表面等离子体共振生物芯片及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物芯片领域，具体涉及一种表面等离子体共振生物芯片及其制备方法与应用。所述生物芯片是通过在固相载体固定蝇毒磷-卵清蛋白耦联物作为生物探针，利用金膜产生表面等离子体共振响应，利用自组装单分子层技术在金膜表面修饰巯基，芯片活化后在生物芯片上固定探针得到的；该生物芯片的应用包括利用表面等离子体共振生物芯片直接法检测蝇毒磷单克隆抗体的应用和利用表面等离子体共振生物芯片通过抑制法检测蝇毒磷的应用。直接检测法可进行抗体的筛选，研究免疫反应动力学；竞争抑制法可检测蝇毒磷小分子的浓度，检测限低于25μg/L。该生物芯片具有快速、实时、能现场检测的特点，灵敏度高而成本低，不污染环境。
【专利说明】表面等离子体共振生物芯片及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物芯片领域，具体涉及一种表面等离子体共振生物芯片及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]二十世纪九十年代,人类基因组计划(Human Genome Project, HGP)和分子生物学相关学科的发展为生物芯片、基因芯片技术的出现和发展提供了有利条件。生物芯片(biochip)是根据生物分子间特异相互作用的原理，将生化分析过程固着于芯片表面，从而实现对DNA、RNA、多肽、蛋白质以及其他生物成分的高通量快速检测。蛋白质芯片(proteinchip)是将蛋白质或抗原等一些非核酸生命物质固定在微型载体上获得，芯片上的探针构成为蛋白质或芯片作用对象为蛋白质者统称为蛋白质芯片。
[0003]尽管生物芯片技术已经取得了长足的发展，得到世人的瞩目，但仍然存在着许多问题，例如技术成本昂贵、操作复杂、重复性差、分析范围较狭窄、通常需要放射性元素标记或者荧光标记等。这些问题主要表现在样品的制备、探针合成与固定、分子的标记、数据的读取与分析等方面。荧光法是目前使用最多的标记方法，灵敏度不高，需要避光，用于检测结果的激光扫描仪价格昂贵。同位素标记法需要同位素和放射自显影，使用不便，操作复杂，耗时，有严重的污染。
[0004]有机磷农药(organophosphorus pesticide, OPPs)是一类含有不同取代基团的磷酸酯，通过对乙酰胆碱酯酶的抑制作用起到杀虫效果，在创造巨大经济效益的同时，对环境造成了不可忽视的污染。中国是世界上施用农药量最大的国家之一，其中有机磷类农药用量接近农药用量的70%。有机磷农药会在果蔬等农产品中残留，严重威胁人类健康，对人类及动物具有神经毒性作用，会引起神经功能紊乱、震颤、精神错乱、语言失常甚至死亡等中毒症状，有机磷农药引起的中毒事件时有发生，并且人类通过饮食摄入还会将残留农药蓄积于体内，从而给人体造成慢性伤害。因此食品中有机磷农药残留问题一直受到人们关注，很多有机磷农药已被禁止或限制使用，一些国家及国际组织对食品中有机含磷农药的残留严格规定了限量，中国规定蝇毒磷在蔬菜和水果中的残留量低于0.05mg/kg,欧盟制定有机磷农药的最大残留限量(MRL)是0.lmg/kg。欧洲、日本等国家和地区不断修改进口水果、蔬菜中有机磷农药残留量的限制规定，因此有关农产品中有机磷农药残留检测方法的研究十分迫切且必要。
[0005]蝇毒磷是常用的有机磷农药，传统的蝇毒磷检测方法以色谱技术为主，如低压气相色谱-质谱联用技术、高效液相色谱法、薄层色谱法，另外还有波谱法和酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)等,这些方法灵敏度高,但是样品前处理过程繁琐，仪器贵重，操作复杂，成本高，不利于大批量样品的快速检测和现场检测，因此，开发简单、快速、灵敏和廉价的农药检测方法是一个亟待解决的问题。
[0006]表面等离子体共振(surface plasmon resonance, SPR)是一种基于麦克斯韦电磁波理论的物理光学现象，它产生于具有复介电常数这一特性的金属表面。表面等离子体共振技术(SPR)利用P偏振光在玻璃与金属薄膜界面处发生全内反射时进入金属薄膜内的隐失波(倏逝波)，引发金属中的自由电子产生表面等离子体，当隐失波的波矢与表面等离子体的波矢相匹配时，二者将发生共振，入射光的能量被表面等离子体吸收，反射光强急剧下降，发生SPR现象，这时对应的入射角度称为谐振角或者共振角。如果将探针或配体固定于传感器芯片表面，含待分析物的样品流经传感器表面，若流过生物芯片表面的样品中含有与之结合的物质，它们之间发生的相互作用将导致芯片表面的介质折射率发生改变，弓丨起SPR共振角发生改变。通过检测SPR信号改变检测分子间的相互作用的特异性、浓度、动力学、亲合性、协同作用、相互作用模式等。在生物分子相互作用分析过程中，靶物质可以天然存在于分析物中，在自然条件下进行分析，保证了所得结果的真实性。因此，SPR生物传感器具有实时、免标记、操作简单、可定量检测生物分子、检测两种或多种分子间结合的优点。目前，SPR技术已广泛应用于食品检测、药物筛选、疾病诊断等领域。
【发明内容】
[0007]本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种表面等离子体共振生物芯片，该生物芯片以蝇毒磷-卵清蛋白耦联物(H11-OVA)作为探针。
[0008]本发明的另一目的在于提供上述表面等离子体共振生物芯片的制备方法。
[0009]本发明的再一目的在于提供上述表面等离子体共振生物芯片的应用。
[0010]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0011]一种表面等离子体共振生物芯片的制备方法，包含如下步骤:
[0012](1)在玻璃基底上沉积厚度为45~55nm的金膜作为表面等离子体共振生物芯片的固相载体；
[0013](2)在培养皿中注入含有HS (CH2)ltlCOOH酸)和HS (CH2)60H (巯基己酸)的乙醇溶液，对金膜表面进行化学修饰；然后通入PBS缓冲液清洗，洗掉未结合物质；氮气吹干；
[0014](3)将上述固相载体固定在SPR检测仪上；
[0015](4)流通池中通入PBS缓冲液清洗，待基线稳定后加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-乙基-N’ - (二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)的混合液活化芯片；然后通入PBS缓冲液清洗；
[0016](5)在生物芯片表面固定蝇毒磷-卵清蛋白耦联物(H11-OVA);记录表面等离子体共振共振角的变化，监测生物探针固定的过程，SPR响应值有大幅升高，则探针固定效果较好，当共振角不再升高时，探针固定过程结束；然后注入PBS缓冲液清洗；
[0017](6)加入乙醇胺(Eth)溶液封闭灭活剩余的酯键；然后通入PBS缓冲液清洗；得到表面等离子体共振生物芯片。
[0018]步骤(1)中所述的玻璃基底优选直径为20mm、厚度为1mm的圆形玻璃片；所述的金膜的厚度优选为50nm ；
[0019]步骤(2)中所述的HS(CH2)iciCOOH的终浓度为0.1~10mM，优选为0.1mM ;所述的HS (CH2)6OH的终浓度为0.1~IOOmM,优选为0.9mM ；
[0020]步骤(2)中所述的化学修饰的条件为37°C温浴，避光反应0.5~6h，优选为2h ；
[0021]步骤(2)所述的氮气吹干的温度为40~60°C，优选为50°C ；[0022]步骤(4)中所述的N-羟基琥珀酰亚胺的终浓度为0.05mol/L，所述的N-乙基-N’ - (二甲氨基丙基)碳二亚胺的终浓度为0.05mol/L ；
[0023]步骤(4)中所述的活化芯片的时间为10~60min，优选为15min ；
[0024]步骤(5)中所述的蝇毒磷-卵清蛋白耦联物(H11-OVA)的浓度优选为83mg/L ;所述的固定的时间为10~90min,优选为30min ;其中，H11为根据蝇毒磷结构设计的半抗原，H11的结构式如式I所示:
【权利要求】
1.一种表面等离子体共振生物芯片的制备方法，其特征在于包含如下步骤: (1)在玻璃基底上沉积厚度为45~55nm的金膜作为表面等离子体共振生物芯片的固相载体； (2)在培养皿中注入含有HS(CH2)ltlCOOH和HS(CH2)6OH的乙醇溶液，对金膜表面进行化学修饰；然后通入PBS缓冲液清洗，洗掉未结合物质；氮气吹干； (3)将上述固相载体固定在SPR检测仪上； (4)流通池中通入PBS缓冲液清洗，待基线稳定后加入N-羟基琥珀酰亚胺和N-乙基-N’ - (二甲氨基丙基)碳二亚胺的混合液活化芯片；然后通入PBS缓冲液清洗； (5)在生物芯片表面固定蝇毒磷-卵清蛋白耦联物，记录表面等离子体共振共振角的变化，监测生物探针固定的过程，当共振角不再升高时，探针固定过程结束；然后注入PBS缓冲液清洗； (6)加入乙醇胺溶液封闭灭活剩余的酯键；然后通入PBS缓冲液清洗；得到表面等离子体共振生物芯片。
2.根据权利要求1所述的一种表面等离子体共振生物芯片的制备方法，其特征在于: 步骤(1)中所述的玻璃基底为直径为20mm、厚度为1mm的圆形玻璃片；所述的金膜的厚度为50nm ； 步骤(2)中所述的HS(CH2)ltlCOOH的终浓度为0.1mM ;所述的HS(CH2)6OH的终浓度为0.9mM ；` 步骤(2)中所述的化学修饰的条件为37°C温浴，避光反应2h ； 步骤(2)所述的氮气吹干的温度为50°C ； 步骤(4)中所述的N-羟基琥珀酰亚胺的终浓度为0.05mol/L，所述的N-乙基-N’- (二甲氨基丙基)碳二亚胺的终浓度为0.05mol/L ； 步骤(4)中所述的活化芯片的时间为15min ； 步骤(5)中所述的蝇毒磷-卵清蛋白耦联物的浓度为83mg/L;所述的固定的时间为30min ； 步骤(6)中所述的乙醇胺溶液的浓度为lmol/L，pH值为8.5 ;所述的封闭灭活的时间为 6min ； 步骤(2 )、( 4 )、( 5 )和(6 )中所述的PBS缓冲液清洗的次数为2次，清洗的时间为2min ;所述的PBS缓冲液的组成如下:终浓度为2mmol/L的NaH2PO4、终浓度为2mmol/L的Na2HP04、终浓度为 150mmol/L 的 NaCl 和水，pH 值为 7.4。
3.一种表面等离子体共振生物芯片，其特征在于采用权利要求1或2所述方法制备得到。
4.权利要求3所述的一种表面等离子体共振生物芯片在生物芯片领域中的应用。
5.根据权利要求4所述的一种表面等离子体共振生物芯片在生物芯片领域中的应用，其特征在于:包括利用表面等离子体共振生物芯片通过直接法检测蝇毒磷单克隆抗体的应用、利用表面等离子体共振生物芯片通过抑制法检测蝇毒磷小分子的应用和利用表面等离子体共振生物芯片通过连续抑制法检测蝇毒磷小分子的应用。
6.根据权利要求5所述的一种表面等离子体共振生物芯片在生物芯片领域中的应用，其特征在于:所述的利用表面等离子体共振生物芯片通过直接法检测蝇毒磷单克隆抗体，包含如下步骤: (一)建立标准曲线: 已知浓度的蝇毒磷单克隆抗体用PBS缓冲液配置成不同浓度的标准溶液，以PBS缓冲液为基准，各个标准溶液分别注入表面等离子共振仪的微流通池，与表面等离子体共振生物芯片上的探针发生免疫反应，对生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得各个标准溶液的表面等离子共振动力学曲线，以标准溶液浓度作为横坐标，共振角作为纵坐标，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归标准曲线； (二)未知样品的检测: 将未知样品注入微流通池与表面等离子体共振生物芯片上的探针发生免疫反应，对表面等离子体共振生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得未知样品的表面等离子体共振动力学曲线，结合步骤(一)得到的回归标准曲线，计算出未知样品中蝇毒磷单克隆抗体的浓度； (三)下一样品检测: 步骤(二)中的免疫反应结束后，微流通池先通入PBS缓冲液清洗I~5次，每次清洗的时间是I~5min ;再通入SDS-HCl溶液清洗I~3次，每次清洗时间是I~3min，使抗原-抗体结合物解离；然后通入PBS缓冲液I~5次，每次清洗的时间是I~3min ；SPR响应值降回基线，继续检测下一个样品。
7.根据权利要求6所述的一种表面等离子体共振生物芯片在生物芯片领域中的应用，其特征在于: 步骤(一)中所述的蝇毒磷单克隆抗体标准溶液的浓度范围为0.01mg/L~100mg/L ； 步骤(一)所述的标准溶液的检测量为100 μ L ;所述的免疫反应的反应时间为5~6min ;所述的表面等离子体共振扫描范围为I~2° ； 步骤(二)中所述的未知样品的检测量为IOOyL ;所述的免疫反应的反应时间为5~6min ;所述的表面等离子体共振扫描范围为I~2° ； 步骤(三)中所述的SDS-HCl溶液中SDS的质量分数为1%，HCl的浓度为0.01mol/L ； 步骤(三)中所述的PBS缓冲液清洗次数为2次，每次清洗的时间为2min;所述的SDS-HCl溶液清洗次数为I次，清洗的时间为I~3min ； 所述的PBS缓冲液的组成如下:终浓度为2mmol/L的NaH2PO4、终浓度为2mmol/L的Na2HP04、终浓度为 150mmol/L 的 NaCl 和水，pH 值为 7.4。
8.根据权利要求5所述的一种表面等离子体共振生物芯片在生物芯片领域中的应用，其特征在于:所述的利用表面等离子体共振生物芯片通过抑制法检测蝇毒磷小分子，包含如下步骤: (I )建立标准曲线: 蝇毒磷标准品用PBS缓冲液配置成不同浓度的标准溶液，不同浓度的蝇毒磷标准溶液分别与定量蝇毒磷单克隆抗体溶液混合，静置，得到各个标准溶液与定量蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液；以PBS缓冲液为基准，各个标准溶液与定量蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液分别注入表面等离子共振仪的微流通池，与表面等离子体共振生物芯片上的探针发生免疫反应，对表面等离子体共振生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得各个标准溶液的表面等离子体共振动力学曲线，以标准溶液浓度作为横坐标，共振角作为纵坐标，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归标准曲线； (II)未知样品的检测: 将未知样品提取液和定量蝇毒磷单克隆抗体混合，静置，得到未知样品提取液和定量蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液，将上述混合溶液注入微流通池进行免疫反应，对表面等离子体共振生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得待测样品的表面等离子体共振动力学曲线，结合步骤(1)得到的回归标准曲线，计算出未知样品中蝇毒磷小分子的浓度； (III)下一样品的检测: 步骤(II)中的免疫反应结束后，微流通池先通入PBS缓冲液清洗I~3次，每次清洗的时间是I~5min ;再通入SDS-HCl溶液清洗I~3次，每次清洗时间是I~3min，使抗原-抗体结合物解离；然后通入PBS缓冲液I~5次，每次清洗的时间是I~3min ；SPR响应值降回基线，继续检测下一个样品。
9.根据权利要求8所述的一种表面等离子体共振生物芯片在生物芯片领域中的应用，其特征在于: 步骤(I )中所述定量蝇毒磷单克隆抗体在混合溶液中终浓度为10mg/L ； 步骤(I )中所述的蝇毒磷标准品分子量为362.78 ； 步骤(I )中所述的标准溶液的浓度范围为0.1~10000 μ g/L ； 步骤(I )中所述 的静置时间为8min ； 步骤(I )中所述的蝇毒磷标准品与蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液的检测量为100μ L ;所述的免疫反应的反应时间为6min ;所述的表面等离子体共振扫描范围为I~2° ; 步骤(II)中所述的定量蝇毒磷单克隆抗体在混合溶液中终浓度为10mg/L ;所述的静置时间为8min ； 步骤(II)中所述的未知样品提取液与定量蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液检测量为100 μ L ;所述的免疫反应的反应时间为6min ;所述的表面等离子体共振扫描范围为I~2° ; 步骤(III)中所述的SDS-HCl溶液中SDS的质量分数为1%，HCl的浓度为0.01mol/L ； 步骤(III)中所述的PBS缓冲液清洗次数为2次，每次清洗的时间为2min;所述的SDS-HCl溶液清洗次数为I次，清洗的时间为I~3min ； 所述的PBS缓冲液的组成如下:终浓度为2mmol/L的NaH2PO4,终浓度为2mmol/L的Na2HP04、终浓度为 150mmol/L 的 NaCl 和水，pH 值为 7.4。
10.根据权利要求5所述的一种表面等离子体共振生物芯片在生物芯片领域中的应用，其特征在于:所述的利用表面等离子体共振生物芯片通过连续抑制法检测蝇毒磷小分子，包含如下步骤: ①建立标准曲线: 蝇毒磷标准品用PBS缓冲液配置成不同浓度的标准溶液，不同浓度的蝇毒磷标准溶液分别与定量蝇毒磷单克隆抗体溶液混合，静置，得到各个标准溶液与定量蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液；以PBS缓冲液为基准，各个标准溶液与定量蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液分别注入表面等离子共振仪的微流通池，与表面等离子体共振生物芯片上的探针发生免疫反应，对表面等离子体共振生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得各个标准溶液的表面等离子体共振动力学曲线；以标准溶液浓度作为横坐标，共振角作为纵坐标，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归标准曲线； ②未知样品的检测: 将未知样品提取液和定量蝇毒磷单克隆抗体混合，静置，得到未知样品提取液和定量蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液，将上述混合溶液注入微流通池进行免疫反应，对表面等离子体共振生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得待测样品的表面等离子体共振动力学曲线，结合步骤①得到的回归标准曲线，计算出未知样品中蝇毒磷小分子的浓度； ③下一样品的检测: 步骤②中的免疫反应结束后，微流通池先通入PBS缓冲液清洗I~3次，每次清洗的时间是I~5min ;继续检测下一个样品； 步骤①中所述的定量蝇毒磷单克隆抗体在混合溶液中终浓度为10mg/L ；` 步骤①中所述的蝇毒磷小分子分子量为362.78 ； 步骤①中所述的标准溶液的浓度范围为0.1~10000 μ g/L ； 步骤①中所述的静置时间为8min ； 步骤①中所述的蝇毒磷标准品与蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液的检测量为100μ L ;所述的免疫反应的反应时间为6min ;所述的表面等离子体共振扫描范围为I~2° ; 步骤②中所述的定量蝇毒磷单克隆抗体在混合溶液中终浓度为10mg/L ;所述的静置时间为8min ；` 步骤②中所述的未知样品提取液与定量蝇毒磷单克隆抗体的混合溶液检测量为`100 μ L ;所述的免疫反应的反应时间为6min ;所述的表面等离子体共振扫描范围为I~2° ; 所述的PBS缓冲液的组成如下:终浓度为2mmol/L的NaH2PO4、终浓度为2mmol/L的Na2HP04、终浓度为 150mmol/L 的 NaCl 和水，pH 值为 7.4。
【文档编号】G01N21/41GK103884682SQ201410105426
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月20日 优先权日:2014年3月20日
【发明者】李莹, 钟金钢, 马骁, 齐攀 申请人:暨南大学