一种四环素的免疫学检测试纸卡的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种四环素的免疫学检测试纸卡。本实用新型的技术方案要点为：一种四环素的免疫学检测试纸卡，包括塑料盒体和封装于塑料盒体内的试纸条，所述的试纸条的底层为支撑层，该支撑层上由左到右依次附着有紧密相连的样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述的塑料盒体上开有加样孔和观察窗，该加样孔的位置与试纸条上的样品垫位置相对应，观察窗与试纸条上的硝酸纤维素膜位置相对应。本实用新型操作简单、快速准确、灵敏度高、成本低、稳定性好，可进行批量检测。
【专利说明】—种四环素的免疫学检测试纸卡【技术领域】
[0001]本实用新型属于食品安全一兽药残留免疫化学检测【技术领域】，具体涉及一种四环素的免疫学检测试纸卡。
【背景技术】
[0002]四环素类药物(Tetracycline, TCs)是由链霉菌产生的一类碱性广谱抗生素，在化学结构上属于多环并四苯羧基酰胺母核的衍生物，包括金霉素、土霉素、四环素和去甲金霉素，以及半合成的多西环素和米诺环素等。该类药物能特异性地与细菌核糖体30S亚基的A位置结合，阻止氨基酰-tRNA在该位置上的联结，从而抑制肽链的增长、影响细菌蛋白质的合成。四环素类药物主要用于立克氏次体、衣原体、支原体及回归热螺旋体等非细菌性感染，以及治疗敏感菌引起的呼吸道、胆道、尿路及皮肤软组织等部位的多种感染性疾病。在畜禽生产中，四环素类药物被广泛作为治疗药物和药物添加剂使用，用于防治消化道感染、促进生长和提高奶牛产奶量。
[0003]随着四环素类抗生素被大量、广泛的应用于禽畜养殖业，其造成的食品残留给人类身心健康带来极大的安全隐患。人长期摄入四环素类抗生素会引起各种慢性和蓄积性疾病，主要表现为对胃、肠、肝脏的损害，以及牙齿的染色，还会造成过敏反应、二重感染、致畸胎等，同时还会导致人体肠道中菌群平衡的失调以及耐药菌株的产生。因此，世界各国对TCs残留检测十分关注。日本要求进口畜禽肉中四环素族残留量不得超过0.05 mg/kg，澳大利亚规定四环素类总量不得大于0.3 mg/kg，欧盟一律标准为0.01 mg/kg，美国药品监督管理局规定TCs在动物肌肉组织中残留总量不超过0.02 mg/kg，牛奶中为0.3 mg/kg。我国农业部于2002年修订了《动物性食品中兽药最高残留限量》，其中规定牛/羊奶以及所有动物肌肉中四环素类抗生素的最高残留量为0.1 mg/kg，对动物肝脏、肾脏、蛋中四环素残留也有相应限量规定。
[0004]食品中四环素类抗生素残留检测方法有高效液相色谱法、毛细管电泳法、电化学分析、化学发光及液相色谱一质谱联用法等，这些方法对待测样品的前处理要求高，且操作烦琐，需要精密的仪器设备；与之相比，免疫学分析技术具有灵敏、快速、特异、简便等优点，是近年来逐渐发展起来的一种重要的痕量检测技术，在兽药残留分析领域应用越来越多，具有广阔的推广应用前景。
[0005]胶体金标记免疫分析法是近年来迅速发展的一种新型分析技术，其特点是简便快速、成本低、无污染、无需培训，非常适合于现场检测。与ELISA相比，具有样品前处理简单，显色时间短(3-5 min)，且所有试剂包含在一根试纸条上，无需使用仪器等优点，具有广阔的市场前景和应用价值。因此，研制快速、灵敏、高效的四环素免疫学检测试纸卡对于保障动物性食品安全具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0006]本实用新型解决的技术问题是提供了一种操作简单、快速准确、灵敏度高、成本低、稳定性好，可进行批量检测的四环素的免疫学检测试纸卡。
[0007]本实用新型的技术方案是:一种四环素的免疫学检测试纸卡，其特征在于:所述的四环素的免疫学检测试纸卡包括塑料盒体和封装于塑料盒体内的试纸条，所述的试纸条的底层为支撑层，该支撑层上由左到右依次附着有紧密相连的样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述的塑料盒体上开有加样孔和观察窗，该加样孔的位置与试纸条上的样品垫位置相对应，观察窗与试纸条上的硝酸纤维素膜位置相对应，所述的硝酸纤维素膜上有四环素一载体蛋白偶联物溶液印制的检测线(T线)和羊抗鼠IgG溶液印制的质控线(C线)，两者间距5 _，其中四环素一载体蛋白偶联物溶液印制的检测线(T线)位于靠近样品垫的一侧，所述的结合垫上灌注有胶体金标记的抗四环素单克隆抗体。
[0008]本实用新型所述的支撑层是由聚氯乙烯树脂与稳定剂及辅料配合制成的PVC板。本实用新型所述的吸收垫是由吸水能力极强的植物长纤维为原材料制成的纯白滤纸。本实用新型所述的样品垫和金标抗体结合垫是由玻璃纤维棉制作而成的。本实用新型所述的样品垫和金标抗体结合垫的叠压宽度为2 mm,吸收垫与硝酸纤维素膜的叠压宽度为2 _。本实用新型所述的样品垫、金标抗体结合垫和吸收垫上方覆盖有胶膜保护层。本实用新型所述的硝酸纤维素膜两端分界处有标记线。
[0009]本实用新型具有以下优点:(1)灵敏度高、特异性强。四环素的免疫学检测试纸卡以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子通过异性电荷间范德华力相结合，胶体金对单克隆抗体的特异性和亲和力影响很小。因此，快速检测试纸卡具有较高的灵敏度和特异性，其检测灵敏度可达6 ng/ml ；
[0010](2)操作简单、方便快捷。使用快速检测试纸卡时无需其它任何试剂，只要将处理后的样品溶液用滴管滴入试纸卡加样孔内3~4滴，3飞min即可观察结果；
[0011](3)检测结果形象、直观。试纸卡以红色印迹线“ I ”或“ Il ”作为检测线的阳性和阴性标记，即在硝酸纤维素膜上质控线(C线)显示一条红色“ I ”印迹时，表示被检测样品溶液中四环素残留含量≤6 ng/ml ;若硝酸纤维素膜上质控线(C线)和检测线(T线)同时出现两条红色“ Il ”印迹时，表示样品溶液中四环素残留含量<6 ng/ml。结果形象直观，简单准确，不容易出现误判；
[0012](4)胶膜的使用可以延长检测结果观察时间，试纸卡稳定性好。本试纸卡样品吸收垫将检测溶液完全吸收，使之与偶联垫上金标抗体充分反应，可以有效减少误差率；还可以防止外界杂质干扰，影响金标抗体与检测抗原的结合；
[0013](5)成本低、投资少。使用本实用新型试纸卡，不需要另配复杂的仪器设备和昂贵的试剂，现场检测一步到位，成本低廉，见效快；
[0014](6)易于大范围推广应用。本试纸卡操作简单，适合不同类别的人员使用，如实验室检测、海关检疫、卫生监督、规模养殖及个体生产等，具有广阔的市场前景和较大的经济效益和社会效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1是本实用新型的结构示意图；图2是本实用新型中试纸条的侧视图；图3是本实用新型中试纸条的俯视图。【具体实施方式】
[0016]结合附图详细描述实施例。一种四环素的免疫学检测试纸卡，包括塑料盒体I和封装于塑料盒体I内的试纸条2，所述的试纸条2的底层为支撑层3，该支撑层3上由左到右依次附着有紧密相连的样品垫4、金标抗体结合垫5、硝酸纤维素膜6和吸收垫7，所述的塑料盒体I上开有加样孔8和观察窗9，该加样孔8的位置与试纸条2上的样品垫4位置相对应，观察窗9与试纸条2上的硝酸纤维素膜6位置相对应，所述的硝酸纤维素膜6上有四环素一载体蛋白偶联物溶液印制的检测线(T线)11和羊抗鼠I gG溶液印制的质控线(C线)10，两者间距5 _，其中四环素一载体蛋白偶联物溶液印制的检测线(T线)11位于靠近样品垫4的一侧，所述的结合垫5上灌注有胶体金标记的抗四环素单克隆抗体。
[0017]本实用新型所述的支撑层3是由聚氯乙烯树脂与稳定剂及辅料配合制成的PVC板。本实用新型所述的吸收垫7是由吸水能力极强的植物长纤维为原材料制成的纯白滤纸。本实用新型所述的样品垫4和金标抗体结合垫5是由玻璃纤维棉制作而成的。本实用新型所述的样品垫4和金标抗体结合垫5的叠压宽度为2 mm,吸收垫7与硝酸纤维素膜6的叠压宽度为2 _。本实用新型所述的样品垫4、金标抗体结合垫5和吸收垫7上方覆盖有胶膜保护层12。本实用新型所述的硝酸纤维素膜6两端分界处有标记线13。
[0018]本实用新型所述的试纸卡的检测原理:
[0019]试纸卡根据抗原抗体竞争性免疫层析原理设计。滴加样品液后，在吸收垫和硝酸纤维素膜的毛细作用下，样品溶液向上迁移，到达结合垫时，金标抗体将被溶解。当样品中含有四环素时，它们将和金标抗体结合，并一起向上迁移，到达固定有TC-OVA的检测线位置时，检测抗原将和四环素竞争结合金标抗体上有限的抗原结合位点。样品中TC含量越高，检测抗原和金标抗体结合数量就越少，T线显色就越弱；当样品中TC高于一定数值(6ng/ml)时，检测抗原就无法和金标抗体结合，T线不显色。无论样品中是否有TC存在，过量的金标抗体或检测抗原与金标抗体的结合物都将和二抗GaMIgG结合，在C线形成红色。
[0020]本实用新型所述的试纸卡的使用方法:
[0021]I)样品前处理:
[0022]称取切碎、匀质后的动物组织样品1.0±0.05 g至5 ml离心管中，加入2 ml pH
4.0的Mcllvaine-EDTA样品提取液,镟润混合3?5 min,室温下4000 r/min离心5 min ；移取I ml上清液于5 ml离心管中，加入50 μ I 4 mol/L NaOH,振荡混勻；再加入I ml正己烷，漩涡混合30 s;静置5 min分层后，吸取至少100 μ I下层溶液与等体积PBS缓冲液混合后待检。
[0023]2)样品滴加:
[0024]将试纸卡平放后，用滴管将样品溶液滴入试纸卡加样孔内3?4滴，3飞min后即可观察结果。
[0025]3)检测结果分析:
[0026]阴性:若硝酸纤维素膜上质控线(C线)和检测线(T线)同时出现两条红色“ Il ”印迹时，表示样品溶液中四环素残留含量< 6 ng/ml，判为阴性。
[0027]阳性:若硝酸纤维素膜上质控线(C线)显示一条红色“ I ”印迹，而检测线(T线)不显色，表示被检测样品溶液中四环素残留含量> 6 ng/ml，判为阳性。
[0028]无效:若硝酸纤维素膜上质控线(C线)不显示红色条带，则无论检测线(T线)是否出现红色印迹，该试纸卡均判为无效。
【权利要求】
1.一种四环素的免疫学检测试纸卡，其特征在于:所述的四环素的免疫学检测试纸卡包括塑料盒体和封装于塑料盒体内的试纸条，所述的试纸条的底层为支撑层，该支撑层上由左到右依次附着有紧密相连的样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述的塑料盒体上开有加样孔和观察窗，该加样孔的位置与试纸条上的样品垫位置相对应，观察窗与试纸条上的硝酸纤维素膜位置相对应，所述的硝酸纤维素膜上有四环素一载体蛋白偶联物溶液印制的检测线和羊抗鼠IgG溶液印制的质控线，两者间距5 mm，其中四环素一载体蛋白偶联物溶液印制的检测线位于靠近样品垫的一侧，所述的结合垫上灌注有胶体金标记的抗四环素单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的四环素的免疫学检测试纸卡，其特征在于:所述的支撑层是PVC 板。
3.根据权利要求1所述的四环素的免疫学检测试纸卡，其特征在于:所述的吸收垫是由植物长纤维为原材料制成的纯白滤纸。
4.根据权利要求1所述的四环素的免疫学检测试纸卡，其特征在于:所述的样品垫和金标抗体结合垫是由玻璃纤维棉制作而成的。
5.根据权利要求1所述的四环素的免疫学检测试纸卡，其特征在于:所述的样品垫和金标抗体结合垫的叠压宽度为2 mm,吸收垫与硝酸纤维素膜的叠压宽度为2 mm。
6.根据权利要求1所述的四环素的免疫学检测试纸卡，其特征在于:所述的样品垫、金标抗体结合垫和吸收垫上方覆盖有胶膜保护层。
7.根据权利要求1所述的四环素的免疫学检测试纸卡，其特征在于:所述的硝酸纤维素膜两端分界处有标记线。
【文档编号】G01N33/577GK203385730SQ201320434943
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年7月19日 优先权日:2013年7月19日
【发明者】原小燕, 王玉桥, 王文典, 郭芳, 王洪润, 张绍铃, 栗克文 申请人:河南知微生物工程有限公司