一种化学降解法获得及检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法
【专利摘要】本发明属于医药领域，涉及一种化学降解法获得及检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法包括如下步骤：(1)将生物来源糖胺聚糖脱乙酰化，得脱乙酰糖胺聚糖；(2)将脱乙酰糖胺聚糖用亚硝酸降解，得糖胺聚糖二糖；(3)将糖胺聚糖二糖用衍生试剂衍生；(4)用液相色谱(LC)法或液相色谱质谱联用(LC-MS)法检测步骤(3)所得衍生后的二糖。本发明化学降解法可将生物来源糖胺聚糖完全降解为二糖，可以保存全部的糖醛酸信息，能够准确并且完全地得到二糖的结构信息；降解条件温和，成本低，操作简单，对实验仪器要求低，适用范围广，检测耗时短，样品消耗量小，灵敏度高，分析结果重复性好。
【专利说明】一种化学降解法获得及检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医药领域，涉及一种化学降解法获得及检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法。
【背景技术】
[0002]糖胺聚糖是一类由含氨基己糖重复二糖单元(氨基己糖和己糖糖醛组成的线性高分子多糖。其中透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素的重复二糖单元为氨基己糖和糖醛酸。硫酸角质素较为特殊，其重复二糖单元为氨基葡萄糖和半乳糖。糖胺聚糖以蛋白聚糖的形式存在于细胞表面和细胞内，并亦是所有细胞的胞外基质的主要组成成分。糖胺聚糖在胞外形成了细胞外的亲水环境，在细胞膜上和细胞内的糖胺聚糖是许多细胞生长因子及细胞与病毒的受体，它介导细胞内外的信号传导。
[0003]研究发现，几乎所有的动物细胞都合成糖胺聚糖。细胞是生命的基本单元，细胞中合成与降解糖胺聚糖很容易受到环境影响，于是检测细胞中糖胺聚糖在生物环境变化下的改变就变得尤为重要。如肿瘤组织和正常组织的硫酸乙酰肝素的组成及含量不同。在药物对细胞的影响实验中，常常会发现加药组细胞中的硫酸乙酰肝素结构及含量与正常细胞中的硫酸乙酰肝素不同。常用的分析糖胺聚糖二糖组成的方法为酶解二糖分析法，既将糖胺聚糖用肝素酶1、肝素酶I1、肝素酶II1、硫酸软骨素酶、透明质酸酶、硫酸角质素酶等逐一降解，得到二糖，再用离子交换柱分离并比对二糖标准品，从而确定二糖组成及含量。但是传统方法中所用到的每种酶所需要的降解条件不同，酶、二糖标准品、离子交换柱等价格昂贵、酶的活性容易受到样品中的杂质抑制，使得方法的重复性和准确性不高，操作步骤复杂，因此至今还没有用酶进行糖胺聚糖混合物二糖组成与结构鉴定的分析报道。除此之外，由于糖胺聚糖的结构类似性，将每一种糖胺聚糖，如来源于猪、羊、牛、鼠、斑马鱼等的组织(心、肝、脾、肺、肾、骨骼等)及细胞中的糖胺聚糖的提取纯化相当困难，并且有一些生物，如于小鼠、斑马鱼等细胞中的糖胺聚糖含量非常少，这使将每一种糖胺聚糖提取纯化并进行二糖组成分析几乎成为不可能因此，新的糖胺聚糖二糖组成测定方法对推进其研究、开发与应用至关重要。
【发明内容】
[0004]针对以上存在的不足，本发明提供一种全面、高效、简单、稳定且成本低的同时化学降解生物来源的全部糖胺聚糖的方法，本发明的另一目的是提供一种检测所有降解所得糖胺聚糖二糖的方法。
[0005]实现上述发明的技术方案是:
[0006]一种检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法，包括如下步骤:
[0007](I)将生物来源糖胺聚糖脱乙酰化，得脱乙酰糖胺聚糖；
[0008](2)将脱乙酰糖胺聚糖用亚硝酸降解，得糖胺聚糖二糖；
[0009](3)将糖胺聚糖二糖用衍生试剂衍生[0010]取步骤(2)所得糖胺聚糖二糖浓缩至干并完全溶解于水，然后调节pH值至碱性，加入吡唑啉酮类衍生试剂，反应完成后用氯仿萃取三次去除未反应的衍生试剂；
[0011](4)用液相色谱(LC)法或液相色谱质谱联用(LC-MS)法检测步骤(3)所得衍生后
的二糖。
[0012]2.一种检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法，步骤(1)所述的脱乙酰化反应步骤包括:
[0013]将生物来源糖胺聚糖溶于含有N2H4.H2SO4的N2H4.H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到91-114?，反应4-20h，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰糖胺聚糖。
[0014]3.一种检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法，步骤(2)所述的亚硝酸降解步骤包括:
[0015]将脱乙酰糖胺聚糖浓缩至干，溶于水中，加入pH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在0_5°C条件下反应，调节pH到4.0，加入pH为4.0的亚硝酸，在0_5°C条件下反应，加入氨水终止反应，得糖胺聚糖二糖。
[0016]本发明与现有技术相比具有以下优点:
[0017](I)本发明方法可将生物来源糖胺聚糖完全降解为二糖，可以保存全部的糖醛酸信息，能够准确并且完全地得到糖胺聚糖二糖的结构信息。
[0018](2)化学降解条件温和，成本低，操作简单，对实验仪器要求低。
[0019](3)适用范围广，适合所有生`物来源的糖胺聚糖。
[0020](4)检测耗时短，可以同时对多种样品进行定性定量检测。
[0021](5)样品消耗量小，灵敏度高，分析结果重复性好，检测限为ng级别。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1猪肺来源糖胺聚糖化学降解所得二糖D3PMP衍生LC图谱。
[0023]图2细胞来源糖胺聚糖PMP、D3PMP、D5PMP、D8PMP衍生总离子流图(A)和质谱图⑶。
【具体实施方式】
[0024]实例I猪肠黏膜来源糖胺聚糖化学降解
[0025](I)将Img本实验室从猪肠黏膜中提取的糖胺聚糖溶于500uL含有10% N2H4 -H2SO4的N2H4.H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到98°C，反应8小时，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰糖胺聚糖；
[0026](2)将步骤(1)所得脱乙酰糖胺聚糖溶于50uL水中，加入50uL pH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在4°C条件下反应10min后调节pH到4.0，加入50uL pH为4.0的亚硝酸，在4°C条件下反应10min,加入30uL氨水终止反应。
[0027]实例2猪肠黏膜来源糖胺聚糖化学降解
[0028](I)将Img本实验室从猪肠黏膜中提取的糖胺聚糖溶于ImL含有10% N2H4.H2SO4的N2H4.H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到114°C，反应20小时，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰糖胺聚糖；
[0029](2)将步骤(1)所得脱乙酰糖胺聚糖溶于50uL水中，加入50uL pH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在4°C条件下反应10min后调节pH到4.0，加入50uL pH为4.0的亚硝酸，在4°C条件下反应10min,加入30uL氨水终止反应。
[0030]实例3猪肠黏膜来源糖胺聚糖化学降解
[0031](I)将Img本实验室从猪肠黏膜中提取的糖胺聚糖溶于ImL含有10% N2H4-H2SO4的N2H4.H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到91°C，反应4小时，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰糖胺聚糖；
[0032](2)将步骤(1)所得脱乙酰糖胺聚糖溶于50uL水中，加入50uLpH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在4°C条件下反应10min后调节pH到4.0，加入50uL pH为4.0的亚硝酸，在4°C条件下反应10min,加入30uL氨水终止反应。
[0033]计算实施例1-3糖胺聚糖二糖得率，结果见表1。
[0034]表1施例1-3糖胺聚糖二糖得率
[0035]
【权利要求】
1.一种检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)将生物来源糖胺聚糖脱乙酰化，得脱乙酰糖胺聚糖； (2)将脱乙酰糖胺聚糖用亚硝酸降解，得糖胺聚糖二糖； (3)将糖胺聚糖二糖用衍生试剂衍生 取步骤(2)所得糖胺聚糖二糖浓缩至干并完全溶解于水，然后调节pH值至碱性，加入吡唑啉酮类衍生试剂，反应完成后用氯仿萃取三次去除未反应的衍生试剂； (4)用液相色谱(LC)法或液相质谱联用(LC-MS)法检测步骤(3)所得衍生后的二糖。
2.如权利要求1所述的一种检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法，其特征在于，步骤(1)所述的脱乙酰化反应步骤包括: 将生物来源糖胺聚糖溶于含有N2H4.H2SO4的N2H4.H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到91-114?，反应4-20h，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰糖胺聚糖。
3.如权利要求1所述的一种检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法，其特征在于，步骤(1)所述的脱乙酰化反应步骤包括: 将生物来源糖胺聚糖溶于含有N2H4.H2SO4的N2H4.H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到98°C，反应8h，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰糖胺聚糖。
4.如权利要求1所述的一种检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法，其特征在于，步骤(2)所述的亚硝酸降解步骤包括: 将脱乙酰糖胺聚糖浓缩至干，溶于水中，加入PH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在0-5°C条件下反应，调节PH到4.0，加入pH为4.0的亚硝酸，在0-5°C条件下反应，加入氨水终止反应，得糖胺聚糖二糖。
5.如权利要求1至4任意一项所述的一种检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法，其特征在于，步骤(1)所述的脱乙酰反应步骤中生物来源糖胺聚糖与N2H4.H2O溶液的质量体积比(mg / mL)为 1: 0.5-1, N2H4.H2O 溶液中含 10% N2H4.H2SO4。
6.如权利要求1至4任意一项所述的一种检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法，其特征在于，步骤(2)所述的亚硝酸降解步骤中脱乙酰糖胺聚糖水溶液与亚硝酸钠水溶液、亚硝酸、氨水的体积比为1:1:1: 0.6。
7.如权利要求1至4任意一项所述的一种检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法，其特征在于，步骤(3)所述的糖胺聚糖二糖与吡唑啉酮类衍生试剂的质量比为1: 6-60。
8.如权利要求1至4任意一项所述的一种检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法，其特征在于，步骤(3)所述的吡唑啉酮类衍生试剂包括1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，1-苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D3PMP)，1-氘代苯基_3_甲基-5-吡唑啉酮(D5PMP)或1-氘代苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D8PMP)。
9.如权利要求1至4任意一项所述的一种检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法，其特征在于，步骤(3)所述的吡唑啉酮类衍生试剂包括？1^、03?1^、05?10\08?1^中的一种或任意几种联用。
【文档编号】G01N30/06GK103698425SQ201310695163
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月12日 优先权日:2013年12月12日
【发明者】张丽娟, 韩章润, 曾洋洋, 兰莹, 邱培菊 申请人:中国海洋大学