一种检测泪液中乳铁蛋白的专用胶体金检测卡的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种检测泪液中乳铁蛋白的专用胶体金检测卡，属于医用诊断试剂【技术领域】。本乳铁蛋白快速胶体金检测卡是由检测卡和胶体金试纸条两部分组成，将乳铁蛋白作为抗原通过免疫小鼠得到灵敏度高、特异性强的乳铁蛋白单克隆抗体，利用胶体金层析法制得乳铁蛋白胶体金检测试纸，试纸通过凹槽固定于检测卡内部。本实用新型应用免疫胶体金法检测泪液中乳铁蛋白含量，具有检测费用低、准确程度高等优点。
【专利说明】一种检测泪液中乳铁蛋白的专用胶体金检测卡
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及一种检测泪液中乳铁蛋白的专用胶体金检测卡，是一种检测泪液中乳铁蛋白的检测器具，属于医用诊断试剂【技术领域】。
【背景技术】
[0002]乳铁蛋白(lactoferrin, LF)是一种糖基化蛋白，属于铁结合蛋白家族，它能够可逆性地结合两个铁离子，它最早是从牛乳中分离出来，故而得名。人乳铁蛋白分子量约80kDa，等电点约为7.8，由692个氨基酸组成，存在于人体的多种体液和分泌液中如泪液、唾液、乳汁等。乳铁蛋白具有广谱的抗菌功能，主要是由于乳铁蛋白可以与铁离子结合，因而能竞争性抑制需铁的革兰氏阳性菌，此外还可与许多蛋白质和DNA结合发挥抗癌抗微生物的作用。乳铁蛋白具有广泛的抗病毒活性，作用的范围包括DNA病毒和RNA病毒，其对病毒的抗性表现在抵抗病毒对细胞表面的吸附作用上，直接和病毒或病毒的受体结合，从而消除病毒的入侵能力。此外，乳铁蛋白还具有抗癌细胞、抑制胆固醇积累、抑制脂质过氧化的功能。
[0003]泪液中乳铁蛋白主要由泪腺分泌产生，与泪液溶菌酶、泪液前清蛋白以及少量分泌性免疫球蛋白和生长因子共同构成了泪液中蛋白的主要成分，保护眼表面不受外物入侵。角结膜干燥症又称干眼，是任何原因引起泪液质和量异常或动力学异常导致的泪膜稳定性下降，并伴有眼部不适，导致眼表组织病变为特征的多种疾病的总称，常见干眼病的症状有眼睛有干涩、灼痛感、眼屎较多；眼酸、眼痒、怕光和视力减退等。近年来干眼病的年轻化趋势明显，主要是由于现代生活中，青年人的工作和娱乐与电视、电脑接触得越来越多，长时间面对荧光屏，缺乏适时地眨眼或让眼睛休息，影响了双眼的泪液分泌。临床上诊断干眼病的检查包括泪液分泌实验、泪膜破裂时间、角结膜上皮染色、印记细胞学检查、溶菌酶含量检测、乳铁蛋白含量检测等。泪液乳铁蛋白的含量相对比较稳定，正常泪液中乳铁蛋白的含量在1.14^1.78g/L之间 ，重复性较好，如果泪液中乳铁蛋白含量低于0.9g/L，则可诊断为干眼病。
[0004]泪液中乳铁蛋白的检测方法主要有分光光度法和高效液相色谱法等。分光光度法和高效液相色谱法操作简便，但需要检测的样品量比较大，而泪液标本的量非常少，因此不适用于泪液中乳铁蛋白的检测。本实用新型是一种基于乳铁蛋白具有抗原性的免疫学检测方法，采取免疫学竞争法的原理，结合胶体金标记技术和免疫层析法设计的一种快速检测试剂，可快速特异地检测泪液中的乳铁蛋白。根据检测卡样品检测线(T)和质控线(C)的有无显色来判定样品中的乳铁蛋白含量。本实用新型是利用乳铁蛋白抗原性而建立的一种检测工具，具有样品量少、特异性强的优点，同时检测卡操作简单快速，无需特殊的仪器设备，适合现场操作。
实用新型内容
[0005]本实用新型目的是提供一种检测泪液乳铁蛋白的专用胶体金检测卡。[0006]本实用新型所提供的检测泪液中乳铁蛋白含量的专用胶体金检测卡(见附图)，其为在长条扁平薄壳状的检测卡外壳I中设置测试条2，检测卡外壳表面有检测窗孔3和加样孔4 ;测试条2是由支承背板5上通过不干胶在其上依次粘贴样品垫8、胶体金膜7、纤维素膜6、和吸水膜9所组成；支承背板中部叠置粘贴纤维素膜6，支承背板一端叠置粘贴吸水膜9，支承背板另一端叠置粘贴样品垫8，吸水膜内端与样品垫内端各自分别与纤维素膜搭接，在样品垫与纤维素膜的搭接部，两者之间夹置粘贴一段胶体金膜7 ;胶体金膜为含抗乳铁蛋白抗体胶体金标记的玻璃纤维膜，纤维素膜上有一条检测带和一条质控带，依次是:含乳铁蛋白的检测带10，含抗兔抗体或抗鼠抗体的质控带11，测试条置入检测卡外壳内，样品垫正对加样孔，纤维素膜正对检测窗孔。
[0007]所述的支承背板5为不吸水的韧性材料。
[0008]所述的韧性材料用硬质塑胶条或不吸水硬纸条制成。
[0009]所述的样品垫8为玻璃纤维膜，或尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜、聚酯膜。
[0010]胶体金膜7的结合垫也为玻璃纤维膜，或尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜、聚酯膜。
[0011]所述的纤维素膜6为硝酸纤维素膜，或羧化纤维素膜。
[0012]所述的吸水膜9为吸水能力较强的吸水滤纸或滤油纸。
[0013]所述的乳铁蛋白金标抗体为胶体金标记的乳铁蛋白单克隆抗体。
[0014]本实用新型所提供的胶体金检测卡检测泪液中乳铁蛋白含量的方法，包括以下步骤:
[0015](I)样品处理
[0016]新鲜泪液样品可直接用于检测，冷冻或冷藏泪液样品需复温至室温进行检测。
[0017](2)利用上述胶体金检测卡检测样品中乳铁蛋白
[0018]本发明的胶体金检测卡可定性、半定量检测泪液样本中乳铁蛋白含量。将检测卡从检测卡袋中取出，放置室温，做好样品编号标记；用一次性滴管吸取样品，滴入加样孔中，每孔3滴，加样过程中勿使液体溢出加样孔；5分钟内观察结果。
[0019]本实用新型的有益效果:用本发明所述的胶体金检测卡检测泪液中乳铁蛋白含量的方法，优点是检测所需泪液样品量少，且使用方便、检测快速、灵敏度高、结果准确。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1乳铁蛋白快速检测卡外壳及测试条在外壳内的安置图。1、检测卡外壳，2、测试条，3、检测窗孔，4、加样孔。
[0021]图2检测试条的纤维素膜上显示印迹示意图。6、纤维素膜，10、检测带，11、质控带。
[0022]图3乳铁蛋白快速检测卡的检测试条结构示意图。5、支承背板，6、纤维素膜，7、胶体金膜，8、样品垫，9、吸水膜。
【具体实施方式】
[0023]实施例1乳铁蛋白单克隆抗体的制备
[0024]动物程序:以乳铁蛋白作为抗原，IOOyg/只的免疫剂量用等体积的弗氏完全佐剂充分乳化后腹腔多点注射免疫2只Balb/c小鼠，每隔2?3周再用相同剂量抗原用弗氏不完全佐剂乳化后免疫2?3次，融合前三天加强免疫一次。
[0025]细胞融合与克隆化:取免疫Balb/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按5:1比例融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌抗乳铁蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0026]细胞冻存和复苏:取处于对数生长期的乳铁蛋白的单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成5X IO6个/mL的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37 °C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
[0027]单克隆抗体的制备与纯化:选择10周龄的Balb/c小鼠，腹腔注射杂交瘤细胞悬液，接种细胞广10天后收集腹水,经辛酸-饱和硫酸胺法和Protein A亲和层析法纯化。
[0028]实施例2胶体金标记乳铁蛋白单克隆抗体复合物的制备
[0029]胶体金颗粒的制备:取1%氯金酸溶液lmL，加99mL超纯水成终浓度0.01%的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1%柠檬酸三钠1.6mL—次性迅速加入煮沸的上述氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5分钟，室温冷却,加水至原体积。
[0030]金标抗体的制备和纯化:用0.lmol/L K2CO3调节胶体金溶液pH到最佳pH值，均匀搅拌的同时逐滴加入最佳蛋白量的莱克多巴胺单克隆抗体，5分钟内全部加完，避光继续搅拌30分钟后，取最佳配方的稳定液平衡胶体金溶液中，全部加完后，4°C高速离心对标记的蛋白质进行纯化和浓缩以除去未参与标记的过量的蛋白质、未完全稳定的胶体金颗粒以及各种可能形成的聚合物。
[0031]实施例3乳铁蛋白胶体金快速检测卡的组装
[0032]将金标抗体适当稀释后用喷金机喷在结合垫，37°C干燥，得胶体金膜。乳铁蛋白用
0.01mol/L pH7.4的磷酸缓冲液稀释至最佳浓度，用喷膜仪喷涂于纤维素膜6上，此为检测线10 ;在离检测线上方5毫米处喷涂最佳浓度的羊抗鼠IgG，此为质控线11。37°C干燥后，将纤维素膜、胶体金膜、样品垫和吸水纸依次组装在底板上，用自动斩切机切成合适宽度的试纸条装入检测卡外壳中。
[0033]实施例4乳铁蛋白胶体金检测卡检测反应原理
[0034]当待测样品溶液加入检测卡的加样孔后，待测溶液通过虹吸作用带动待测物及金标结合垫中的金标抗体一起向纤维素膜扩散，并最终渗入吸水垫端。在扩散过程中，如果样品中有待测物时，待测物和金标抗体结合，进而占据了金标抗体上的抗原结合位点，阻止金标抗体与纤维素膜上检测线(乳铁蛋白)的结合，使检测线不显色或者显色很弱即表示检测样品阳性或者弱阳性(样品中乳铁蛋白的含量达到一定浓度)；如果样品中没有待测样品时，金标抗体在上移过程中，遇检测线显示一条清晰红线即表示检测样品阴性(样品中乳铁蛋白的含量未达到一定浓度)。同样，金标抗体也与纤维素膜上的质控线(羊抗鼠IgG)结合，使质控线显红色。质控线颜色的有或无分别表示此检测卡的有效或无效。
[0035]实施例5:(应用实施例)
[0036]特异性试验:按实施例4所述的原理进行试验，将泪液中其他蛋白溶菌酶、人血清白蛋白、人转铁蛋白的标准品配成10g/L，用本发明检测卡进行检测，结果显示纤维素膜上检测线和质控线均出线(显色)，即乳铁蛋白检测卡与其他泪液蛋白没有交叉反应，从而断定此检测卡特异性好，在进行检测时不会受其他样品的干扰。[0037]敏感性和均一性试验:按实施例4所述的原理进行试验，用本发明胶体金检测卡进行检测0、0.3,0.6,0.9、1.2、1.5和3g/L的人乳铁蛋白标准品，重复10次，其中0、0.3和
0.6g/L的人乳铁蛋白标准品检测的检测结果为纤维素膜上检测线和质控线均出线，0.9、
1.2、1.5和3g/L的人乳铁蛋白标准品检测的检测结果为纤维素膜上仅质控线出线。因此本发明检测试纸条的灵敏度为0.9g/L。重复10次检测显色深度均一，检测结果显示一致。
[0038]稳定性试验:将检测卡放入铝箔袋中密封包装，同时每个铝箔袋包装内装一包干燥剂，室温保存12个月后各项指标均符合，即检测泪液中其他蛋白无交叉反应，灵敏度达
0.9g/L，检测显示深度均一，反应结果一致。
【权利要求】
1.一种测定泪液中乳铁蛋白含量的专用胶体金检测卡，其特征在于其为在长条扁平薄壳状的检测卡外壳(I)中设置测试条(2)，检测卡外壳表面有检测窗孔(3)和加样孔(4)；测试条(2)是由支承背板(5)上通过不干胶在其上依次粘贴样品垫(8)、胶体金膜(7)、纤维素膜(6)、和吸水膜(9)所组成；支承背板(5)中部叠置粘贴纤维素膜(6)，支承背板(5) —端叠置粘贴吸水膜(9)，支承背板(5)另一端叠置粘贴样品垫(8)，吸水膜(9)内端与样品垫(8)内端各自分别与纤维素膜(6)搭接，在样品垫(8)与纤维素膜(6)的搭接部，两者之间夹置粘贴一段胶体金膜(7);胶体金膜(7)为含抗乳铁蛋白抗体胶体金标记的玻璃纤维膜，纤维素膜上有一条检测带和一条质控带，依次是:含乳铁蛋白的检测带(10)，含抗兔抗体或抗鼠抗体的质控带(11)，测试条(2)置入检测卡外壳(I)内，样品垫(8)正对加样孔(4)，纤维素膜(6)正对检测窗孔(3)； 所述的支承背板(5)为不吸水的韧性材料，所述的韧性材料用硬质塑胶条或不吸水硬纸条制成； 所述的样品垫(8)为玻璃纤维膜，或尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜、聚酯膜； 所述的纤维素膜(6)为硝酸纤维素膜，或羧化纤维素膜； 所述的吸水膜(9)为吸水能力较强的吸水滤纸或滤油纸。
【文档编号】G01N33/68GK203385736SQ201320403808
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年7月8日 优先权日:2013年7月8日
【发明者】周坚, 王黎丽 申请人:无锡安迪生物工程有限公司