草鱼呼肠孤病毒ⅱ型s10基因编码的重组蛋白、由其制备的多克隆抗体及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型S10基因编码的重组蛋白、由其制备的多克隆抗体及应用。草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型S10基因编码蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本发明获得的重组蛋白具有较好的免疫原性，与GCRV其它结构蛋白相比，其诱导免疫动物产生的特异性抗体效价更高。进一步试验表明，用S10重组蛋白免疫草鱼，可使草鱼诱导产生较高的特异性抗体，并能对草鱼呼肠孤病毒强毒株的攻击起到一定的免疫保护作用。因此，对GCRVⅡ型S10基因编码蛋白的研究和应用，对开发草鱼出血病新型疫苗及免疫学检测试剂盒具有极其重要的意义，为草鱼出血病提供新的有效解决途径。
【专利说明】草鱼呼肠孤病毒II型SI O基因编码的重组蛋白、由其制备的多克隆抗体及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物基因工程领域，具体涉及由草鱼呼肠孤病毒II型SlO基因编码的重组SlO抗原蛋白、由SlO抗原蛋白制备的多克隆抗体及其应用。 【背景技术】
[0002]由草鱼呼肠孤病毒(Grass Crap Reovirus, GCRV)引起的草鱼出血病给我国草鱼养殖业造成巨大经济损失，严重制约着我国草鱼养殖的健康发展。GCRV具双层衣壳，病毒粒子平均直径为60 nm~70 nm，二十面体对称，无囊膜，基因组由11条分节段的双链RNA组成，根据其基因节段的大小，将其基因组按分子量大小分为3个组，分别命名为L1-L3、M4-M6和S7-S11。这11个RNA节段可以编码12种多肽蛋白，其中7种结构蛋白，分别命名为VP1-VP7，其余为非结构蛋白，命名为NS1-NS5。由于病毒的基因组的分节段特性，不同毒株之间可发生重配而产生高度变异，使得草鱼呼肠孤病毒的毒株较为复杂，目前已报道有 20 多个分离株，包括 GCRV854、GCRV861、GCRV873、GCRV875、GCRV876、GCRV991、GCRV096、GCRV829、H962、ZV-8802、ZV-8909、GCHV-854、GCRV-HZ08、JX09-01、GCRV-104、GCRV-9014、GCRV-2008、⑶108等，不同分离株在基因组序列、基因组带型、细胞病变、对草鱼的致病力等方面差异较大。根据现有的分离株基因序列信息，进行核苷酸序列与氨基酸序列比对以及构建系统进化树分析，所有毒株总体上可以分为3大类，分为3个基因型，即GCRV I型(代表株为 GCRV-873 与 GCRV-JX09-01)、GCRV II 型(代表株为 GCRV-HZ08)和 GCRV III型(代表株为GCRV-104为)。当前，全国各地分离到的流行株中，三类亚型均有报道，有单独感染，也有混合感染，以HZ08株为代表的GCRV II型是目前导致草鱼出血病流行和爆发的主要株型。
[0003]目前，对于草鱼出血病的防治，还没有特异有效的治疗药物和方法，最为有效的办法仍然是免疫预防，草鱼出血病细胞灭活疫苗与细胞弱毒疫苗的应用，对减少草鱼出血病的发生起到了一定的效果。但灭活疫苗的免疫原性比较差，需要足够大的量才能引起免疫应答，而大剂量又可引起局部或全身反应，并且所获得的免疫应答比较短暂，需要多次注射来增强免疫应答，而灭活疫苗的生产成本又比较高；细胞弱毒疫苗存在毒力返强的危险，有散毒的风险。和传统疫苗相比，基因工程疫苗存在较多有点，其抗原成分单一、免疫原性强，能够刺激机体产生较强的体液和细胞免疫应答,持续时间长；可规模化生产,成本相对低廉。此外，一种疫苗的免疫效果如何，需要合适的方法来检测和评价。通过免疫学方法来检测免疫动物特异性抗体的有无及抗体效价的高低是目前最为简便和有效的方法。由于草鱼呼肠孤病毒免疫原性比较差，至今还没有一种有效的免疫学诊断方法，尤其是缺乏评价疫苗免疫效果的血清学检测方法。
[0004]GCRV-873 ( I型)是第一个完成全基因组测序的水生呼肠孤病毒，是至今为止研究最为深入和系统的毒株，关于GCRV-873株基因组各基因节段及其编码蛋白的功能和作用研究比较多。GCRV-HZ08 (II型)为一个新的分离株，对其各节段基因及其编码蛋白的功能和作用还未有深入研究。通过生物信息学软件分析表明，HZ08株SlO编码一个长达345AA的VP38蛋白，分子量为38.39kDa，该蛋白与禽呼肠孤病毒(Avian Reovirus，ARV)的非结构蛋白sNS同源性约14.5%,与哺乳动物正呼肠孤病毒(Mammal reovirus,MRV)的非结构sNS的同源性约7.2%，在核苷酸和氨基酸水平上均找不到和水生呼肠孤病毒的同源基因。因此，一直以来GCRV-HZ08株SlO基因编码蛋白被认为是非结构蛋白，且可能具有与MRV和ARV的sNS蛋白相似的功能。
【发明内容】
[0005]我们的最近研究发现:GCRV-HZ08株SlO基因编码蛋白为结构蛋白，且比GCRV其它结构蛋白诱导免疫动物产生更高效价的特异性抗体，具有更好的免疫原性；针对SlO编码蛋白的抗体可以特异性识别GCRV II型毒株，并对该类型毒株具有很强的中和能力；进一步试验表明，用SlO重组蛋白免疫草鱼，可使草鱼诱导产生较高的特异性抗体，并能对草鱼呼肠孤病毒强毒株的攻击起到一定的免疫保护作用。因此，对GCRV II型SlO基因编码蛋白的研究和应用，对开发草鱼出血病新型疫苗及免疫学检测试剂盒具有极其重要的意义。
[0006]由此，本发明的一个目的在于提供一种SlO抗原蛋白，及由其制备得到的多克隆抗体。
[0007]本发明的另一个目的在于提供上述SlO抗原蛋白和抗SlO抗原蛋白的多克隆抗体在制备草鱼出血病基因工程疫苗或制备草鱼呼肠孤病毒检测试剂盒上中的应用。
[0008]本发明所采取的技术方案是: 一种草鱼呼肠孤病毒II型SlO基因编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0009]一种编码权利要求1所述蛋白的核酸，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
[0010]上述SlO基因编码蛋白作为鱼呼肠孤病毒抗原蛋白的应用。
[0011]一种多克隆抗体，是以氨基酸序列为SEQ ID NO: 2所示的蛋白为抗原，免疫动物制备所得。
[0012]上述SlO基因编码蛋白和/或上述的抗SlO基因编码蛋白的多克隆抗体在制备草鱼出血病基因工程疫苗中的应用。
[0013]上述SlO基因编码蛋白在制备草鱼呼肠孤病毒检测试剂盒上的应用。
[0014]一种基因工程疫苗，含有上述的SlO基因编码蛋白或抗SlO基因编码蛋白的多克隆抗体。
[0015]一种检测草鱼呼肠孤病毒的试剂盒，含有上述的SlO基因编码蛋白。
[0016]本发明的有益效果是:
本发明获得的重组蛋白具有较好的免疫原性，与GCRV其它结构蛋白相比，其诱导免疫动物产生的特异性抗体效价更高。以SlO基因编码蛋白免疫草鱼，可使草鱼诱导产生较高的特异性抗体，并能对草鱼呼肠孤病毒强毒株的攻击起到较好的免疫保护效果(保护率为73.3%)。因此，SlO基因编码蛋白是研制草鱼出血病基因工程疫苗较好的候选抗原。以SlO基因编码蛋白作为检测草鱼呼肠孤病毒抗体效价的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)的包被抗原，能很好的识别GCRV感染或疫苗免疫草鱼产生的特异性抗体；并且，通过该方法获取的包被抗原，具有快速、特异、敏感、简便和安全的优点，克服了组织和细胞培养方法产生完整病毒作为间接ELISA包被抗原而造成的操作过程繁琐、不稳定、产量低、成本高的缺点。因此，本发明的GCRV II型SlO基因及其编码蛋白，对开发草鱼出血病新型疫苗、免疫学检测试剂盒及治疗产品具有重要的意义，为草鱼出血病提供新的有效解决途径。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为GCRV II型毒株SlO基因PCR扩增产物电泳图，图1中M为DL marker1000 ；1为阴性对照；2为以pVAXl-S10质粒为模板的PCR扩增产物；
图2为重组质粒pET-32a-S10双酶切鉴定结果，图2中M为DL marker 15000 ；1为重组质粒pET-32a-S10双酶切产物；2为空载体pET_32a ( + )双酶切产物；
图3为SDS-PAGE分析重组质粒pET-32a-S10表达产物及其可溶性，图3中M为低分子质量蛋白质marker ；1为IPTG诱导的pET_32a_S10菌体；2为IPTG诱导的pET_32a_S10菌液上清；3为未经IPTG诱导的pET-32a-S10菌体；4为未经IPTG诱导pET-32a_S10的菌液上清；5为IPTG诱导的pET-32a ( + )的菌体；6为菌体超声波破碎后的上清；7为菌体超声波破碎后的沉淀；
图4为SlO基因编码重组蛋白经Ni柱纯化后SDS-PAGE分析结果，图4中M低分子质量蛋白质marker ；1为纯化的SlO基因编码重组蛋白；2为通过Ni柱的流穿液；3为未纯化的菌体总蛋白；
图5为western blot分析SlO编码蛋白抗血清特性，图5中M低分子质量蛋白质marker ；1为纯化的HZ08毒株；2为pET_32a ( + )空载体；3为纯化的SlO基因编码重组蛋白；
图6为间接免疫荧光分析SlO编码蛋白抗血清特性，图6中A为接种HZ08株的CIK细胞为未接种病毒的正常CIK细胞对照。
【具体实施方式】
[0018]下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0019]以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J, Russell Dff, Janssen K, Argentine J.黄培堂等译，2002，北京:科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
[0020]一、草鱼呼肠孤病毒HZ08株RNA的提取和SlO基因片段扩增
按照Qiagen RNA提取试剂盒(购自Qiagen公司，货号:74104)的说明书步骤,从感染GCRV HZ08株病毒的CIK细胞内中提取RNA，用TAKARA (购自大连宝生物工程有限公司，货号:)反转录试剂盒将病毒RNA反转录成cDNA。GCRV HZ08病毒株由珠江水产研究所鱼病
室保藏。
[0021]根据GenBank (GenBank:⑶350747.1)中 GCRV-HZ08 株 SlO 基因序列设计 I 对引物，上游引物:5’_ ATA GGA TCC ATG GCG GGT GTG TCT CT CAA CA - 3’ (SEQ ID NO:3)；下游引物:5’-GCT AAG CTT CAG CAT CTG CGC AAA TAT ACG TC -3’ (SEQ ID NO:4)，在上下游引物序列中分别插入BanH I和Hand III酶切位点(带下划线的基因)，以上述制备的cDNA为模版，对SlO基因进行PCR扩增。每25yL反应体系中加入2.5yL 10XPCR reactionbuffer,0.5μ L dNTP (IOmM each)，上、下游引物分别为 0.5 μ L，2 μ L cDNA 作为模版，LATaq 酶 0.25 μ L，ddH20 18.75 μ L ;反应条件为:95°C预变性 5min，94°C 40s，54°C 45s, 72°Clmin,共30个循环，72°C延伸8min。
[0022]PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，发现在约IlObp处出现一条预期大小一致的特异性扩增条带(见图1)，用胶回收试剂盒回收纯化目的条带，经测序验证与预期相符。
[0023]二、pET-32a_S10重组表达载体构建
将PCR回收产物和原核表达载体pET-32a ( + )分别双酶切处理(BanH I I μ I,Hand IIII μ 1，IOXK buffer 2 μ 1，质粒16 μ I)后，经1%琼脂糖电泳分析，胶回收SlO目的片段和处理好的pET_32a ( + )载体，用T4 DNA连接酶连接SlO目的片段和pET_32a ( + ) (T4 Liqase1.5μ 1，T4 Liqase buffer 1.5μ l，pET_32a ( + ) 3μ I,SlO 目的片段 9 μ 1，共 15μ I)，，将连接产物转化到大肠杆菌DH5 α，筛选阳性克隆，菌液PCR鉴定为阳性的提取质粒，质粒经双酶切和测序鉴定正确后，命名为pET-32a-S10，保存用于后续试验。
[0024]PCR和双酶切鉴定结果(见图2)均显示重组表达质粒pET-32a_S10构建正确，测序结果证实目的片段及阅读框均正确，且目的基因SlO和pET-32a ( + )的His-Tag标签蛋白在同一开放阅读框下。
[0025]三、诱导表达和可溶性分析
诱导表达:将鉴定正确的重组质粒pET-32a-S10转化到大肠杆菌BL21 (DE3)，挑取LB/Amp平板筛选的阳性克隆,于LB/Amp培养基中，37°C, 200rpm/min恒温摇床培养至光密度(0D600=0.6)时，加入终浓度为lmmol/L的TPTG诱导，诱导IOh后取200 μ I菌液离心收集菌体和上清备用，同时设立空 载体pET-32a ( + )作为阴性对照。
[0026]可溶性分析:将pET-32a_S10诱导表达20ml，离心收集菌体，用PBS重悬离心洗涤2次后，加入5ml PBS重悬菌体，在冰上超声波破碎(工作5s，间歇10s，功率250w)约2h至溶液澄清，吸取200 μ L破碎液，6000rpm/min离心5min，将上清吸到另一 EP管记为溶液A，沉淀用200 μ I 6Μ的尿素溶解，记为溶液B，分别将Α、B溶液进行SDS-PAGE，对该重组蛋白进行可溶性分析，若目的蛋白主要在A溶液中，则该蛋白为可溶性蛋白；若目的蛋白主要在B溶液中，则目的蛋白以包涵体形式存在。
[0027]经SDS-PAGE分析诱导表达的重组蛋白显示，重组质粒pET-32a_S10菌株在53ku处出现一条目的条带(见图3), pET-32a ( + )载体的的His-标签蛋白与目的蛋白一起融合表达。取超声波破碎液离心后的上清溶液A和6M尿素溶解沉淀的溶液B，经SDS-PAGE分析表明，融合标签蛋白的目的蛋白主要存在B溶液中，即目的蛋白主要以包涵体形式存在(见图3)。
[0028]四、诱导表达条件的优化
采用棋盘法优化诱导条件，把pET-32a-S10转化到大肠杆菌BL21 (DE3)感受态中，LB/Amp平板筛选阳性菌落,挑取单菌落于3ml LB/Amp培养基中，在37°C, 200rpm/min恒温摇床培养12h，然后将菌液接种20 μ L到2mL LB/Amp培养基中，在37°C，200rpm/min恒温摇床培养至光密度(0D600设0.2、0.4、0.6、0.8和1.0，已实际测定为准)时，加入TPTG诱导(IPTG终浓度设0.5、1.0、1.5,2.0,3.0 mmol/L)，培养IOh后取200 μ I菌液离心，收集菌体，经SDS-PAGE分析后用BandScan 5.0软件分析重组蛋白的相对表达量。[0029]最后得出当诱导表达条件是:0D600为0.8左右，IPTG终浓度为1.5mmol/L时，其表达条件最佳，目的蛋白的含量可达60%以上。
[0030]五、目的蛋白的大量表达和纯化
挑取LB/Amp平板筛选得阳性单菌落到ImL LB/Amp培养基培养l(Tl2h，然后将其接种到IL LB/Amp培养基，37°C，200rpm/min恒温摇床培养，在优化的表达条件下诱导表达。将诱导表达的菌液在10000rpm/min离心5min,收集菌体,用400ml PBS重悬离心洗漆2次，再加入100 ml PBS重悬，在冰上超声波破碎至溶液澄清。将破碎液离心收集包涵体(该蛋白可溶性检验为包涵体蛋白)，然后参照N1-凝胶纯化试剂盒(包涵体蛋白纯化)说明书纯化目的蛋白。用50ml Binding Buffer溶解包涵体过夜,将溶解液10000rpm/min离心20min收集上清,再0.45 μ m的滤膜过滤，将上清负载上已平衡好的Ni柱流速10倍柱体积/小时，收集流穿液；用15倍柱体积的Binding Buffer洗去未结合蛋白和杂蛋白，然后用20mlElution Buffer洗脱目的蛋白，收集洗脱峰(整个纯化过程在4?冰箱中进行)。将Ni柱上洗脱下的蛋白装入透析袋，依次放入含6M，4M，2M，1M，0.5M，OM尿素的PBS溶液中透析，每个浓度透析12h(全部过程在4°C冰箱中进行)。透析完成后加入PEG-6000，4°C冰箱静置浓缩，浓缩50%后分装成ImL/管，用紫外吸光光度法测浓度后一 20°C保存备用。
[0031]六、多克隆抗体的制备
将纯化的目的蛋白用无菌PBS稀释至200 μ g/ml后注射昆明小白鼠。第一次免疫用弗氏完全佐剂1:1 乳化，注射量为200 μ L/只，共免疫10只。第二次免疫和第三次免疫用弗氏不完全佐剂1:1乳化，注射同样的量。每次免疫时间间隔14d。第三次免疫IOd后天断尾取血，制备血清，用ELISA检测血清抗体的效价。如抗体效价不够，可以加强免疫一次，如足够高，则第14d摘眼球取血。采取的血样37°C静置Ih后4°C冰箱静置过夜，第二天3000rpm/min离心8min，收集血清，一 20°C保存备用。对照组注射无菌PBS制备阴性血清。
[0032]七、血清抗体效价测定
根据本实验室建立的草鱼呼肠孤病毒间接ELISA检测方法来测定血清抗体效价，即用纯化的SlO编码蛋白作为抗原包被聚苯乙烯反应板来建立的间接ELISA方法。其简要过程如下:将纯化的重组蛋白用pH9.6的碳酸盐缓冲液按1:8000倍稀释(70ng/ml)包被IOOyL于96孔酶标板，4°C过夜；用200 μ L 1%BSA于37°C封闭2h ;将制备的血清按1:10、1:102、1:103、1:104、1:105、1:106、1:107、1:108、1:109、1:1010 等梯度稀释加入 100 μ L,37°C孵育2h，以相应稀释倍数的阴性血清做对照；加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgGlOOyL, 37°C孵育Ih ;以上每步反应后都用200 μ L PBST洗板3—5次，每次5min ;最后用TMB显色试剂盒显色20min，加入0.5M的H2S04终止显色，在酶标仪(Infinite M200PRO)上读0D450值。当0D450≥0.277，且P/N≥2.1判定为阳性。
[0033]用间接ELISA法对SlO基因编码重组蛋白鼠抗血清进行效价测定，结果表明该抗体效价约为1:106。
[0034]八、多克隆抗体特性分析
Western blot分析:将纯化的GCRV HZ08病毒、IPTG诱导的pET_32a (+)空载体和纯化的SlO基因编码重组蛋白经SDS-PAGE电泳，电泳结束后用半干转膜法将蛋白转移到NC膜上，用含5%脱脂牛奶的TBST缓冲液4°C封闭过夜；加入1:1000稀释的血清，37°C孵育2h ；加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37°C孵育Ih ;每次反应后用TBST洗3~5次，每次5min,最后用DAB显色剂显色并观察结果。
[0035]制备的多克隆抗体经western blot分析，加入纯化的GCRV HZ08毒株的孔道中，在约38ku处出现一条特异性条带，与病毒SlO基因自身编码的蛋白大小一致；在加入纯化的重组蛋白的孔道中，在约53ku处出现一条特异条带，与预期大小一直；而加入空载体菌体的孔道中没有任何条带。
[0036]间接免疫突光试验(Indirectimmunofluorescent assay, IFA):将 CIK 细胞传代至96孔细胞培养板中，待细胞长至单层铺满80%左右后，感染HZ08病毒；感染病毒5d后，将细胞培养板中的培养基吸尽，用0.01mol/L的PBS洗涤3次，加入80%的丙酮溶液室温孵育30min，吸去丙酮，室温干燥Ih ;每孔加100 μ I 1: 1000稀释的鼠抗SlO蛋白多克隆抗体，37°C孵育lh，PBST洗涤3次，加入1:50稀释的羊抗鼠IgG-FITC标记的荧光二抗100μ 1，37°C孵育Ih ；PBST洗涤3次，最后加入细胞核染料碘化丙啶(PI)作用5min，荧光倒置显微镜(Nikon，Eclipse T1-S)下观察结果。阴性对照为未感染病毒的正常CIK细胞。
[0037]间接免疫荧光实验的结果显示，制备的多克隆抗体能使感染HZ08毒株的CIK细胞能产生特异性的荧光(见图6中A)，而在未感染病毒的正常CIK细胞中观察不到荧光信号。
[0038]九、动物免疫保护试验
以当年8 — 10 cm左右大小(大约20g-25 g)的草鱼作为免疫对象,在试验池中暂养2周后进行免疫试验。实验前采取10尾草鱼的血清，作为阴性对照。纯化的重组蛋白用无菌PBS稀释，试验分为3各组，每组30尾鱼，第一组没尾注射10 μ g重组蛋白；第二组注射20 μ g重组蛋白，第三组注射PBS作为空白对照。第一次免疫用弗氏完全佐剂1:1乳化，每尾腹腔注射200yL。免疫2周后，加强免疫用弗氏不完全佐剂1:1乳化，注射同样的量。分别从第一次2周和加强免疫2周后的每组鱼中采取4尾鱼的血清，用ELISA检测血清抗体的滴度。ELISA检测的操 作步骤为:大体步骤实施例第七步所述方法进行，只是这里的血清换成200倍稀释的草鱼血清作为一抗，每孔加入100 μ L，酶标二抗换成HRP标记的鼠抗草鱼IgM,最后用TMB显色试剂盒显色20min，加入0.5M的H2SO4终止显色，在酶标仪(InfiniteM200 PRO)上读 OD45tl 值(见表 I)。
[0039]表1免疫草鱼血清特异性抗体滴度
荜量血清腿驢_邮
试验组
—兔2屑后二免2周后
空白破_Cl 0S6 0*07S 0.1220.134 0.13 0.096 0.106 0.113
IOug0.223 0,218 0.1980.236 0.43 0.€21 0,398 CL 368
20ug fegffl 0.263 0,321 0.2920.346 0.76 0,542 0,435 0,587
以上实验结果表明，用SlO重组蛋白免疫草鱼，可使草鱼诱导产生较高的特异性抗体，并能对草鱼呼肠孤病毒强毒株的攻击起到一定的免疫保护作用。
[0040]以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
【权利要求】
1.一种草鱼呼肠孤病毒II型SlO基因编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
2.一种编码权利要求1所述蛋白的核酸，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
3.权利要求1所述的SlO基因编码蛋白作为鱼呼肠孤病毒抗原蛋白的应用。
4.一种多克隆抗体，其特征在于，是以氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示的蛋白为抗原，免疫动物制备所得。
5.权利要求1所述的SlO基因编码蛋白和/或权利要求4所述的多克隆抗体在制备草鱼出血病基因工程疫苗中的应用。
6.权利要求1所述的SlO基因编码蛋白在制备草鱼呼肠孤病毒检测试剂盒上的应用。
7.一种基因工程疫苗，其特征在于，含有权利要求1所述的SlO基因编码蛋白或含有权利要求4所述的多克隆抗体。
8.—种检测草鱼呼肠孤病毒的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的SlO基因编码蛋白。
【文档编号】G01N33/68GK103539842SQ201310513653
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年10月25日 优先权日:2013年10月25日
【发明者】曾伟伟, 王庆, 吴淑勤, 王英英, 梁红茹, 石存斌, 李莹莹, 刘春
申请人:中国水产科学研究院珠江水产研究所