表征聚合物的装置制造方法

表征聚合物的装置制造方法
【专利摘要】本发明公开了一种装置，其包括（a）多个腔室，每个腔室与相邻的腔室通过至少一个孔连通，其中所述装置含有被定义为第一孔和第二孔的至少两个孔，（b）用于将所述聚合物的至少一部分从所述第一孔移出并移入所述第二孔的装置，以及（c）至少一个传感器，所述传感器能够在所述聚合物移动通过所述第一孔和第二孔期间识别所述聚合物的单个成分，条件是当仅使用单个传感器时，所述单个传感器不包括设置在一个孔的两端用来测量通过该孔的离子电流的两个电极。本发明还公开了使用该装置的方法。
【专利说明】表征聚合物的装置
[0001]背景
纳米孔是纳米级通道，其在脂质膜中天然地形成为蛋白通道(生物学孔)，或通过在固态基质中钻出或蚀刻出开口而形成(固态孔)。当这种纳米孔被用在包含两个腔室(由该纳米孔隔开)的纳米装置中时，可利用敏感型膜片钳放大器来施加跨膜电压并测定通过该孔的离子电流。
[0002]纳米孔为廉价的全基因组DNA测序提供了良好的前景。在这个方面，单个DNA分子可被捕获并通过电泳驱动通过该孔，每次捕获事件都被检测为离子电流的暂时改变。因而,DNA分子的序列可从DNA通过该孔通道时被改变的离子电流记录内的图表(pattern)中推知。
[0003]原则上，纳米孔测序器可不需要样品扩增，不需使用测序操作期间实现催化功能的酶和试剂，并且不需要用于检测测序进度的光学仪器，这些中的某一些或全部是常规的合成法测序所需要的。
[0004]电子纳米孔传感器可被用来检测不超过血液样品或唾液样品中可获得的DNA浓度/体积。此外，纳米孔有希望急剧增加被测序DNA的读取长度(从450个碱基增加至大于10000个碱基)。
[0005]纳米孔测序的两个主要障碍是:(1)对从头测序而言，缺乏足以精确确定核酸中每个核苷酸的特性的敏感度(缺乏单核苷酸敏感度)；和(2)检测期间调节每个核苷酸单元通过纳米孔的输送速率的能力。虽然很多研究小组正在开发和改善纳米孔以解决障碍I，但没有一种方法能在不涉及使用酶或光学仪器的情况下解决障碍2，酶和光学仪器仅在特殊的纳米孔技术中有作用，并且与纯电子方法相比，它们造成更高的复杂性和成本。
[0006]概述
在一个实施方式中，本发明提供一种装置，其包括(a)多个腔室，每个腔室通过至少一个孔与相邻腔室连通，其中所述装置含有至少两个孔，即第一孔和第二孔，(b)用于从第一孔移出至少一部分聚合物到第二孔中的装置，以及(C)至少一个传感器，所述传感器能够在聚合物经过第一孔和第二孔的移动期间识别聚合物的单个成分，但当仅使用单个传感器时，该单个传感器不包括位于孔的两端、用于测量经过孔的离子电流的两个电极。
[0007]在一个实施方式中，第一孔和第二孔的直径为约I nm至约100 nm，并且彼此间隔约 10 nm 至约 10000 nm。
[0008]在一个实施方式中，传感器被配置成通过测定与聚合物或聚合物的一个或多个成分相关的电流、电压、pH、光学特征或驻留时间来识别该聚合物。
[0009]在一个实施方式中，传感器被配置成形成隧道间隙(tunnel gap)，以当聚合物被加载在第一孔和第二孔时允许聚合物通过该隧道间隙。
[0010]在一个实施方式中，传感器包括膜，该膜具有形成该隧道间隙的孔。在一个实施方式中，孔是实质上圆形的。
[0011]在一个实施方式中，传感器包括两个端部，在两个端部之间形成隧道间隙。
[0012]在一个实施方式中，传感器包括一个端部和一个实质上平坦的表面，在该端部和表面之间形成隧道间隙。在一个实施方式中，传感器包括两个电极，这两个电极被间隔开以在它们之间形成隧道间隙。
[0013]在一个实施方式中,传感器被放置在第一孔内。在另一个实施方式中，传感器被放置在第一孔和第二孔之间的腔室内。在一个实施方式中，提供一种装置，其中传感器与第一孔和第二孔对准。
[0014]在一个实施方式中，传感器包含金、钼、石墨烯或碳。
[0015]在一个实施方式中，所述隧道间隙为约I nm至约50 nm宽。
[0016]在一个实施方式中，传感器包括经试剂改性的表面。在一个实施方式中，该试剂能够与聚合物的单元(例如核苷酸)形成非共价键。在一个实施方式中，该键为氢键。在另一个实施方式中，该键选自离子键、金属键、堆积作用、或范德华相互作用。
[0017]在一个实施方式中，该试剂通过游离酰胺形成氢键。这些试剂的非限制性例子为4-巯基苯甲酰胺和1-H-咪唑-2-甲酰胺。在另一个实施方式中，氢键通过羧酸形成，例如巯基苯甲酸。在另一个实施方式中，氢键通过羟基或醇(例如巯基苯甲醇)形成。
[0018]在一个实施方式中，该试剂利用电荷-电荷相互作用与例如膦酸盐形成离子键，该膦酸盐与聚合物的带正电的单元相互作用。
[0019]在一个实施方式中，第一孔和第二孔基本上是共轴的。
[0020]在一个实施方式中，所述装置包括选自以下的材料:硅、氮化硅、二氧化硅、石墨烯、碳纳米管、TiO2, HfO2, Al2O3、金属层、玻璃、生物纳米孔、氧化铪(HfO2)、具有生物插入孔的膜以及它们的组合。
[0021]在一个实施方式中，第一孔和第二孔为约0.3 nm至约100 nm深。
[0022]在一个实施方式中，所述装置包括至少两个电极，用于连接至电源从而在第一孔和第二孔上产生电压。在一个实施方式中，横跨第一孔和横跨第二孔的电压是独立可调的。
[0023]在一个实施方式中，本发明还提供一种确定多核苷酸的序列的方法，其包括:
(a)加载包含多核苷酸的样品，
(b)调节横跨第一孔和横跨第二孔的电压，从而使所述多核苷酸横跨两个孔，其中该多核苷酸以相同的方向移动通过这两个孔，以及
(c )使用传感器识别所述多核苷酸的多个核苷酸。
[0024]在一个实施方式中，本发明还提供一种确定多肽的序列的方法，其包括:
(a)加载包含多肽的样品，
(b)调节横跨第一孔和横跨第二孔的电压，从而使所述多肽横跨两个孔，其中该多肽以相同的方向移动通过这两个孔，以及
(C)使用传感器识别所述多肽的多个氨基酸。
[0025]附图简述
以本发明的实施方式形式提供的附图仅是对本发明示例性的说明，而并非限制，其
中:
图1-8图示了具有分离出多个腔室的至少两个孔的装置。
[0026]具体而言，图1是双孔芯片以及用于实现每个孔的独立的电压控制(K,，V2)和电流(/7，厶)测量的双放大器电子构造的示意图。图中显示有三个腔室A-C，它们除共用孔外在体积上是分离的。合适的芯片参数例如是，孔间距离10-500 nm，膜厚0.3-50 nm，孔径1-100 nm。
[0027]图2是电气部分的示意图,通过构建出使所有接入电阻(access resistance)最小化从而有效解耦I1和I2的装置，V1和V2可主要通过每个纳米孔电阻。
[0028]在图3中使用竞争电压作为对照，蓝色箭头显示每个电压作用力(voltageforce)的方向。假设孔具有相同的电压作用力影响，使用|Κ7| = \V2\ + ?/Κ，值?/V > O ?O)被调节用于K7(G)方向的通道移动。实际操作时，虽然每个孔处的电压诱导的作用不会等同于K7 = ^但校准实验可确定出对于既定的双孔芯片导致产生相等推动力所需的偏压，并且该偏压的上下变动随后可被用于方向控制。
[0029]图4至7图示了用于各种不同的传感器放置构造。具体而言，图4显示包含两个电极的传感器可被放置在孔内。图5显示显示包括两个电极的传感器可被放置在孔的出口处。图6显示包括两个电极的传感器可被放置在两个孔之间。图7显示传感器被放置在两个孔之间，传感器具有两个电极，其中一个电极是平整的表面。
[0030]图8显示了膜形式的传感器可具有允许聚合物通过的孔。
[0031]图9显示具有腔室Α、腔室B和腔室C的双孔外罩装置的外部视图，每个腔室具有一个用于流体获取和样品加载的开口。一个双孔芯片被放置在两个垫圈之间，每个垫圈构成外罩装置的每个部件的一部分，两个部件绕铰链(中间顶部)转动从而围绕芯片打开和关闭外罩。
[0032]这些图中的某一些或全部是示意性说明的示例；因此，它们不必然图示了所显示的元件的实际相对尺 寸或位置。这些图仅为解释一个或多个实施方式而提供，要清楚地理解的是，它们不被用于限制本发明权利要求的范围或涵义。
[0033]详细描述
在本申请中，文本是指本发明营养物、组合物和方法的各种实施方式。所描述的各种实施方式用于提供多个解释性的例子，而不应当被解释为替代方式的描述。但是，要注意的是，本文提供的各种实施方式的描述可能在范围上会重叠。本文描述的实施方式仅是解释性的，而不意在限制本发明的范围。
[0034]而且，在本申请中，通过识别引用参考了各种公开文献、专利和公开的专利说明书。这些公开文献、专利和公开的专利说明书的公开内容通过引用被合并至本文中，以更加充分地描述本发明所属领域的技术状态。
[0035]如在说明书和权利要求中所使用的，单数形式“一个”和“该”，除非另有明确说明，否则都包括复数引用。例如，术语“一个电极”包括多个电极(包括其混合形式)。
[0036]如本文所使用的，术语“包括”意指装置和方法包括所引述的部件或步骤，但不排除其他内容。“实质上由…组成”，当被用来定义装置和方法时，是指排除对于组合有任何实质性意义的其他部件或步骤。“由…组成”是指排除其他部件或步骤。由这些过渡术语的每一个界定的实施方式都在本发明的范围内。
[0037]所有数字表示(包括范围值)，例如距离、尺寸、温度、时间、电压和浓度，都是近似值，其可上(+)下(-)变化0.1。要理解的是，即使并非总是明确说明，但所有数字表示之前都有术语“约”。还要理解的是，即使并非总是明确说明，但本文所述的部件仅是示例性的，并且这些部件的等同体在本领域是已知的。
[0038]检测聚合物的装置 本发明的一个实施方式提供了一种包括多个腔室的装置，每个腔室通过至少一个孔与相邻腔室连通。在这些孔中，两个孔(即第一孔和第二孔)被设置成允许聚合物的至少一部分从第一孔移出并进入到第二孔。而且，该装置包括能够在移动期间识别聚合物的传感器。在一个方面，所述识别需要识别出聚合物的单个成分。优选地，当使用单个传感器时，该单个传感器不包括设置在孔的两端以测量通过孔的离子电流的两个电极。
[0039]在一个方面，该装置包括由两个孔相连的三个腔室。具有多于三个腔室的装置可容易被设计，以在三腔室装置的任何一侧或三个腔室的任何两个腔室之间包括一个或多个额外的腔室。类似地，该装置可包括多于两个的孔以连接这些腔室。
[0040]在一个方面，相邻两个腔室之间可具有两个或更多个孔，以允许多种聚合物同时从一个腔室移动到另一个腔室。这种多孔涉及可提高该装置中的聚合物分析的处理量。
[0041]在某些方面，该装置还包括使聚合物从一个腔室移动到另一个腔室的器件。在一个方面，该移动导致同时在第一孔上和第二孔上加载样品。在另一个方面，该器件进一步使得聚合物以相同的方向移动通过这两个孔。
[0042]例如，在一个三腔室双孔装置(“双孔”装置)中，每个腔室可包含用于连接至电源的电极，因而腔室之间的每个孔都设立了单独的电压。根据本发明的一个实施方式，其提供了一种包含上腔室、中腔室和下腔室的装置，其中上腔室通过第一孔与中腔室连通，中腔室通过第二孔与下腔室连通。
[0043]参考图1，该装置包括上腔室(腔室A)、中腔室(腔室B)和下腔室(腔室C)。这些腔室由两个分隔层或分隔膜(101和102)分隔开，每个分隔层或分隔膜具有独立的孔(111和112)。而且，每个腔室含有用于连接至电源的电极(121、122和123)。明显地，上、中和下腔室的标注是相对来说的，并不表示，例如，上腔室相对于地面被设置在中腔室或下腔室之上,或者反之亦然。
[0044]每个孔(111和112)独立地具有允许小分子或大分子或微生物体通过的尺寸。在一个方面，每个孔的直径为至少约I nm。或者,每个孔的直径为至少约2 nm、3 nm、4 nm、5nm、6 nm、7 nm、8 nm、9 nm、10 nm、ll nm、12 nm、13 nm、14 nm、15 nm、16 nm、17 nm、18 nm、
19nm、20 nm、25 nm、30 nm、35 nm、40 nm、45 nm、50 nm、60 nm、70 nm、80 nm、90 nm 或 100nm。
[0045]在一个方面，孔的直径不超过约100 nm。或者，孔的直径不超过约95 nm、90 nm、85 nm、80 nm、75 nm、70 nm、65 nm、60 nm、55 nm、50 nm、45 nm、40 nm、35 nm、30 nm、25 nm、
20nm、15 或 10 nm。
[0046]在一个方面，孔的直径为约I nm至约100 nm，或约2 nm至约80 nm，或约3 nm至约70 nm，或约4 nm至约60 nm，或约5 nm至约50 nm，或约10 nm至约40 nm，或约15 nm至约30 nm。
[0047]在某些方法，孔具有实质上圆形的形状。本文使用的“实质上圆形”是指至少约80%或90%是圆柱形形式。在一些实施方式中，该孔是方形的、矩形的、三角形的、椭圆形的或六角形的。
[0048]每个孔(111和112)独立地具有深度。在一个方面，每个孔的深度为至少约0.3nm。或者，每个孔的深度为至少约 0.6 nm、l nm、2 nm、3 nm、4 nm、5 nm、6 nm、7 nm、8 nm、9nm、10 nm、ll nm、12 nm、13 nm、14 nm、15 nm、16 nm、17 nm、18 nm、19 nm、20 nm、25 nm、30nm、35 nm、40 nm、45 nm、50 nm、60 nm、70 nm、80 nm 或90 nm。
[0049]在一个方面，每个孔的深度不超过约100 nm。或者，该深度不超过约95 nm、90 nm、85 nm、80 nm、75 nm、70 nm、65 nm、60 nm、55 nm、50 nm、45 nm、40 nm、35 nm、30 nm、25 nm、
20nm、15 或 10 nm。
[0050]在一个方面，该孔的深度为约I nm至约100 nm,或约2 nm至约80 nm,或约3 nm至约70 nm,或约4 nm至约60 nm,或约5 nm至约50 nm,或约10 nm至约40 nm,或约15nm 至约 30 nm。
[0051]在一个方面，孔以约10 nm至约10000 nm的距离间隔开。在一个方面，该距离为至少约 10 nm,或至少约 20 nm、30 nm、40 nm、50 nm、60 nm、70 nm、80 nm、90 nm、100 nm、150nm、200 nm、250 nm或300 nm。在另一个方面，该距离不超过约约10000 nm、5000 nm、2000nm、1000 nm、900 nm、800 nm、700 nm、600 nm、500 nm、400 nm、300 nm、250 nm、200 nm、150nm或100 nm。在又一个方面，该距离为约20 nm至约800 nm,约30 nm至约700 nm,约40nm至约500 nm,或约50 nm至约300 nm。
[0052]这两个孔可被设置在任何位置，只要它们允许腔室之间的流体连通并在它们之间具有所规定的尺寸和距离。在一个方面，孔被设置得使得没有阻碍正好位于它们之间。在另一方面，孔是实质上共轴的，如图1所示。
[0053]在一个方面，该装置通过腔室内的电极被连接至一个或多个电源。在某些方面，电源由电压钳或膜片钳构成，以将电压供应通过每个孔，其也可独立测量通过每个孔的电流。在这方面，电源可将中腔室设定为两个电压源的共同接地点。在一个方面，电源被配置成在上腔室(例如图1中的腔室A)和中腔室(例如图1中的腔室B)之间提供第一电压，在中腔室和下腔室(例如图1中的腔室C)之间提供第二电压。
[0054]在某些方面，第一电压和第二电压可被各自调节。在一个方面，中腔室被调节成相对这两个电压的接地点(如图1-3所示)。在一个方面，中腔室包含用于在每个孔和中腔室中电极之间提供传导性的介质。在一个方面，中腔室包含在每个孔与中腔室中电极之间提供电阻的介质。保持这种电阻相对纳米孔电阻足够地小，对于解耦通过孔的两个电压和电流是有用的，这有助于电压的独立调节。
[0055]电压的调节可用来控制带电颗粒在腔室内的移动。例如，当两个电压被设置成在相同方向，带适当电荷的颗粒可从上腔室按顺序移动至中腔室和下腔室，或按相反顺序移动。在其他方面，带电颗粒可由上腔室或下腔室移动至中腔室并保持在那里。
[0056]装置中电压的调节可特别用于控制大分子的移动，例如带电聚合物，该大分子足够地长从而可同时通过两个孔。在这个方面，分子的移动和移动速率可受电压的相对幅值和方向的控制，这将在下文进一步描述。
[0057]该装置可含有适合保持液态样品(特别是生物学样品)的材料和/或适合纳米制造的材料。在一个方面，这种材料包括介电材料，例如但不限于，硅、氮化硅、二氧化硅、石墨烯、碳纳米管、Ti02、HfO2> Al2O3或其他金属层，或这些材料的任何组合。例如，单层石墨烯形成约0.3 nm厚的膜，且可被用作含孔膜。在另一个方面，可使用氧化铪(HfO2)膜。
[0058]具有双孔微流体芯片器件的微流体装置可通过多种手段和方法制造。对于包括两个平行膜的微流体芯片，两个膜可通过单个束被同时钻孔以形成两个同心孔，但在膜的每一侧上使用不同的束并结合任何适当的对准技术也是可行的。一般而言，外罩确保腔室A-C的密封隔离。在一个方面，外罩会在电压电极(两个电压源和一个接地)和纳米孔之间提供最小的接入电阻，以确保每个电压主要被施加至每个孔上。
[0059]在一个方面，图9显示了该装置另一个实施方式的外部视图。在图9中，该装置含有微流体芯片(标记为“双核芯片”)，其包括由间隔元件连接的两个平行的膜。每个膜含有由穿过膜中心的单个光束钻成的孔(未显示)。而且，该装置优选具有用于芯片的Teflon?外罩。该外罩确保腔室A-C的密封隔离，并为电解质提供最小的接入电阻，从而确保每个电压主要被施加至每个孔上。
[0060]更具体地，含孔膜可利用具有5-100 nm厚的硅、氮化硅或二氧化硅窗口的TEM(透射电镜)栅极来制造。可利用间隔元件来隔开膜，利用绝缘体(SU-8、光阻材料、PECVD氧化物、ALD氧化物、ALD氧化铝)或蒸发金属(Ag、Au、Pt)材料，并占据膜间的腔室B的液态部分内的很小体积。保持器位于液体浴内，该液体浴包含了腔室B的最大体积分数。腔室A和C可通过通向膜密封件的较大直径通道(以实现低接入电阻)来进入。
[0061]聚焦电子束或离子束可被用来在膜上钻孔，并自然将它们对其。这些孔这通过向各层施加正确的束聚焦而被蚀刻(收缩)至较小尺寸。任何单纳米孔钻孔方法也可被用来在两个膜上钻出一对孔，并考虑对于给定方法可行的钻孔深度以及膜的厚度。也可以先钻出具有规定厚度的微孔，然后再钻出穿过该膜的纳米孔，从而进一步改善膜厚度。
[0062]在另一个方面，向固态纳米孔插入生物学纳米孔以形成混合孔，可被用于双孔法中的任何一个或两个纳米孔(Hall et al., Nat.Nanotech., 5 (12): 874 - 7, 2010)。生物学孔可增加离子电流测量的敏感度，并且在单链多核苷酸在该双孔装置中被捕获和控制以用于例如测序时是有用的。
[0063]利用该装置控制分子的移动
通过存在于该装置的孔处的电压，带电分子可移动通过腔室间的孔。移动的速度和方向可通过电压的幅值和方向来控制。而且，因为两个电压的每一个都可独立被调节，带电分子的移动和速度可在每个腔室内被精细地控制。
[0064]例如，该装置可被用来以受控的方式混合两个带正电的分子。为此，第一个分子最初被加载在上腔室，第二个分子被加载在下腔室。通过第一孔的第一电压可诱导第一分子从上腔室移动到中腔室。类似地，第二电压(与第一电压方向相反)可诱导第二分子从下腔室移动到中腔室。由于电压的方向相反，两个分子会被保持在中腔室中从而彼此反应。而且，通过调节电压的相对幅值，每个分子的流入速度被精确调控，从而产生受控的反应。
[0065]另一个例子涉及带电聚合物，例如多核苷酸，其长度大于包括两个孔的深度以及两孔之间距离的总距离。例如，1000 bp dsDNA为约340 nm长,远长于间隔20 nm的两个10 nm长孔的跨度40 nm。在第一步骤中，多核苷酸被加载到上腔室或下腔室的任何一个中。由于在生理条件下(pH约7.4)其带负电，多核苷酸可被移动通过施加了电压的孔。因此，在第二步骤中，两个方向相同且幅值相同或相似的电压被施加至孔上以诱导多核苷酸按顺序移动通过两个孔。
[0066]大约在多核苷酸达到第二孔的时间，其中一个或两个电压可被改变。因为两孔之间的距离被选择成短于多核苷酸的长度，当多核苷酸到达第二孔时，其也位于第一孔内。因此，在第一孔的电压方向的迅速改变，会产生一个拉动多核苷酸离开第二孔的作用力(如图3所示)。[0067]如果此时第一孔处的电压诱导的作用力的幅度小于第二孔处的电压诱导的作用力的幅度，那么多核苷酸将继续朝第二孔通过两个孔，但速度降低。在这点上，容易意识到，多核苷酸移动的速度和方向可受两个电压的方向和幅值的控制。如下文将进一步描述的，这种移动的精细控制具有广泛的应用。
[0068]因此，在一个方面，本发明提供一种控制带电聚合物移动通过孔的方法。该方法包括(a)将包含带电聚合物的样品加载到上述实施方式的任何一个的装置的上腔室、中腔室或下腔室中，其中该装置被连接至电源，用于在上腔室和中腔室之间提供第一电压，并在中腔室和下腔室之间提供第二电压；(b)设置初始第一电压和初始第二电压，使得聚合物在腔室之间移动，从而将聚合物定位成穿过第一孔和第二孔；和((3)调节第一电压和第二电压使得两个电压产生作用力，拉动带电聚合物离开中间腔室(电压竞争模式)，其中所述两个电压的幅值在受控条件下不同，因而带电聚合物以任一个方向和受控方式移动通过两个孔。
[0069]为在步骤(C)中建立电压竞争模式，为所使用的每个双孔装置确定每个孔处的每个电压施加的相对作用力，这可通过观察不同电压值对多核苷酸移动的影响而利用校准实验来进行(移动可通过感测多核苷酸中位置已知的且可检测的特征来测定，这种特征的例子将在下文详细描述)。例如，如果每个共同电压的作用力是相等的，那么在每个孔处使用相同电压值(上腔室和下腔室相对接地的中腔室具有相同极性)在缺乏热骚动的情况下产生零净移动(布朗运动的存在和影响在下文描述)。如果每个共同电压的作用力不相等，那么实现相等作用力要求在于共同电压时具有较弱作用力的孔处识别和使用较大的电压。每个双孔装置需要校准电压竞争模式，并且对于通过每个孔的特征影响作用力的特定的带电聚合物或分子而言也需要校准电压竞争模式。
[0070]在一个方面，含有带电聚合物的样品被加载到上腔室，并且初始第一电压被设置成从上腔室拉动带电聚合物到中腔室，初始第二电压被设置成从中腔室拉动聚合物到下腔室。类似地，样品可被最初加载至下腔室。
[0071]在另一个方面，含有带电聚合物的样品被加载至中腔室，并且初始第一电压被设置成从中腔室拉动带电聚合物到上腔室，初始第二电压被设置成从中腔室拉动带电聚合物到下腔室。
[0072]术语“带电聚合物”或“聚合物”是指在溶液的pH时具有足够的带电单元使得可通过静电作用力被拉动通过孔的聚合物。在一个实施方式中，带电聚合物的每个电源在所选择的的PH时是带电的。在另一个实施方式中，带电聚合物包含通过静电力被拉进并通过孔的足够的带电单元。例如，为本发明的目的，包含足够多的、可在选定PH时带电从而用于本发明的装置和方法中的实体部分的肽是带电聚合物。类似地，为本发明的目的，包含甲基丙烯酸和乙烯的共聚物，如果甲基丙烯酸残基具有足够的带电羧酸盐基团从而被用在本文所述的装置和方法中，那么该共聚物是带电聚合物。在一个实施方式中，带电聚合物包含一个或多个位于或靠近聚合物的一个末端的带电单元。在另一个实施方式中，带电聚合物包括一个或多个位于或靠近该聚合物的两个末端的带电单元。
[0073]在某些方面，带电聚合物是多核苷酸或多肽。在一个特别的方面，带电聚合物是多核苷酸。多核苷酸的非限制性例子包括双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA和DNA-RNA杂交体，以及多种类型的蛋白核酸(如PNA、双体PNA、y-PNA)0[0074]在一个方面，步骤(C)中被调节的第一电压和第二电压的幅值高达两个电压差值的约10倍至约10000倍。例如，两个电压分别是90 mV和100 mV。电压幅值(约100 mV)是它们之间差值10 mV的约10倍。在某些方面，电压幅值高达它们之间差值的至少约15倍、20 倍、25 倍、30 倍、35 倍、40 倍、50 倍、100 倍、150 倍、200 倍、250 倍、300 倍、400 倍、500倍、1000 倍、2000 倍、3000 倍、4000 倍、5000 倍、6000 倍、7000 倍、8000 倍或 9000 倍。在某些方面，电压幅值不大于它们之间差值的约10000倍、9000倍、8000倍、7000倍、6000倍、5000倍、4000 倍、3000 倍、2000 倍、1000 倍、500 倍、400 倍、300 倍、200 倍或 100 倍。
[0075]在一个方面，在步骤(C)中对第一电压和第二电压进行实时或在线调节，这通过利用专用的硬件和软件，以至多数百兆赫的时钟频率，主动控制或反馈控制来进行。第一或第二或两个电压的自动控制基于第一或第二或两个离子电流测量值的反馈来实现。
[0076]装置中的传感器
本发明的装置可用来分析在装置中移动或保持在装置内的分子或颗粒。在一个方面，该装置还包括一个或多个用于进行分析的传感器。预期当使用单个传感器时，该单个传感器不包括设置在一个孔的两侧、用于在分子或颗粒(特别是聚合物)移动通过该孔时测定通过该孔的离子电流的一对电极。
[0077]在一个方面，该装置包括适合识别聚合物或聚合物的单个成分的传感器。单个成分的非限制性例子包括单体单元以及具有接近或位于单体单元上的改性处理的单体单元。这种改性处理的例子包括，但不限于，导致产生例如5-甲基胞嘧啶、5_羟甲基胞嘧啶、5-甲酰胞嘧啶、5-羧基胞嘧啶的甲基化。当聚合物是多核苷酸时，单个成分可为一个或多个核苷酸单元或被蛋白质因子结合的、或被PNA或其他合成分子或代谢物等结合的核苷酸单元。当聚合物是多肽时，单个成分可为一个或多个氨基酸或改性的氨基酸。对氨基酸的改性的例子包括，但不限于，N-联糖基化、O-联糖基化、磷酸化、乙酰化、模拟化(summuolation)、甲基化。而且，不同形式的聚糖可被区分，例如区分复合聚糖和高甘露糖型聚糖(例如区分Man-5与Man_8, 9)。
[0078]用在装置中的传感器可为适合识别分子或颗粒(例如聚合物)的任何传感器。例如，传感器可被配置成通过测定与聚合物或聚合物的一个或多个单个成分相关的电流、电压、pH、光学特征或驻留时间来识别该聚合物。
[0079]在一个实施方式中，传感器测定聚合物或聚合物的成分(或单元)的光学特征。这种光学测定的一个非限制性的例子是通过红外光谱法来识别，红外光谱测定与被测定的单元的跃迁能匹配的独特辐射吸收(即共振频率)。例如，DNA的每个碱基以及每个单独的氨基酸都具有以独特的可测量频率共振的官能团，因此可以识别每个单元。
[0080]这种光学测量的另一个例子包括通过测定在特定波长的UV光线吸收量来识别。例如，单独的DNA在260 nm处强吸收，但在280 nm处弱吸收。信号的变换，即280>260，表明蛋白质存在或结合至DNA。另一个UV监测蛋白质存在的例子是在215-220 nm处测量，因为肽键在该范围内强吸收。在该范围吸收值的增加表示样品中存在已结合的蛋白或蛋白。
[0081]这种光学测定的另一个例子使用荧光光谱测定法，从而在电子被激光或其他能源激发而进入较高能量状态并返回至基态后，来检测分子的特定荧光频率。当返回至基态时，发射光子的频率可被测定。对于被研究的分子来说，荧光可以是固有的性质或者是附加的标记。可被直接加入靶分子中或加入被设计用来识别靶分子上的特征的探针中的普通荧光团标记可为例如 Alex Fluor 488、555、594、647。
[0082]在一个实施方式中，当使用驻留时间测量值时，基于一个单元通过该传感装置所花的时间长度，它们可将该单元的尺寸与特定单元相关联。
[0083]在一个实施方式中，当使用驻留时间测量值时，这些测量值将与传感器(或传感器上的官能团)和聚合物之间的静摩擦(摩擦相互作用)的量相关联。相互作用的强度(即，弱或强)对于该聚合物或聚合物的单元是特异性的，并可基于其通过传感装置的时间长度来进行识别。
[0084]进一步地，传感器可包括位于传感器远端的酶，该酶能够将聚合物的末端单元从次末端单元裂解下来，从而提供聚合物的游离的单个分子单元。该单个单元(例如单个核苷酸或氨基酸)可被上述类型的、位于孔的远端的传感器所检测。
[0085]因此，传感器可被放置在装置的使得能够进行这种测量的位置(图4)。在一个方面，传感器可包括两个电极(151和152)并且可被放置在其中一个孔中。当聚合物移动通过孔时，这两个电极即处于该聚合物的两侧，因而可以通过测定通过单个成分的电流或电压或其变化值来识别该单个成分。
[0086]类似地，具有电极161和162的传感器可被放置在其中一个孔的出口处(图5)。在一个方面，一个孔的出口邻近该第一-第二孔对的另一个孔。在另一个方面，传感器可被放置在两孔之间。除了位置外，传感器的类型和构造也可改变。如图6-8所示，传感器可包括两个具有相对窄的末端的电极171和172，并且电极之间具有间隙(图6)。在一个方面，其中一个电极(181)可包括实质上平坦的表面，而另一个电极(182)可具有窄的末端(图7)。
[0087]在另一个方面，传感器不包括电极而是呈膜或支架(191)形式，其具有允许聚合物通过的开口(例如孔)。例如，具有开口(可正如与其他纳米孔一样的纳米孔)的一层或多层石墨烯膜可作为辅助传感器，其本身可位于两孔之间的腔室内。在一个方面，该石墨烯膜包含单层、双层或多于两层。
[0088]在一些实施方式中，传感器被配置成当聚合物被加载在第一孔和第二孔中时靠近聚合物。因此，当聚合移动通过这两个孔时，传感器足够靠近该聚合物以测定该聚合物。在这点上，传感器可与这两个孔对齐，要么位于其中一个孔中，要么在两孔之间(如图4-8所示)。
[0089]在一些实施方式中，传感器被配置以形成隧道间隙，该隧道间隙允许聚合物通过。在图4-8所示的装置中，隧道间隙形成于电极之间或由所述开口形成。当聚合物移动通过该隧道间隙时，传感器即可识别该聚合物的单个成分。
[0090]已经证明，单个核苷酸可在精度为0.8 nm的隧道间隙中被辨别。
[0091]在一些实施方式中，传感器可利用与每种DNA碱基形成独特非共价键的试剂(例如苯并酰胺和羧基酰胺咪唑)而被功能化。在这点上，所述间隙可更大，且仍可实现有效测量。例如，当被功能化后，2.5 nm的间隙可与0.8 nm间隙一样有效。利用功能化的传感器的通道传感被称为“识别隧道效应(“Recognition tunneling”)”。结合利用扫描隧道显微镜(STM)和识别隧道效应，可识别出短DNA寡聚物中侧翼为其他碱基的一个DNA碱基。
[0092]识别隧道效应还可提供“通用阅读器”，其被设计成以独特方向氢键键合至四种DNA碱基(A、C、T、G)中的每一个，并且也键合至由于表观遗传改性而天然出现的碱基5-甲基-胞嘧啶(mC)。[0093]常规识别隧道效应的限制在于它仅可检测随机结合在间隙中的或碰巧在显微运动期间位于该间隙中的游离扩散的DNA，而无法明确地捕获至该间隙。而且，当识别试剂在优化敏感度后被加入到纳米孔通道的电极隧道间隙中时，将不再有STM设置的共同缺点。
[0094]因此，在一个实施方式中，传感器包括经试剂改性的表面。在一个方面，该试剂能够与核苷酸形成非共价键。在特别的方面，该键是氢键。该试剂的非限制性例子包括4-巯基苯甲酰胺和1-H-咪唑-2-甲酰胺。
[0095]本技术中的方法的显著优点在于原则上它们可被改造以提供同聚区域(碱基重复)中进展的直接追踪。离子电流感测无法进行直接碱基重复追踪。追踪重复序列是必要的，因为例如特定单核苷酸重复的缺失和插入是许多类型疾病的标志，包括脆性X染色体综合症、囊肿性纤维化、多种形式的恶性癌症以及其他疾病。而且，我们期望检测的表观遗传化学改性通常出现在GpC富集/重复区。此外，DNA图谱通常是检测DNA聚合物内的重复区(短串联重复序列)来进行的。
[0096]在离子电流感测中，对于长度大于影响电流(当在孔中时)的核苷酸数目(如相对MspA蛋白纳米孔的4个核苷酸)的同聚区域，同聚ssDNA通过孔时不存在每个核苷酸移动的独特信号。预期理想的纳米孔测序平台应利用辅助感测方法，该方法可追踪每一核苷酸运动进程，同时还实现单核苷酸敏感度。寡聚物中相邻核苷酸之间的转换应可通过识别隧道效应观察到，使得它成为允许直接的碱基重复序列追踪的候选测序法。
[0097]因此，本技术的方法可为一个或多个识别隧道效应位点提供DNA递送速率控制，每个位点位于其中一个或两个纳米孔通道中，或在纳米孔之间，并且电压控制可保证每个核苷酸在每个位点停留足以实现稳健识别的时间段。
[0098]本发明的装置和方法中的传感器可包含金、钼、石墨烯或碳或其他合适材料。在一个特别的方面，传感器包括由石墨烯制成的部分。石墨烯可作为导体和绝缘体，因此通过石墨烯和纳米孔的隧道效应电流可对易位的DNA进行测序。
[0099]在一些实施方式中，隧道间隙的宽度为约I nm至约20 nm。在一个方面，间隙的宽度为至少约 I nm，或至少约 1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、12 或 15 nm。在另一个方面，间隙的宽度不超过约20 nm，或不超过约19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、
6、5、4、3或2 nm。在一些方面，该宽度为约I nm至约15 nm,约I nm至约10 nm,约2 nm至约10 nm,约2.5 nm至约10 nm,或约2.5 nm至约5 nm。
[0100]在装置中表征聚合物
聚合物(例如DNA分子)可在本发明的装置中被分析。在一个方面，如上所述，聚合物被加载到装置中的至少两个孔内。在加载聚合物后，它位于适合由传感器通过测定与该聚合物或聚合物的成分有关的电流、电压、pH、光学特征或驻留时间来检测的位置。
[0101]例如，多核苷酸可通过具有相同方向的两个电压被加载到两个孔中。在该例子中，当施加在第一孔的电压方向被逆转并且新的电压诱导作用力在幅值上稍微小于施加在第二孔上的电压诱导作用力，多核苷酸会继续以相同方向移动，但移动速度显著降低。在这点上，提供电压通过第二孔的放大器也测定通过第二孔的电流，该离子电流随后确定通过该孔的一个核苷酸的特性，因为每个不同核苷酸的通过都会产生不同的电流信号(例如，基于离子电流幅值的改变)。据此，多核苷酸中每个核苷酸的识别揭示出了多核苷酸的顺序。
[0102]在某些方面，用于多核苷酸的重测序的重复受控递送进一步改善了测序质量。对于每个方向的受控递送，每个电压被改变得更大。 申请人:还预期，通过两个孔的两个电流可与增加的精确性相关联。发明人预期，布朗运动可能导致分子运动的波动，从而影响分子的受控递送。但是这种作用可通过例如在DNA测序期间DNA的重复受控递送以及取测序用测量值的平均值来最小化或避免。而且，发明人预期，布朗运动对大分子(如多核苷酸和多肽)的受控运动的影响，特别是在竞争作用力拉动该大分子分离，从而在分子内生成张力时不明显。发明人预期，DNA通过表面电荷改性黏附至孔壁或通过化学试剂黏附至孔表面从而产生摩擦，也可缓解布朗运动对双孔法控制性能的影响。
[0103]这种方法为现有技术尚未被解决的问题提供了 一个容易的解决方案。
[0104]例如，已知要实现受控递送和纳米孔测序所需的精确感测有两个竞争性的障碍。一个是需要在孔处提供相对高的电压，从而提供足够的测序敏感度。另一方面，高电压导致多核苷酸快速通过该孔，而不能具有用于识别每个核苷酸的足够的时间。
[0105]更具体地，纳米孔测序平台要求多核苷酸通过孔的通过速率被控制在I ms/核苷酸(nt)或更慢，同时仍生成序列敏感电流。这需要足够高的信噪比以检测电流信号(高电压更好)，但需要分子以足够慢的速度移动通过孔以确保测量值位于记录带宽(recordingbandwidth)内(低电压更好)。在单孔实施方式中，多核苷酸速度与电压成比例，因此更高的电压对于感测更好，但对于降低多核苷酸速度更不利:在促进多核苷酸捕获的电压时，速度为I ms/nt和更快(快>1000倍)。另一方面，较低的电压降低了感测性能，还增加了由于布朗运动导致的速度波动的相对贡献(削弱了读数精确性)。
[0106]除本文所描述的之外，目前没有一种方法在不涉及使用酶或光学器件(两者均仅在特殊纳米孔技术中起作用)的情况下排除这些障碍。
[0107]多种方法已被提出用来解决与感测能力确实以及在低电压下操作相关的问题。一种方法是改造生物学纳米孔以改善其敏感度。另一种方法是使用石墨烯膜，单层石墨烯膜的厚度小于ssDNA中核苷酸之间的距离。还有一种方法是利用在非常靠近纳米孔的位置测量的辅助电流(即，隧道效应电流)。
[0108]生物学纳米孔已在第一种方法中测试。a_溶血素纳米孔是研究中最常用的生物学孔。研究显示，a-溶血素可分解同聚物中的单个核苷酸取代物以及其他形式全核碱基DNA中的脱碱基(I’，2’ -双脱氧)残基。但是，单核苷酸敏感度在具有野生型(WT)a-溶血素的杂聚体DNA中是不可能的，其中离子电流受通道中约10个核苷酸的影响。a-溶血素的蛋白质工程化已被用来改善其DNA分析和测序的敏感度。一种这种突变孔使用具有共价连接的衔接分子(Clarke et al., Nat.Nano tech, 4 (4): 265 - 70, 2009)的 a_ 溶血素,该衔接分子能够以高精确性区分四种5’ -单磷酸核苷分子。但是，这种突变孔显得不具有用于测定通过该孔的完整杂聚体ssDNA的序列的敏感度。
[0109]另一个示例性生物学孔是MspA，其具有漏斗样形状，该形状将离子电流的敏感度集中到通道的底部。而且，通过MspA和a-溶血素实现DNA速率降低可通过利用酶来实现。如图1所不(Manrao et al., Nature Biotechnology, 30:349-53，2012),DNA的速率降低是利用位于MspA纳米孔上的酶来实现的。但是，这导致非确定性的感测期间、由回溯导致的重复读数、以及无法感测同聚区域。phi29聚合酶介导的DNA易位的机制已形成于(Cherfet al., Nat.Biotech., 30 (4): 344-8, 2012) a_溶血素,并在更敏感的MspA纳米孔上实施(Manrao et al., Nature Biotechnology, 30:349-53，2012)。聚合-催化易位的逐步速率是2.5-40 nt/s，这符合DNA速率降低的要求。但是，虽然生物孔上的酶可降低易位速率，但仍缺乏对每个核苷酸的驻留时间的控制，这会使得重复序列的非受控追踪(blindtracking)非常困难，并对区分单核苷酸读取上的长停顿提出了挑战。在敏感度方面，如图3 所不(Manrao et al., Nature Biotechnology, 30:349-53，2012),读取重复性 DNA 模板可利用MspA上的phi29来实现。图3a显示了由重复的CAT三核苷酸构成(仅一个CAG三联体位于序列中间)的DNA模板的示例性轨迹。*代表(通过人为分析)检测到的作为两个水平之间的重复转移(repeated transition)的“切换(toggle)”,其是基于酶的控制方法所固有的并且导致读取错误。图3b显示了图3a的理想化形式，其中平均电流水平用已知DNA序列校准，并去除了图3a中显示的所测量的期间的差异。理想化显示出了由单个dG取代打断的三水平的重复模式。四个水平受该单个dG的影响，最大偏差最接近该取代，表明残基电流主要受约4个核苷酸影响。通过的MspA的离子电流受最接近该限制性孔洞的约4个核苷酸的影响，这显著增加了识别序列的复杂性。虽然如本领域所表明的，理想上可以建立对应44 = 256个组合的每一个的不同电流幅值库，但主要的库将很难实现。原因在于识别通道电流记录中的步骤转移(step transition),对半幅值方法来说需要至少2的信噪比(SNR)(对于基于Markov方法来说，SNR≥1.5)。当在记录带宽时RMS噪音为0.5PA，幅值变化必须至少为I PA以达到所需的SNR，导致对于MspA来说在40 pA的幅值范围内仅有约40个可检测水平(或，在SNR 1.5时最多53个水平)。而且，因为范围并非被均匀使用，所以会观察到少于40个水平，并且虽然进一步过滤可降低噪音以增加幅值分辨率，但也导致漏掉比已经存在的更多的更快ssDNA运动转移。 [0110]目前，没有一种纳米孔的离子电流感测可提供核酸测序的单核苷酸敏感度。而且，对生物学孔和固态孔(石墨烯)的敏感度的改进一直在进行并且持续处于研究中。一个问题在于离子电流感测不允许直接追踪同聚区域(碱基重复序列)内的进展，因为同聚ssDNA移动通过孔时没有独特的单核苷酸信号。追踪重复序列是必要的，这是因为，例如，人线粒体DNA内特定单核苷酸重复(7，9 nt)的缺失和插入已表明是多种类型癌症的病因(Sanchez-Cespedes, et al., Cancer Research, 61 (19): 7015 - 7019, 2001)。虽然生物学孔上的酶可以降低易位速率，但仍缺乏对每个核苷酸的驻留时间的控制。另一方面，使用具有双孔控制的恒定递送速率，消除了非确定性停顿，并可精确估算重复序列长度。重复读取重复序列部分多次也可改善估算错误并识别错误边界，并且这可在不逆转由酶引起的聚合化学反应的情况下实现。
[0111]最近的研究表明，利用单个纳米孔无法实现仅通过降低电压就能降低速率(Lu etal., Biophysical Journal, 101 (I): 70-9, 2011)。相反，当电压降低时，单链DNA (ssDNA)的速率变得更加随意(包括回溯)，因为布朗运动对速度波动的影响越来越大。该研究还显示需要高电压作用力来抑制布朗运动诱导的速度波动，否则即使使用理想化的单核苷酸敏感性纳米孔传感器也会影响测序测量值。
[0112]本发明提供的基于双孔装置的测序方法提供了一个解决这些问题的容易的方案并且相对现有方法具有额外的优点。与在高电压或低电压时具有足够测序敏感度的一个或两个孔相配合，双孔控制解决了单纳米孔实施方式中的测序速率控制问题。这种孔可包括在固态基质中的生物学孔、横跨固态基质的膜内生物学孔、或固态孔(例如在石墨烯、硅或其他基质中)。在一个方面，可在一个或两个孔处使用酶(例如生物学孔(如MspA)上的Phi29)，使用高电压生成用于测序的大信号以及低的差动电压，该低的差动电压在每个酶上产生一个作用力，该作用力足以将酶保持在每个孔的顶部位置并允许聚合-催化的DNA移动，但并非大得足以停止或分解这些酶。这种构造通过显著增强测量信号并允许两个孔同时读取 DNA 的一个链而能改善在 Cherf ei a7.，Nat.Biotech., 30(4):344-8, 2012和 Manrao et al., Nature Biotechnology, 30:349-53，2012 中描述的方法。
[0113]此外，本发明的方法可在孔处产生足够高的电压以确保在孔处的利用离子电流感测的检测灵敏度。有理由相信，高电压会对布朗运动产生足够的抑制从而确保以恒定速率通过每个孔，并且在每个孔外部的DNA的构造会影响DNA在任何方向的运动能量学。此外，该方法中使用的电压竞争(图3)可被调节以使得分子在孔中停留足够长的时间，从而允许分析分子。进一步地，本发明不需要使用酶、光学仪器或DNA附接物。因此，该方法提供了高信噪比检测通过纳米孔的电流，同时调节分子递送速率，这是单纳米孔实施方式不可能具有的能力。
[0114]该方法可被用来识别带电聚合物中单体的成分。在一个方面，当聚合物是单链DNA或RNA时，该单体单元是核苷酸。在另一个方面，当聚合物是双链DNA或RNA时，该单体单元可为核苷酸对。
[0115]在一个方面，该方法可被用来识别聚合物的改性部分，例如结合至单体的分子，特别是当结合的分子带电时。但是，该结合的分子并不必须带电，因为即使是中性分子也可通过其尺寸改变离子电流。
[0116]在另一个方面，该改性部分包括聚合物的分子结合。例如，对于DNA分子，该结合的分子可为DNA结合蛋白，例如RecA、NF-kB和p53。在另一个方面，该改性部分是结合至特定单体或片段的颗粒。例如，结合至特定DNA位点用于基因分型或DNA图谱的量子点或荧光标记物可通过该装置被检测。因此，本发明的装置提供了用于基因分型和DNA图谱(不限于此)的廉价方式。
[0117]在一个方面，聚合物在一端被附接至固体载体，例如珠子。
[0118]在一个实施方式中，本发明还提供了确定多核苷酸的序列的方法，该方法包括:(a)将包含多核苷酸的样品加载到上述任一实施方式的装置的上腔室，其中该装置被连接至电源以在上腔室和中腔室之间提供第一电压并在中腔室和下腔室之间提供第二电压，其中该多核苷酸任选地在该多核苷酸的一端被附接至固体载体；(b)设置初始第一电压和初始第二电压，使得该多核苷酸从上腔室移动至中腔室，并从中腔室移动至下腔室，从而将聚合物定位成横跨第一孔和第二孔；(C)调节第一电压和第二电压使得两个电压产生将该多核苷酸拉离中腔室的作用力，其中两个电压的幅值在受控条件下不同，使得多核苷酸以一个方向且以受控方式移动通过这两个孔；和((1)识别移动通过其中一个孔的多核苷酸的每个核苷酸，这是通过在该核苷酸通过该孔时测定通过该孔的离子电流实现的。
实施例
[0119]本发明将通过以下实施例被进一步界定。对于本领域技术人员来说，明显地，可对主题和方法做出许多改变而不背离本发明的范围。
[0120]实施例1.单个dsDNA分子在孔中的捕获和控制
该实施例显示，当测量到每个独立的离子孔电流的变化时，可容易地检测到DNA被捕获到双孔装置中的每个孔中。
[0121]该实施例证实了 dsDNA (珠子附接或未附接至一端)的双孔捕获。也可开发出利用带珠ssDNA的实验。
[0122]一旦捕获并拖住DNA，最靠近珠子的孔电压(VI，图1，假设从腔室A捕获)可被逆转并增加直至DNA上的竞争作用力将其向腔室A拉回。在实验期间，任一孔中的离子电流可轻易检测出DNA的捕获和离开。
[0123]当使用珠子时，珠子具有防止珠子通过任何一个或两个孔的合适尺寸。本领域中已经开发出保证珠子-DNA呈1:1比率的方法。例如，共轭至生物素化的DNA双链体(或ssDNA)的单价链霉亲和素涂布的量子点(QDs; QD655, Invitrogen)可提供直径范围为20-30 nm的珠子，使用金颗粒或乳胶可获得更大的珠子(30-100 nm)。在设计实验时可考虑珠子对流体动力学和电荷的影响(因为它与捕获速率有关)。
[0124]没有珠子的情况下,dsDNA以约0.1 ms/kbp的速率通过孔。可使用长度为500 bp至4 kbp的DNA以及1-噬菌体dsDNA分子(~48kbp)。DNA样品可从腔室A被递送至两个孔，这可利用每个孔的共同电压极性来促进从腔室A捕获并通过腔室B进入腔室C (图1)来实现。dsDNA的大得持续长度(一库恩长度为100 nm)保证了每个孔内的DNA片段很可能是完全伸展的且为棒状。电压和离子浓度可被改变以确定出恰当的捕获速率。不同的缓冲离子浓度也可被用在每 个腔室中以提高或改变捕获速率以及表示DNA存在于每个孔中的传导变化值。
[0125]使用直径为10 nm的纳米孔或更大的纳米孔使得dsDNA和纳米孔壁之间的相互作用(例如摩擦和粘滞)最小化。对于较大的孔，虽然dsDNA可以未折叠和折叠的构象被捕获，但在较高电压和较短(≤3 kbp) dsDNA时更可能的是单行(未折叠)构象。对于孔间距离为500 nm或更小时，发明人预期，对于在I M KCl中至少200 mV的电压，在第一孔(腔室A和B之间)捕获后，双孔捕获的可能性非常闻。
[0126]达到电压影响控制热扩散并以高可能性导致捕获的径向距离，对于各种孔尺寸(6-15 nm直径)、电压(120-500 mV)来说,预计为至少900 nm,其中dsDNA长度至少为4 kbp(Gershow and Golovchenko, Nature Nanotechnology, 2:775 - 779, 2007)。这些发现证实在单(第一)孔捕获dsDNA后很可能实现迅速的dsDNA双孔捕获。
[0127]通过这两个孔实现DNA的捕获和控制可利用主动控制硬件和实时算法。发明人已开发出用于DNA控制的主动控制硬件/软件。参见,例如，Gyarfas et al, Biophys.J.,100:1509-16，2011) ; Wilson et al., ACS Nan0., 3(4):995-1003, 2009;以及 Benneret al., Nat.Nanotech., 2(11):718-24, 2007。有用的软件为在 FPGA(现场可编程门阵列)系统(PC1-7831R, National Instruments)上运行的 LabVIEW 软件(第 8 版，NationalInstruments, Austin, TX)。所提及的FPGA可同时控制至多4个放大器。而且,用于数字化数据并将数据记录在PC上的Axon Digidata 1440Α数据获取系统具有16个输入通道，足以并行地记录多达8个放大器的电压和电流。其他涉及实时控制和测量的硬件/软件的实时操作系统也可被用于控制放大器、以及数字化并记录数据。
[0128]发明人还开发出了被称为“纳米钳”的低噪音电压钳放大器(Kim et al., IEEETrans.0n Biom.Circ.And Syst.1n press, May 2012; Kim et al., Elec.Lette.,47 (15): 844-6, July, 2011; Lii1^Kim et al., Proceedings of the IEEE InternationalSoC Design Conference (ISOCC), November, 2010),用来功能化和优化一个或多个纳米孔在小印迹、多通道装置中的使用。任何其他商业上的台式电压钳或膜片钳放大器，或集成的电压钳或膜片钳放大器，都可被用于双孔控制和测量。
[0129]对于多种固态孔材料和直径，0.1-10 kbp需要约I ms来易位。利用FPGA-控制的放大器，人们可检测捕获并在0.020 ms内启动竞争电压控制，这要比I kbp DNA的I ms的总通过时间快得多；因此，很可能在DNA逃离之前(未连接珠子)触发控制方法。作为控制的证明，分子离开孔的时间和方向可被证实随竞争电压的幅值和差值而变化(图3)。在单孔实验中，实验观察到长的O lkbp) dsDNA通过孔时速度有大的波动，这些波动太大而不可能是由于扩散布朗运动导致的。在Lu, et al., Biophysical Journal, 101 (I): 70 - 79,2011中，净速度波动(B卩，DNA长度除以总通过时间)的主要原因被建模为是由于以下原因导致的，即，未在孔内的DNA的电压影响部分诱导的粘性阻力以及孔内吸引的电压区域延伸的部分。该模型与试验数据很好地吻合。值得注意的是，如果在捕获时dsDNA的质心与孔共线，那么净速度更快，但如果它偏离孔，那么净速度较慢。当竞争电压被施加在两孔装置中时，除非电压差足够高，否则dsDNA速度将不受这种粘性阻力诱导的扰动的影响。原因在于，当dsDNA被两个孔捕获并且施加竞争电压后，孔之间的dsDNA会完全展开并呈棒状，因此不会参与制造出靠近任一个内部孔入口处的结构。另一方面,在孔的外侧的dsDNA结构受到远离中间通道的每个局部孔电压的恒定作用力，因此不太可能影响孔进入动力学。这种结构可能意向受控的递送动力学，可利用校准实验来对此进行定量。
[0130]由随机的横向DNA移动诱导的作用力不确定性可能是最小的。此外，电压作用力导致DNA移动的相反方向的电渗透流(EOF)，导致DNA比不存在所诱导的抗衡离子流时移动得更慢。因为分子的不同径向位置可导致纳米孔中的不同EOF场，一个问题是有效的电荷密度(因而是净驱动作用力)是否在DNA径向位置的波动期间改变得足够大以诱导速度波动。在孔壁与DNA之 间的距离为I nm或更大时，DNA在I M KCl中的有效电荷密度被认为是稳定的。
[0131 ] 此外，SiN纳米孔具有本质上排斥DNA的负表面电荷。因此，虽然分子会经历径向位置波动，但通过使用直径大于几纳米的SiN孔，每个恒定的电压值很可能会在两个孔的每一个处产生恒定的有效作用力，因而当在双孔装置中使用两个竞争电压时在较大的力的方向产生恒定的速度。其他孔材料表面的处理可产生与SiN相当的效果。
[0132]由布朗运动导致的DNA随机平移运动造成的速度不确定性可通过增加竞争电压来降低。可进行试验来确定是否出现这种降低。单纳米孔研究(Lu, et al., BiophysicalJournal, 101(1):70 - 79，2011)证实，增加竞争作用力可降低布朗运动造成的不确定性。该研究分析了由布朗运动引起的速度波动(出现在快速(纳秒)时间范围)以及由该波动导致的测序误差。假设一个假想的且理想化的单核苷酸传感器(在〉22 MHz带宽无噪音检测)，布朗运动单独导致75%的读取误差。预测误差的相关参数是怂TVW* (0.34 nm)，它是热能与将DNA易位核苷酸之间的距离a (0.34 nm)所做的功之间的比率。在该比率中，力Z7 =Vl是驱动DNA的电压K与电荷密度I (dsDNA为0.2 e7bp)的乘积。对于本发明的控制方法，增加电压50倍导致产生5%的读取误差，更高的电压会进一步降低误差。但是，对于单个的孔，因为平均速度I ?为/?//?/)，其中i/为扩散常数，DNA速度也随着A增加，使得
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对测序带宽提出更加不切实际的要求。
[0133]为维持22 MHz带宽，单个纳米孔的作用力增加50倍的同时还需溶液粘度增加50倍以维持相同的I ,。但是，实际上，22 MHz带宽已经大大高于用于单核苷酸测序的
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任何试验用纳米孔平台已经证实的或可能证实的带宽。而且，对于单个纳米孔，增加粘度仅减慢 DNA 至多 10 倍(Fologea, et al.，Nano Lett.，5(9): 1734 - 7，2005)。使用该双孔平台，每个电压可被保持得足够高，这可抑制由布朗运动引起的波动，而决定DNA净速度的差异电压可被调节以确保控制速率在实际的测序带宽(标称为I kHz)之内。另一种抑制布朗运动诱导的速度波动的方法是使用反馈控制。在一个方面，利用10 kHz带宽的第二孔电流反馈以在10 kHz带宽启动第一孔电压，布朗运动可被抵消，从而在这些kHz闭环带宽控制DNA上的可检测特征保持在第二孔内或附近。这种能力在一个维度上类似于在两个空间维度上抑制布朗运动的反布朗运动电动力(ABEL)阱，并且通过在Hz闭环带宽光学地推动(optical forcing)连接至分子的珠子而起作用(Wang and Moerner, ACSNano, 5:5792-9, 2011)。有过在DNA和(带正电的)纳米孔壁之间制造静摩擦力的先例。例如，Bashir 及其同事们(Venkatesan et al., Adv.Mater., 20 (8): 1266 - 75, 2010;Venkatesan et al., Adv.Mater., 21:2771 - 6, 2009)报道了 Al2O3 孔显著降低易位速率的可能性，这是由于它们独特的通过溅射形成带正电的晶畴的能力引起的——带负电的DNA磷酸盐骨架在横穿Al2O3孔时与正电表面相互作用，减缓其移动。Dekker及其同事们的近期工作(Kowalczyk e i ，Nan0.Lett., 12:1038-44，2012)显不，与通常使用的KCl离子溶液相比，LiCl减慢DNA速率10倍，这提供了一种任何纳米孔设备都可受益的方法。
[0134]实施例2.结合至DNA的RecA蛋白丝的检测盒定位
该实施例显示，双孔装置可被用来定位DNA结合蛋白在dsDNA上的结合，并且可用于具有特定序列或不结合至特定序列的蛋白质。
[0135]如实施例1所证实的，DNA样品可从腔室A中捕获。RecA蛋白催化ATP依赖性DNA链-交换反应，该反应将破损的DNA与未受损DNA的互补区域配对。使用难水解的ATP类似物ATPgS，结合至dsDNA的RecA蛋白丝当首先以生理性盐组装时在高盐(例如IM KCl)中是非常稳定的。作为水解缓慢的ATPgS的替代物，该实施例也可使用ADP-A1F4 (四氟化铝)，它完全不会转换(turnover),并且导致RecA更紧密地结合至DNA。
[0136]通过20-30 nm纳米孔检测结合至1-DNA的RecA蛋白丝已被证实(Kowalczyk etal., Nano Lett., 10 (I): 324—8，2010; Smeets et al., Nano Lett., 9 (9): 3089-95,2009;以及Hall et al.Nano Lett.，9(12):4441-5, 2009)，但长度〈20 bp 的蛋白丝(6个或更少的RecA蛋白)无法使用单个纳米孔来解析(因为易位速率与测量SNR之间耦合)。
[0137]该实施例的初始实验使用结合了珠子和未结合珠子的1-DNA，其已被暴露于不同浓度的RecA，以生成几乎未包被、部分包被以及完全包被的DNA。每个孔电流的实时监测可被用来调整受控递送的进展，并且会与蛋白丝的位置定位相关联。重复测量每个DNA会提高RecA定位的精确度。
[0138]当RecA结合至DNA时，所增加的电荷和体积，以及在高盐时的稳定性，使得它成为在利用本文提出的仪器的受控递送期间实现检测和位置定位的理想候选物。
[0139]对结合了 RecA的DNA的控制也可在不使用珠子(其被连接用以阻碍易位)的情况下实现。对于实施例1中的dsDNA实验，主动电压控制可被用来在DNA离开纳米孔之前迅速启动竞争电压控制。因为结合至DNA的带电物质通过改变DNA的净电荷和硬度而影响DNA在电场中的运动，因此运动控制隧道效应实验可审核结合至dsDNA的RecA对用于控制dsDNA的运动的力平衡的影响。
[0140]该实施例可证实，所观察到的最短的蛋白丝长度在低RecA浓度时能够以高SNR和足够慢的且受控的速度被检测到，因而如果存在的话，任何结合在分离物中的RecA蛋白都可被检测到。
[0141]因此，该双孔装置提供了一种全新的用于基础研究的单分子仪器，因为人们可验证检测额外蛋白质向RecA-DNA蛋白丝的结合的能力，这种结合会增加蛋白丝宽度，因而可通过所观察到的电流的降低而被检测到。例如，结合至RecA-DNA蛋白丝的蛋白质包括LexA和噬菌体I阻遏蛋白，其利用RecA来感测细胞的状态并打开或关闭下游调节事件。
[0142]校准实验可包括检测结合至DNA上的特定序列(位点)的蛋白质，使得蛋白诱导的电流变化随后可允许估算DNA通过孔的速率以及速度控制性能。结合至dsDNA上的特定位点的示例性蛋白质包括Lac阻遏蛋白(结合至21 bp区段)、噬菌体I阻遏蛋白(具有位于1-DNA上的多个操作子位点)以及其他蛋白。
[0143]实施例3.检测和定位单链DNA内的双链区段
该实施例证实了利用不同长度的双链区段形成多至10 kb的ssDNA。
[0144]在第一步中，可通过长片段PCR制造出10 kbp dsDNA。该链的一端被生物素化，以用于连接珠子，并且这些链通过化学变形而分开。未连接珠子的10 kb ssDNA随后用作双孔实验中的被测量链。具有期望尺寸的互补单链区段可通过PCR以及随后进行的珠子捕获(bead capturing)和链分离来制造。
[0145]可使用具有不同长度且位于被测量的10 kb ssDNA内多个位点的ssDNA区段，以一组 100 nt 的区段开始。在 Skinner et al., Nano Lett., 9 (8): 2953-60, Jan 2009 中，利用通过单个固态孔的离子电流来区分dsDNA与ssDNA同聚物，以及嘌呤和嘧啶同聚物。因此，利用该双孔装置，在足够高的电压下，将DNA中的单链区段和双链区段区分开来的可能性是很高的。定位ssDNA和dsDNA区段使得纳米孔测序能够使用杂交辅助方法(即使所提出的该方法依赖于非常昂贵的杂交辅助工序)，并且可用来在长的距离内展示出靶DNA序列的位置和特性(靶向测序)。人们还可利用单链DNA结合(SSB)蛋白作为珠子，该珠子通过结合至ssDNA并通过产生比dsDNA更大的阻抗来进一步放大ssDNA与dsDNA在离子电流方面的差别。
[0146]实施例4.长ssDNA的捕获和控制以及RecA的定位
该实施例证实了长ssDNA的捕获和控制以及结合至该ssDNA的RecA蛋白丝的检测和定位。此外，它还显示该双孔装置可以检测到ssDNA内的嘌呤和嘧啶同聚区段。
[0147]可如在Stefan et al., Nano Lett., 10:1414-20，2010 中所不的那样，通过 20nm SiN 膜中的 10 nm 孔对 7 kb ssDNA 进行随机理顺(detangling)。虽然 Stefan et al.2010中的单纳米孔方法通过被理顺的ssDNA与孔/膜表面之间的机械接触作用力来解开ssDNA，但发明人预期双孔竞争电压装置可通过作用于最靠近每个孔的DNA骨架上的每个电压作用力来通过电泳强迫ssDNA在足够高的竞争电压下在靠近孔并在孔之间进行理顺。
[0148]理顺以及随后的ssDNA通过双孔装置的速率的精确控制对于长ssDNA分子的最终测序是重要的。在足够高的电压(约400 mV)时，可以区分ss-DNA内的嘌呤同聚区段和嘧唳同聚区段(Skinner et al., Nano Lett., 9 (8): 2953-60, Jan 2009),这对于诊断应用并且可能对于癌症研究都是有价值的。
[0149]该实施例还利用了 RecA，或其他单链DNA结合(SSB)蛋白，作为可检测的“减速障碍”，该减速障碍能够通过结合至ssDNA并制造处较大的阻抗来辨别ssDNA离子电流。这些减速障碍将允许直接量化可能的受控ssDNA速度，这又证实了所需要的I ms/nt是可实现的。因为RecA不需要结合至特定的三核苷酸序列位点，而优选结合至TGG重复序列并且还趋于结合至已经形成RecA蛋白丝的地方，因此，校准实验需要使用确实会结合至特定的已知序列位点的其他ssDNA结合分子。根据竞争电压值确定分子的速度需要具有已知的结合位点，当通过每个孔时，这些位点可被检测到。一个非限制性的例子是使用杂交制一个或多个已知位点的双链(或系有珠子的双链)，由此可利用电流的变化来检测每个双链从每个孔通过，并且随后估算对于选定电压值的通过链速度。随后，RecA蛋白丝可形成在这些分子上并可被检测，并将双链特征保持为基准检测点，RecA蛋白丝可相对该基准监测点被检测，进而可推知它们的位置。
[0150]确定基因单倍体型的方法以及通过向dsDNA中加入荧光标记物的DNA图谱方法(Xiao, et al., Us patent n0.7771944 B2, 2010)也可使用该双孔装置，因为珠子标记物(例如，量子点或任何荧光标记物)体积更大，并且就像dsDNA上的结合蛋白一样，会产生电流变化。而且，该双孔法比使用高分辨率成像方法(即，全内反射荧光显微镜)来检测和定位标记物位置更简单且便宜很多。还要注意的是，对于检测较大的特征(蛋白质、双链区段、珠子连接物)来说，相比于检测较小的特征，受控递送期间由布朗运动导致的任何速度波动具有小得多的害处。
[0151]要理解的是，虽然本发明已结合以上实施方式来描述，但前文的描述和实施例仅是解释性的且并非是对本发明的范围的限制。对于本发明所属领域技术人员来说，在本发明的范围内的其他方面、优点和改进都是显而易见的。
【权利要求】
1.一种装置，包括(a)多个腔室，每个腔室与相邻的腔室通过至少一个孔连通，其中所述装置含有被定义为第一孔和第二孔的至少两个孔，(b)用于将所述聚合物的至少一部分从所述第一孔移出并移入所述第二孔的装置，以及(c)至少一个传感器，所述传感器能够在所述聚合物移动通过所述第一孔和第二孔期间识别所述聚合物的单个成分，条件是当仅使用单个传感器时，所述单个传感器不包括设置在一个孔的两端用来测量通过该孔的离子电流的两个电极。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述第一孔和第二孔的直径为约Inm至约100nm,并且彼此隔开约10 nm至约10000 nm。
3.根据权利要求1或2所述的装置，其中所述传感器被配置成通过测量与所述聚合物有关或与所述聚合物的一个或多个成分有关的电流、电压、pH、光学特征或驻留时间来识别所述聚合物。
4.根据前述权利要求的任一项所述的装置，其中所述传感器被配置成形成隧道间隙，当所述聚合物被加载到第一孔和第二孔中时，允许所述聚合物通过所述隧道间隙。
5.根据权利要求4所述的装置，其中所述传感器包括具有形成所述隧道间隙的孔的膜。
6.根据权利要求5所述的装置，其中所述孔是实质上圆形的。
7.根据权利要 求4所述的装置，其中所述传感器包括两个端部，在该两个端部之间形成一个隧道间隙。
8.根据权利要求4所述的装置，其中所述传感器包括一个端部和一个实质上平坦的表面，在该端部和表面之间形成一个隧道间隙。
9.根据权利要求4所述的装置，其中所述传感器包含两个电极，所述两个电极间隔开以在它们之间形成一个隧道间隙。
10.根据前述任一项权利要求所述的装置，其中所述传感器被设置在所述第一孔内。
11.根据权利要求1-9的任一项所述的装置，其中所述传感器被设置在所述第一孔和第二孔之间的腔室内。
12.根据权利要求11所述的装置，其中所述传感器对准所述第一孔和第二孔。
13.根据前述任一项权利要求所述的装置，其中所述传感器包含金、钼、石墨烯或碳。
14.根据权利要求4-13的任一项所述的装置，其中所述隧道间隙的宽度为约Inm至约20 nm。
15.根据权利要求4-14的任一项所述的装置，其中所述传感器包括由试剂实现的表面改性。
16.根据权利要求15所述的装置，其中所述试剂能够与核苷酸形成非共价键。
17.根据权利要求16所述的装置，其中所述键是氢键。
18.根据权利要求15所述的装置，其中所述试剂选自4-巯基苯甲酰胺和1-H-咪唑-2-甲酰胺。
19.根据前述任一项权利要求所述的装置，其中所述第一孔和第二孔基本上是共轴的。
20.根据前述任一项权利要求所述的装置，其中所述装置包含选自以下的一种材料:硅、氮化硅、二氧化硅、石墨烯、碳纳米管、TiO2, HfO2, Al2O3、金属层、玻璃、生物学纳米孔、具有生物学孔插入体的膜以及它们的组合。
21.根据前述任一项权利要求所述的装置，其中所述第一孔和所述第二孔的深度为约0.3 nm 至约 1000 nm。
22.根据前述任一项权利要求所述的装置，所述装置进一步包括至少两个用于连接至电源的电极，从而生成横跨第一孔的电压和横跨第二孔的电压。
23.根据权利要求22所述的装置，其中所述横跨第一孔的电压和所述横跨第二孔的电压是独立可调的。
24.—种确定多核苷酸的序列的方法,包括: Ca)将包含多核苷酸的样品加载到权利要求23所述的装置中， (b)调节横跨第一孔的电压和横跨第二孔的电压，从而将所述多核苷酸放置成横跨这两个孔，其中所述多核苷酸以相同方向移动通过这两个孔；以及 (c)使用所述传感器识别所述多核苷酸的多个核苷酸。
25.—种确定多肽的序列的方法,包括: Ca)将包含多肽的样品加载到权利要求23所述的装置中， (b)调节横跨第一孔的电压和横跨第二孔的电压，从而将所述多肽放置成横跨这两个孔，其中所述多肽以相同方向移动通过这两个孔；以及 (c)使用所述传感器识别所述多肽的多个氨基酸。
【文档编号】G01N33/487GK104024850SQ201380003740
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2013年10月9日 优先权日:2012年10月10日
【发明者】丹尼尔·亚历山大·海勒, 特沃·J·墨林 申请人:双孔兄弟公司