的金纳米棒，离心分离得到巯基DNA修饰的金纳米棒；
[0018]优选地，步骤(a)得到的金纳米棒的长径比为2.0-3.0 ；
[0019]优选地，步骤(b)中金纳米棒与SH-DNA的摩尔比为1: (8000-12000)。
[0020]根据本发明，对制备金纳米棒的方法没有特别的限定，只要能够得到金纳米棒即可，可为本领域所常用的各种方法。但在本发明中，优选金晶种合成法(Chem.Mater.2003，15，1957-1962)得到金纳米棒。
[0021]本发明步骤(a)金晶种合成法制备金纳米棒具体包括:
[0022](al)在30°C条件下，将十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和四氯金酸(HAuCl4)水溶液混合，加入新制备的硼氢化钠(NaBH4)溶液，得到金晶种，熟化时间可以是2-4h。
[0023]优选地，HAuCl4, NaBH4、十六烷基三甲基溴化铵和水的摩尔比可以是1: (2-3):(200-400): (200-250)。[0024](a2)将十六烷基三甲基溴化铵、HAuCl4和AgNO3溶液混合均匀，加入抗坏血酸溶液，l-2min后加入所述金晶种，在30°C的恒温水浴中静置生长，得到所述金纳米棒。
[0025]优选地，按总反应体积IOmL计，加入金晶种的量为10-14 μ L。
[0026]优选地，HAuCl4、十六烷基三甲基溴化铵、AgNO3、抗坏血酸和水的摩尔比为1:(180-220):(0.1-0.2):(1_2): (900-1100)，从得到的金纳米棒的均一性方面来考虑，更优选为 1:(190-210):(0.12-0.13):(1.2-1.3): (950-1050)。在本发明中，通过调节硝酸银的用量，可以得到不同长径比的金纳米棒。
[0027]在本发明中，对HAuC14、CTAB、AgNO3以及水进行混合的方式没有特别的限定，可以为本领域常用的各种方式。例如可以将CTAB、HAuCl4, AgNO3和水直接进行混合，也可以预先用水分别将CTAB、HAuCl4和AgNO3溶解后，再进行混合。
[0028]在本发明中，对上述得到的金纳米棒溶液用去离子水离心清洗2次(10000r/min，20min)，最后再重新分散到去离子水中，即得到金纳米棒的溶液。
[0029]本发明步骤(b)中所使用的所述步骤(a)制备的金纳米棒的浓度可以是0.6-0.8nM,例如 0.6ηΜ、0.62ηΜ、0.64ηΜ、0.66ηΜ、0.68ηΜ、0.70ηΜ、0.72ηΜ、0.74ηΜ、0.76ηΜ、
0.78ηΜ 或 0.8ηΜ。
[0030]本发明中，对于SH-DNA修饰金纳米棒的方法没有特别的限定，只要能够得到SH-DNA修饰的金纳米棒即可，可以为本领域所常用的各种方法。但在本发明中优选盐熟化法修饰金纳米棒，具体可以是:
[0031](bl)向步骤(a)制备的金纳米棒的溶液中，加入SH-DNA共培养12_48h、优选24h，然后加入SDS溶液和pH7.4的磷酸缓冲溶液，于室温下存放5-8天、优选7天后，然后分6_10次、优选8次加入NaCl溶液，每次间隔2-6h、优选4h。
[0032]在优选的情况下，金纳米棒的浓度为0.6-0.8nM，金纳米棒与SH-DNA的摩尔比为1:8000-12000 ;加入的SDS与磷酸缓冲液混合液的体积为300-320 μ L/lmL金纳米棒溶液，其中SDS的质量分数为0.04-0.05%，磷酸缓冲液的浓度为0.05M ;加入的NaCl浓度为1M，每次加入的体积为30-40 μ L，共加入8次，每次时间间隔为4-6小时。
[0033](b2)将步骤(bl)所得的混合液离心(可以离心两次，每次10000r/min，3min)，去除未修饰在金纳米棒表面的SH-DNA，将沉淀重新分散到含有NaCl和SDS溶液的pH7.4的磷酸缓冲溶液中，得到SH-DNA修饰的金纳米棒溶液。
[0034]在优选的情况下，每ImL原混合液离心分离后重新分散至1_1.2mL上述三组分液中，其中NaCl的浓度为0.2-0.3M、优选0.25M，SDS的质量分数为0.04-0.05%、优选0.05%,磷酸缓冲液的浓度为0.05M。
[0035]本发明中，待检测DNA可以带有或不带粘性末端。当待检测DNA与SH-DNA修饰的金纳米棒上的序列互补时，无论待检测DNA带或不带粘性末端,都能够引起金纳米棒的聚集，得到检出信号。
[0036]上述水可以为蒸馏水和/或去离子水等，所有药品均为分析纯及以上纯度。
[0037]本发明中，根据本发明的上述方法得到的互补DNA链段的检出信号为600_800nm波段出现的正负对称的圆二色光谱信号。
[0038]本发明的有益效果为:本发明基于金纳米棒聚集的圆二色光谱检测DNA的方法相比于基于纳米材料的紫外可见吸收光谱检测DNA的方法，信号更强，检出限低；而且检测方法简单，重复性好。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1为本发明的实施例1中得到的长轴吸收峰为700nm、长径比为3.0的金纳米棒的透射电子显微镜图；
[0040]图2为本发明的实施例1中DNA链段A序列DNA的紫外可见吸收光谱和圆二色光谱图(左箭头指示圆二色光谱曲线，右箭头指示紫外可见吸收光谱曲线)；
[0041]图3为本发明的实施例1中得到的退火后SH-DNA链段A修饰的金纳米棒与DNA链段C的紫外可见吸收光谱和圆二色光谱图(左箭头指示圆二色光谱曲线，右箭头指示紫外可见吸收光谱曲线)；
[0042]图4为本发明的实施例1得到的聚集后的金纳米棒的扫描电子显微镜图；
[0043]图5为本发明的实施例2得到的退火后SH-DNA链段A修饰的金纳米棒与DNA链段D的紫外可见吸收光谱和圆二色光谱图(左箭头指示圆二色光谱曲线，右箭头指示紫外可见吸收光谱曲线)；
[0044]图6为本发明的实施例3得到的退火后SH-DNA链段A修饰的金纳米棒与DNA链段E的紫外可见吸收光谱和圆二色光谱图(左箭头指示圆二色光谱曲线，右箭头指示紫外可见吸收光谱曲线)；
[0045]图7为本发明的实施例4中得到的退火后SH-DNA链段A修饰的金纳米棒与不同浓度DNA链段C的紫外可见吸收光谱和圆二色光谱图(左箭头指示圆二色光谱曲线，右箭头指示紫外可见吸收光谱曲线);
[0046]图8为本发明的实施例5中得到的不同退火温度下SH-DNA链段A修饰的金纳米棒与DNA链段C的紫外可见吸收光谱和圆二色光谱图(左箭头指示圆二色光谱曲线，右箭头指示紫外可见吸收光谱曲线);
[0047]图9为本发明的实施例6中得到的长径比为2.8的金纳米棒的透射电子显微镜照片;
[0048]图10为本发明的实施例6中得到的长径比为2.1的金纳米棒的透射电子显微镜照片；
[0049]图11为发明的实施例6中得到的退火后SH-DNA链段A修饰不同长径比的金纳米棒与DNA链段C的紫外可见吸收光谱和圆二色光谱图(左箭头指示圆二色光谱曲线，右箭头指示紫外可见吸收光谱曲线);
[0050]图12为本发明的实施例7中得到的退火后SH-DNA链段B修饰的金纳米棒与DNA链段F的紫外可见吸收光谱和圆二色光谱图(左箭头指示圆二色光谱曲线，右箭头指示紫外可见吸收光谱曲线)。
【具体实施方式】
[0051]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
[0052]以下实施例中离心采用台式高速离心机(XiangYi H-1650);透射电子显微镜照片采用六硼化镧透射电子显微镜(Tecnai G220S-TWIN)得到；扫描电镜图采用冷场发射扫描电子显微镜(Hitachi S-4800)得到；紫外可见吸收光谱采用紫外可见光谱仪(HitachiU-3010)得到；圆二色光谱采用圆二色光谱仪(Jasco J-810spectropolarimeter)得到。
[0053]实施例1
[0054](I)制备金纳米棒
[0055]在30°C条件下，向7.5mL浓度为IOOmM的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)中加入250 μ L浓度为IOmM的HAuCl4,再加入1.65mL去离子水,搅拌均勻后迅速加入0.6mL浓度为IOmM的NaBH4溶液(所用的NaBH4溶液新鲜配制并在冰水浴中恒温)，搅拌2min后，熟化2_4h，得到用于生长金纳米棒的金晶种。
[0056]将IOmL浓度为IOOmM的CTAB与500 μ L浓度为IOmM的HAuCl4混合均匀；然后，依次加入60 μ L浓度为IOmM的AgNO3,60 μ L浓度为IOOmM的抗坏血酸，12 μ L熟化2_4h的金晶种，混匀后，在30°C恒温水浴中静置生长12h，得到含有金纳米棒的溶液。
[0057]用去离子水对所得的金纳米棒进行离心清洗2次(10000r/min，20min)，最后分散到去离子水中。将所得的金纳米棒采用透射电镜(TEM)观察形貌，如图1所示，所得的金纳米棒平均长度为42nm，平均宽度为14nm，平均长径比为3.0。
[0058](2 )金纳米棒SH-DNA修饰
[0059]取ImL金纳米棒溶液，浓度为0.7nM，向其中加入74 μ L浓度为100 μ M的SH-DNA链段 A (5’ -AAGAATTTATAAGCAGAAAAAAAAAAAA-3’ -SH, SEQ ID NO:1，在序列的 3’ 末端修饰巯基)。经过24h培养之后，加入155 μ L0.1%SDS (十二烷基磺酸钠)溶液和155 μ L0.1M的ρΗ=7.4的磷酸缓冲溶液，在室温下存放7天后，向其中加入IM NaCl溶液，每次加入32.5 μ L，共8次，时间间隔为4h。
[0060]将上述所得混合液离心两次(10000r/min, 3min),除去未修饰在金纳米棒表面的SH-DNA,重新分散到ImL含有0.25M NaCU0.05%SDS的0.05M pH=7.4的磷酸缓冲溶液中，得到SH-DNA修饰的金纳米棒溶液。
[0061](3) DNA链段的圆二色光谱检测
[0062]取0.5mL链段A修饰的金纳米棒溶液，加入1.5mL含有0.25M NaCU0.05%SDS的
0.05M pH=7.4的磷酸缓冲溶液中。将1.5 μ L浓度为100 μ M的与链段A互补、带有粘性末端的 DNA 链段 C (5，-TTTTTTTTTTTTCTGCTTATAAAT TCTTGCGC-3’，SEQ ID NO:3)加入 SH-DNA修饰的金纳米棒溶液中，混合后在60°C退火，使其形成DNA双链结构，立即进行紫外可见吸收光谱和CD光谱测试。如图2所示，为带有粘性末端的DNA链段C的紫外可见吸收光谱与⑶光谱图。如图3所示，为DNA链段A修饰的金纳米棒与互补链C混合、退火后的紫外可见吸收光谱与⑶光谱图。从图3可以看出，当体系从60°C退火到20°C时，700nm附近的紫外吸收峰强度降低，金纳米棒发生聚集；在对应的波段，⑶信号出现了明显的变化:金纳米棒的长轴吸收峰所对应的CD峰变成两个对称的峰，分别在750nm和670nm处，CD信号大大增强，并且形成正负对称信号。与紫外可见吸收光谱相比，⑶光谱变化更为明显，更适宜于目标DNA的检测。将聚集后的金纳米棒采用扫描电镜(SHM)观察形貌，如图4所示，金纳米棒呈现无规聚集状态。
[0063]实施例2
[0064]按照实施例1的方法制备金纳米棒并用SH-DNA链段A修饰，不同的是，将DNA链段C换成同浓度、与链段A互补并不带粘性末端的DNA链段D (5’-TTTTTTTTTTTTCTGCTTATAAATTCTTA-3’，SEQ ID NO:4)。退火后，进行紫外可见吸收光谱和⑶光谱测试。如图5所示，为DNA链段A修饰的金纳米棒与不含粘性末端的互补链D混合、退火后的紫外可见吸收光谱与⑶光谱图。从图5可以看出，当体系从60°C退火到20°C时，金纳米棒不发生聚集，⑶信号无变化。原因在于:DNA链段D与链段A互补配对后在其3’多出一个A碱基，因此它们互相之间不能形成配对关系，不能引起金纳米棒聚集；而DNA链段C与链段A互补配对后在其3’多出GCGC4个碱基，它们互相之间能够形成配对关系，引起金纳米棒聚集。
[0065]实施例3
[0066]按照实施例1的方法制备金纳米棒并用SH-DNA链段A修饰，不同的是，将DNA链段C换成同浓度、与链段A完全互补(不带粘性末端)的DNA链段E (5’ -TTTTTTTTTTTTCTGCTTATAAATTCTT-3’，SEQ ID NO:5)。退火后，进行紫外可见吸收光谱和⑶光谱测试。如图6所示，为DNA链段A修饰的金纳米棒与完全互补链E混合、退火后的紫外可见吸收光谱与CD光谱图。从图6可以看出，当体系从60°C退火到20°C时，700nm附近的紫外吸收峰强度降低，金纳米棒发生聚集；在对应的波段，⑶信号出现了明显的变化:金纳米棒的长轴吸收峰所对应的CD峰变成两个对称的峰，分别在720nm和620nm处，CD信号大大增强，并且形成正负对称信号。
[0067]实施例4
[0068]按照实施例1的方法制备金纳米棒并用SH-DNA链段A修饰，不同的是，改变待检测DNA链段C的浓度分别为50nM、75nM和ΙΟΟηΜ。即将1.0 μ L、1.5 μ L或2.0 μ L浓度为100 μ M的与链段A互补、带有粘性末端的DNA链段C加入SH-DNA修饰的金纳米棒溶液中。混合后在60°C退火，使其形成DNA双链结构，立即进行紫外可见吸收光谱和⑶光谱测试。如图7所示，从图中可以看出，CD信号随着互补DNA链段C的浓度增加而增加，当待检测DNA浓度低至50nM时，仍有很强烈的⑶信号，能够检测出与金纳米棒上所修饰的DNA序列互补、带有粘性末端的DNA序列。相比于紫外可见吸收光谱，CD光谱对DNA浓度的变化更为敏感，能够更好的检测出体系中的DNA浓度。
[0069]实施例5
[0070]按照实施例1的方法制备金纳米棒并用SH-DNA链段A修饰，不同的是，改变DNA混合后的退火温度，分别由60°C退火至50°C、40°C、30°C和20°C，然后进行紫外可见吸收光谱和CD光谱测试。如图8所示，从图中可以看出，随着退火温度的升高，CD检出信号变弱，但是仍然能够检出互补DNA链段C。
[0071]实施例6
[0072]按照实施例1的方法制备金纳米棒并用SH-DNA链段A修饰，不同的是，在制备金纳米棒的过程中，改变AgNO3的浓度，分别加入55 μ L和45 μ L浓度为IOmM的AgNO3,最终得到长径比分别为2.8和2.1的金纳米棒。如图9所示，为制备的长径比为2.8的金纳米棒。如图10所示，为制备的长径比为2.1的金纳米棒。如图11所示，为退火后的紫外可见吸收光谱和CD光谱。从图中可以看出，改变金纳米棒的长径比并不影响DNA的检测。当带有粘性末端的待检测DNA与金纳米棒上修饰的DNA序列互补时，CD光谱上仍然能够得到正负对称信号，达到DNA序列检测的目标。
[0073]实施例7
[0074]按照实施例1的方法制备金纳米棒并用SH-DNA链段修饰，不同的是，使用巯基DNA链段 B (5，-ATGCTCAACTCTTAGGACAAAAAAAAAA-3’ -SH, SEQ ID NO:2，在序列的 3’ 末端修饰巯基)修饰金纳米棒。将与链段B互补并带有粘性末端、DNA链段F (5’-TTTTTTTTTTGTCCTAAGAGTTGAGCATGCGC-3’，SEQ ID NO:6)按照终浓度为75nM的量加入SH-DNA链段B修饰的金纳米棒溶液中。在60°C退火至20°C后，进行紫外可见吸收光谱和⑶光谱测试。如图12所示，为DNA链段B修饰的金纳米棒与带有粘性末端的互补链F混合、退火后的紫外可见吸收光谱与CD光谱图。从图12可以看出，当体系从60°C退火到20°C时，紫外吸收峰强度降低，金纳米棒发生聚集；在对应的波段，⑶信号出现了明显的变化:金纳米棒的长轴吸收峰所对应的CD峰变成两个对称的峰，CD信号大大增强，并且形成正负对称信号。
[0075]根据实施例1-7可知，无论待检测DNA序列是否带有粘性末端，采用本发明的方法均能够对DNA序列进行检测；并且，通过实施例4-6可以看出，当改变所使用的金纳米棒的长径比、待检测DNA的浓度和退火温度时，均可以得到明显的正负对称的CD光谱检出信号。
[0076] 申请人:声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属【技术领域】的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【权利要求】
1.一种基于金纳米棒聚集的圆二色光谱检测DNA的方法，其特征在于，所述方法为:将DNA修饰的金纳米棒与待检测DNA混合进行退火反应；检测圆二色光谱，当检测到退火后相比退火前在600-800nm波段出现正负对称圆二色光谱的信号增强时，说明金纳米棒发生聚集，待检测DNA与金纳米棒上修饰的DNA完全互补或者互补并含有粘性末端。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA修饰的金纳米棒是巯基DNA修饰的金纳米棒，所述巯基与金通过共价键连接将DNA修饰在金纳米棒上； 优选地，所述巯基修饰在DNA的3’末端。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述退火温度范围为从60-90°C任一温度降至20-50°C任一温度，优选为从60°C降至20°C。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述DNA修饰的金纳米棒与待检测DNA的摩尔比为1:10-200，优选为1:50-100 ； 优选地，所述DNA修饰的金纳米棒的浓度为0.6-0.8nM。
5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，所述DNA修饰的金纳米棒与待检测DNA混合进行退火反应的溶液环境为含0.25M NaCU0.05%SDS和0.05M磷酸缓冲溶液且PH为7.4的溶液。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，所述DNA修饰的金纳米棒是通过如下方法制得的: Ca)制备金纳米棒； (b)用SH-DNA修饰步骤( a)得到的金纳米棒，离心分离得到巯基DNA修饰的金纳米棒； 优选地，步骤(a)得到的金纳米棒的长径比为2.0-3.0 ； 优选地，步骤(b)中金纳米棒与SH-DNA的摩尔比为1: (8000-12000)。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)具体为: (al)在30°C条件下，将十六烷基三甲基溴化铵和HAuCl4水溶液混合，加入新制备的NaBH4溶液，得到金晶种； (a2)将十六烷基三甲基溴化铵、HAuCl4和AgNO3溶液混合均匀，加入抗坏血酸溶液，l-2min后加入所述金晶种，在30°C的恒温水浴中静置生长，得到所述金纳米棒。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(al)中，HAuCl4,NaBH4、十六烷基三甲基溴化铵和水的摩尔比为1: (2-3): (200-400): (200-250)； 优选地，步骤(a2)中，HAuCl4、十六烷基三甲基溴化铵、AgNO3、抗坏血酸和水的摩尔比为 1:(180-220):(0.1-0.2):(1_2): (900-1100)，更优选为 1:(190-210):(0.12-0.13):(1.2-1.3):(950-1050)； 优选地，步骤(a2)中，按总反应体积IOmL计,加入金晶种的量为10_14yL。
9.根据权利要求6至8任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中所使用的所述步骤(a)制备的金纳米棒的浓度为0.6-0.8nM。
10.根据权利要求6至9任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)具体为: (bl)向步骤(a)制备的金纳米棒的溶液中，加入SH-DNA共培养12_48h、优选24h，然后加入SDS溶液和pH7.4的磷酸缓冲溶液，于室温下存放5-8天、优选7天后，然后分6_10次、优选8次加入NaCl溶液，每次间隔2-6h、优选4h ； (b2)将步骤(bl)所得的混合液离心，去除未修饰在金纳米棒表面的SH-DNA，将沉淀重新分散到含有0.25M NaCl和0.05%SDS溶液的pH7.4的0.05M磷酸缓冲溶液中，得到SH-DNA修饰的金纳米棒 溶液。
【文档编号】G01N21/19GK103487378SQ201310468256
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年10月9日 优先权日:2013年10月9日
【发明者】石林, 李正涛, 唐智勇 申请人:国家纳米科学中心