出血性大肠杆菌o157:h7免疫胶体金快速检测试纸条的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种出血性大肠杆菌O157:H7的免疫胶体金检测试纸条，具有样品垫、金标垫、NC膜和吸收垫，其特征在于：其中，由保藏号为CGMCCNo.6610的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体GS2-D3作为金标抗体偶联胶体金，以及由保藏号为CGMCCNo.8458的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体3A8F11B10E7作为检测抗体，金标抗体偶联胶体金后喷涂于金标垫上，检测抗体喷涂于NC膜上形成检测线。另外，本发明还提供了出血性大肠杆菌O157:H7的胶体金检测试纸条在检测食品出血性大肠杆菌O157:H7中的应用。本发明的出血性大肠杆菌O157:H7的免疫胶体金检测试纸条具有检测特异性和灵敏性均较高的优点。
【专利说明】出血性大肠杆菌0157:H7免疫胶体金快速检测试纸条
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种免疫胶体金快速检测试纸条，属于生物检测领域。
【背景技术】
[0002]在食品微生物检测中，检测大肠杆菌的含量是一个重要的食品安全指标。2003?2004年的统计结果显示，我国食物中毒致病因素依次为微生物性、化学性、有毒动植物性病原。微生物性病原是导致食物中毒的主要因素，中毒人数最多。食源性致病菌快速检测一直是研究关注的焦点。
[0003]肠出血性大肠杆菌(EnterohemorrhageEscherichia coli,EHEC)0157:H7 引起的肠道感染性疾病已成为一个严重的全球性公共卫生问题，该病可引起腹泻、出血性肠炎、继发溶血性尿毒综合症(HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)等。HUS和TTP的病情凶险，其中3%?5%的HUS病人死亡，约有12%的HUS病人有严重的后遗症，危害十分严重。自1982年美国首次发现该病以来，在世界上许多国家相继发生了暴发和流行，尤其1996年5月?8月间日本发生了由出血性大肠杆菌0157:H7引起的人类历史上规模最大的一次暴发流行，累积患者近万人，并有数人死亡，因此引起了世界的普遍关注。我国在1987年就发现该种大肠杆菌引起的散在感染，近几年已陆续有十多个省份在食品、家禽、家畜、昆虫和腹泻病患者中检出该致病菌，存在着疫情暴发、流行的潜在威胁。目前市场上有多种产品用于检测出血性大肠杆菌0157:H7，其中有一些是使用免疫胶体金方法的试纸条，但是现有技术中的免疫胶体金试纸条所使用的抗体往往是使用单克隆抗体作为金标抗体和多克隆抗体作为检测抗体配合使用，因此存在着检测精度低和交叉反应高、试纸条有效期短等问题，对检测的精度和准确度造成了 一些影响。
【发明内容】
[0004]为解决上述问题，本发明提供了一种出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条，具有样品垫、金标垫、NC膜和吸收垫，其特征在于:其中，由保藏号为CGMCCN0.6610的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体GS2-D3作为金标抗体偶联胶体金，以及由保藏号为CGMCC N0.8458的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体3A8F11B10E7作为检测抗体，金标抗体偶联胶体金后喷涂于金标垫上，检测抗体喷涂于NC膜上形成检测线。
[0005]另外，本发明还提供了出血性大肠杆菌0157:H7的胶体金快速检测试纸条在检测食品出血性大肠杆菌0157:H7中的应用。
[0006]发明作用与效果
[0007]根据本发明的出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条，由于采用了配对单克隆抗体分别喷涂金标垫和检测线，实验结果对出血性大肠杆菌0157:H7的检测特异性和灵敏性均较高。
【专利附图】
【附图说明】[0008]图1是本发明实施例中出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条的单抗SDS-PAGE电泳图；
[0009]图2是本发明实施例中出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条的各抗体偶联胶体金PH结果；
[0010]图3是本发明实施例中出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条的各抗体偶联胶体金结合量结果；
[0011]图4是本发明实施例中出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条的结构示意图；
[0012]图5是本发明实施例中出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条的各抗体组合配对结果；
[0013]图6是本发明实施例中出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条的胶体金试纸条灵敏度结果；
[0014]图7是本发明实施例中出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条的胶体金试纸条交叉反应结果；以及
[0015]图8是本发明实施例中出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条的胶体金试纸条模拟带菌实验结果。
[0016]保藏信息:
[0017]1.出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体的杂交瘤细胞株GS2-D3于2012年9月24日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)Jia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码:100101，
[0018]保藏号为中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，中国，北京市)N0.6610。
[0019]2.出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体的杂交瘤细胞株3A8F11B10E7于2013年11月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码:100101
[0020]保藏号为:CGMCCN0.别58。
【具体实施方式】
[0021]以下结合附图介绍本发明的【具体实施方式】:
[0022]首先介绍本发明实施例中所使用的试剂与仪器:
[0023]主要试剂
[0024]弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、PEG、TWEEN-20Sigma ；BSA上海世泽生物科技有限公司；胶体金溶液上海金标生物科技有限公司；硝酸纤维素膜(NC膜)135S Millipore ；羊抗鼠、HRP-羊抗鼠、羊抗兔生工生物工程股份有限公司。
[0025]主要仪器
[0026]酶标仪SpectraMax M2 购自 Molecular Devices ;Nanodrop2000C 购自 ThermoScientific ;点样仪AD6010购自B10-D0T ;扫描仪Phantom V9购自MICROTEK ;恒温培养摇床SPH-100B购自上海世平；蛋白纯化仪BioLogic? LP358BR5057购自BIO-RAD ;单人净化工作台SW-SJ-2D型购自苏州净化。
[0027]一、出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体制备[0028]1.免疫原和阳性标准品的准备
[0029]出血性大肠杆菌0157:H7 (ATCC43895)接种在山梨醇麦康凯(SMAC)平板上，37°C培养24h，挑取单菌落于改良E.C新生霉素增菌肉汤，37°C、150r/min振荡培养17h，计数，加入0.3%甲醛溶液室温灭活I天。用生理盐水调整出血性出血性大肠杆菌0157:H7(ATCC43895)浓度至5 X 109CFU/ml作为免疫原。
[0030]用生理盐水调整浓度为108CFU/ml出血性大肠杆菌0157:H7作为阳性对照标准品，改良E.C新生霉素增菌肉汤为阴性对照标准品。
[0031]2.单克隆抗体的制备过程
[0032]I)实验动物:选3只8周龄，体重20g左右、雌性Balb/c小鼠为实验动物。
[0033]2)免疫方法:每只小鼠腹腔注射0.2ml免疫原，每间隔2周用同样剂量加强注射一次。
[0034]3)米血:3次加强免疫后从尾部静脉米血，米用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价。待效价不再上升，腹腔注射同样量免疫原，3天后按照常规方法进行细胞融合。
[0035]4)细胞融合:取免疫小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50%PEG作用下常规融合，分别接种于96孔培养板，置于37°C、5%C02培养箱培养。
[0036]5)杂交瘤细胞筛选:采用间接非竞争酶联免疫法，筛选强阳性孔的杂交瘤细胞，将其转移至24孔培养板。
[0037]6)克隆培养及抗体制备:用有限稀释法进行克隆化培养。当细胞生长至铺满孔底1/10时，再用同样方法检测，将强阳性孔再克隆，如此反复3 — 4次，直至阳性率达到100%。将杂交瘤细胞扩大培养，注射于经石蜡油预处理的Balb/c小鼠腹腔，每只2 X 106个杂交瘤细胞，7?10天小鼠腹部隆起，活体穿刺抽取腹水。用辛酸-硫酸铵法从小鼠腹水中纯化抗体。
[0038]筛选出3株稳定分泌抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为GS2-D3(简称D3)、3A8F11B10E7(简称E7)、5H11D8A5B9 (简称B9)，分别进行亚类及亚型鉴定、测定浓度、相对分子质量，并对制备的单克隆抗体通过交叉反应进行特异性验证。
[0039]3.单克隆抗体的亚型鉴定
[0040]通过单克隆抗体亚型鉴定试剂盒测定各抗体亚类、亚型，表3结果为显色终止后450nm处OD值，由表2可得，B9亚类为IgGl，轻链亚型为κ ;Ε7亚类为IgG2a，轻链亚型为K ;D3亚类为IgGl,轻链亚型为κ。
[0041]表I单克隆抗亚类、亚型结果
[0042]
【权利要求】
1.一种出血性大肠杆菌0157:H7的胶体金快速检测试纸条，具有衬板，以及在衬板上依次排列的样品垫、金标垫、NC膜和吸收垫，其特征在于: 其中，由保藏号为CGMCC N0.6610的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体GS2-D3作为金标抗体偶联胶体金，以及由保藏号为CGMCC N0.8458的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体3A8F11B10E7作为检测抗体，所述金标抗体偶联胶体金后喷涂于所述金标垫上，所述检测抗体喷涂于所述NC膜上形成检测线。
2.如权利要求1所述的出血性大肠杆菌0157:H7的胶体金快速检测试纸条在检测食品出血性大肠杆菌0157: H7中的应用。
【文档编号】G01N33/577GK103792362SQ201410029444
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月22日 优先权日:2014年1月22日
【发明者】刘箐, 刘程 申请人:上海理工大学