Samsn1蛋白在制备胶质母细胞瘤预后评估试剂或试剂盒中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，本发明提供了SAMSN1蛋白的新的用途，特别是SAMSN1蛋白在制备胶质母细胞瘤预后评估试剂或试剂盒中的应用。本发明采用免疫组化方法检测SAMSN1蛋白在胶质母细胞瘤组织中的相对表达量，能够判断胶质母细胞瘤患者的生存预后。基于SAMSN1蛋白的相对表达量与胶质母细胞瘤的这种相关性，以该蛋白作为分子标记对其表达量进行检测可以用于指导胶质母细胞瘤的预后判断。
【专利说明】SAMSN1蛋白在制备胶质母细胞瘤预后评估试剂或试剂盒中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种SAMSNl蛋白的新的用途，具体地说，涉及SAMSNl蛋白在制备胶质母细胞瘤预后评估试剂或试剂盒中的应用。
【背景技术】
[0002]脑胶质瘤是中枢神经系统最为常见的原发肿瘤，胶质母细胞瘤(Gliobalstomamultiforme’GBM)是其中最多见且恶性程度最高的类型。目前，经典的病理形态学方法仍是胶质母细胞瘤诊断、分类的主要方法，存在诸多不足。比如，同样诊断为GBM的病例中，虽然多数患者生存期为I年左右，但也有一些患者生存期可达3年以上。在接受的治疗方案大致相同的前提下，胶质母细胞瘤患者预后的差异性提示该肿瘤在遗传学背景和病理机制可能存在若干亚型，但目前尚缺少有效的指标来区分GBM亚型和准确判断预后。
[0003]本领域迫切需要寻找能区分胶质母细胞瘤分子亚型及准确判断预后的相关基因和/或蛋白，这方面的研究对临床治疗胶质母细胞瘤及预防肿瘤复发具有重要意义。
[0004]SAMSNl蛋白(SAM结构域、SH3结构域和核定位信号I，GeneID: 64092)的功能目前仍不十分清楚，推测具有接头蛋白功能，可与其他分子结合，在信号传导级联反应中发挥作用，并可能参与介导相关分子的细胞核内定位。有研究显示，SAMSNl参与免疫细胞的活化和分化过程；在正常的脑组织中，SAMSNl存在一定量的低水平表达；与髓系白血病、多发性骨髓瘤的病理机制相关；但在实体肿瘤中SAMSNl的作用尚不明确。(参见文献:von HM, GohlaA，Janssen KP，Iritani BMj Beer-Hammer S.1mmunoinhibitory adapter protein Srchomology domain3lymphocyte protein2(SLy2)regulates actin dynamics and B cellspreading.J Biol Chem.2011.286 (15): 13489-501.；Claudio J0，Zhu YX，Benn SJ，etal.HACSlencodes a novel SH3—SAM adaptor protein differentially expressed innormal andmalignant hematopoietic cells.0ncogene.2001.20 (38):5373-7.)
[0005]迄今为止，胶质母细胞瘤的发生的分子机制仍不清楚，有效的诊断、分型、治疗和预后判断靶点也十分有限。
[0006]目前尚无文献报道SAMSNl与胶质母细胞瘤病理机制或预后判定相关。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供SAMSNl蛋白的新的用途，特别是SAMSNl蛋白在制备胶质母细胞瘤预后评估试剂或试剂盒中的应用。
[0008]本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测SAMSNl蛋白在胶质母细胞瘤组织中的相对表达量，能够判断胶质母细胞瘤患者的生存预后。基于SAMSNl蛋白的相对表达量与胶质母细胞瘤的这种相关性，以该蛋白作为分子标记对其表达量进行检测可以用于指导胶质母细胞瘤的预后判断。
[0009]本发明提供了 SAMSNl蛋白在制备胶质母细胞瘤预后评估试剂或试剂盒中的应用。
[0010]所述的应用，是以常规方法制备SAMSNl蛋白的抗体，建立检测SAMSNl蛋白的定量方法及配套的试剂或试剂盒。
[0011]所述的SAMSNl蛋白的抗体，是单克隆抗体或多克隆抗体。
[0012]所述的应用，是指将SAMSNl蛋白作为分子标记，利用SAMSNl单克隆抗体或多克隆抗体，以及免疫组化实验试剂，分析SAMSNl蛋白在胶质母细胞瘤组织中的相对表达量。
[0013]利用特异性抗SAMSNl蛋白的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，用于制备确定胶质母细胞瘤手术预后的制剂或试剂盒，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。
[0014]所述的SAMSNl多克隆抗体为商品化抗体，制备方法参见文献Yokoyama, W.M.，Christensen, Μ.，Santos,G.D.and Miller, D.2006.Production of MonoclonalAntibodies.Current Protocols in Immunology.74:2.5.1 - 2.5.25。
[0015]所述的应用，配套的试剂或试剂盒还包括免疫组化实验试剂，即二甲苯，乙醇，3%H202甲醇液，1%BSA封闭液，DAB显色试剂，苏木素和辣根过氧化物酶。
[0016]进一步地，本发明还提供了利用上述配套的试剂或试剂盒，体外检测SAMSNl蛋白在胶质母细胞瘤组织中的表达量的方法，该方法包括以下步骤:
[0017](a)利用本试剂盒中的免疫组化实验试剂(二甲苯，乙醇，3%H202甲醇液，1%BSA封闭液，DAB显色试剂，苏木素和辣根过氧化物酶)标记羊抗兔IgG将胶质母细胞瘤组织切片进行免疫组化染色；
[0018](b)光镜下观察胶质母细细胞瘤组织染色情况，对肿瘤细胞胞浆中SAMSNl抗体染色情况进行积分；
[0019](c)根据评分判断SAMSNl在胶质母细胞瘤中高表达或低表达。
[0020]所述的该方法具体步骤如下:
[0021](I)制备胶质母细胞瘤组织石蜡切片，60°C烤箱过夜；
[0022](2)切片脱腊至水；
[0023](二甲苯① IOmin —二甲苯② IOmin —二甲苯③ IOmin — 100% 乙醇 5min — 95% 乙醇 5min — 85% 乙醇 5min — 75% 乙醇 5min —双蒸水 5min)
[0024](3) 3%H202 甲醇液，室温放置 20min ；
[0025](4)双蒸水洗 5min X 3 ；
[0026](5)抗原修复:切片放入0.0IM柠檬酸盐缓冲液(ρΗ6.0)中煮沸5min，停火lOmin，再煮沸5min ；
[0027](6)自然冷却至室温，双蒸水洗5minX3 ;
[0028](7) 1%BSA 封闭 30min，37 °C ；
[0029](8)甩去血清封闭液，滴加一抗(山羊抗人SAMSNl多克隆抗体)，37摄氏度持续一小时；
[0030](9)4°〇取出，室温复温151^11，然后0.0謹PBS洗5minX4;
[0031](10)滴加二抗(Envision 二抗试剂盒),根据二抗试剂盒说明书孵育。
[0032] (11)0.01M PBS 洗 5minX4，DAB 显色 2-10min，镜下观察；
[0033](12)双蒸水终止显色，苏木素复染10秒；
[0034](13)分化后自来水返蓝，蒸馏水浸泡；[0035](14)脱水透明，盖玻片覆盖；
[0036](15)显微镜下观察阳性染色，每个标本随机选择5个高倍镜视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞所在百分率。以细胞浆内出现黄色染色为阳性，按照染色的深浅，分为三个等级，其中浅黄色记为I分，棕黄色记为2分，棕褐色记为3分；以细胞浆内出现黄色染色的细胞为阳性细胞，计算100个细胞中的阳性细胞的数量，分值评分标准:阳性细胞的比例≤10%记为O分，(60%记为I分，(90%记为2分，> 90%记为3分。以染色积分乘以阳性率积分，即为该样本点中SAMSNl在相应细胞组分中表达量的终积分。
[0037](16) SAMSNl在胞浆内的积分≤5为低表达，> 5为高表达。
[0038]本发明的SAMSNl蛋白与胶质母细胞瘤相关性的发现为预测胶质母细胞瘤复发风险以及患者术后的生存或死亡提供一条全新的途径，对判断胶质母细胞瘤患者预后具有重要作用，对于胶质母细胞瘤病人术后监控和序贯治疗也具有重要的指导意义。当免疫组化评分高于5分时，胶质母细胞瘤易出现复发，患者术后生存期短、易死亡。
[0039]本发明利用免疫组化技术、系统评分测定胶质母细胞瘤肿瘤组织中SAMSNl蛋白的表达水平，并结合术后随访信息，确定SAMSNl蛋白表达水平与手术后胶质母细胞瘤患者预后存在相关性，SAMSNl蛋白能用于制备判断胶质母细胞瘤患者预后的蛋白质分子标记，对于胶质母细胞瘤的分子分型、病人术后监控和序贯治疗也具有重要的指导意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0040]图1为SAMSNl在胶质母细胞瘤组织(A)和正常脑组织(B)中的免疫组化染色结果图；肿瘤组织中可见 SAMSNl强阳性着色，正常脑组织弱着色。
[0041]图2为SAMSNl在胶质母细胞瘤组织和正常脑组织中的表达结果图；显示SAMSNl在正常脑组织和胶质母细胞瘤组织中的表达积分值分别为1.69±1.30和5.86±3.02，两者之间的差异具有显著的统计学意义(P〈0.01)。图3为SAMSNl在胶质母细胞瘤组织中免疫组化染色结果图；可见肿瘤细胞胞浆中SAMSNl呈广泛的强阳性着色(积分>5)，肿瘤组织中SAMSNl高表达。
[0042]图4为SAMSNl在胶质母细胞瘤组织中免疫组化染色结果图；可见肿瘤细胞胞浆中SAMSNl呈散在的阳性着色(积分〈5)，肿瘤组织中SAMSNl低表达。
[0043]图5为SAMSNl表达对113例胶质母细胞瘤生存期的影响曲线图；其中A为SAMSNl高表达和低表达两组患者之间总体生存期(OS)的差异；B为SAMSNl高表达和低表达两组患者之间无进展生存期(PFS)的差异。
【具体实施方式】
[0044]下面结合本发明的附图和实施例对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0045]在以下实施例中，胶质母细胞瘤患者的肿瘤组织标本均来自上海长征医院，由2名病理科医生明确为胶质母细胞瘤。
[0046]实施例1:
[0047]随机选取113例胶质母细胞瘤患者术后肿瘤组织和16例因手术需要切除的正常脑组织的石蜡切片(肿瘤组织切片均来自上海长征医院，由2名病理科医生确诊为胶质母细胞瘤；正常脑组织来自脑外伤患者因病情需要行内减压切除的脑组织，标本的获取均通过第二军医大学伦理审批)，本发明采用免疫组化方法检测SAMSNl蛋白在胶质母细胞瘤组织和正常脑组织中的表达情况并评分，具体步骤为:
[0048](I)制备胶质母细胞瘤组织石蜡切片，60°C烤箱过夜；
[0049](2)切片脱腊至水；
[0050](二甲苯① IOmin —二甲苯② IOmin —二甲苯③ IOmin — 100% 乙醇 5min — 95% 乙醇 5min — 85% 乙醇 5min — 75% 乙醇 5min —双蒸水 5min)
[0051 ] (3) 3%H202 甲醇液，室温放置 20min ；
[0052](4)双蒸水洗 5min X 3 ；
[0053](5)抗原修复:切片放入0.0IM柠檬酸盐缓冲液(ρΗ6.0)中煮沸5min，停火lOmin，再煮沸5min ；
[0054](6)自然冷却至室温,双蒸水洗5minX3 ;
[0055](7) 1%BSA 封闭 30min，37 °C ；
[0056](8)甩去血清封 闭液，滴加一抗(山羊抗人SAMSNl多克隆抗体，购自Abgent公司，型号AF1955a)，37摄氏度持续一小时；
[0057](9)4°〇取出，室温复温151^11，然后0.0謹PBS洗5minX4;
[0058](10)滴加二抗(Envision 二抗试剂盒，购自丹麦DAKO公司，型号GK500705)，根据
二抗试剂盒说明书孵育。
[0059](11)0.01M PBS 洗 5minX4，DAB 显色 2-10min，镜下观察；
[0060](12)双蒸水终止显色，苏木素复染10秒；
[0061](13)分化后自来水返蓝，蒸馏水浸泡；
[0062](14)脱水透明，盖玻片覆盖；
[0063](15)显微镜下观察阳性染色，每个标本随机选择5个高倍镜视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞所在百分率。以细胞浆内出现黄色染色为阳性，按照染色的深浅，分为三个等级，其中浅黄色记为I分，棕黄色记为2分，棕褐色记为3分；以细胞浆内出现黄色染色的细胞为阳性细胞，计算100个细胞中的阳性细胞的数量，分值评分标准:阳性细胞的比例≤10%记为O分，(60%记为I分，(90%记为2分，> 90%记为3分。以染色积分乘以阳性率积分，即为该样本点中SAMSNl在相应细胞组分中表达量的终积分。
[0064](16)如图1所示，肿瘤细胞胞浆中可见SAMSNl呈广泛的强阳性染色(图1A)，呈现显著高表达。对照的正常脑组织弱着色(图1B)，经多组实验验证，如图2所示，SAMSNl在胶质母细胞瘤组织和正常脑组织中的表达积分值分别为1.69±1.30和5.86±3.02，两者之间的差异具有显著的统计学意义(P〈0.01)。
[0065]实施例2:
[0066]随机取胶质母细胞瘤患者手术切除的肿瘤标本，制备胶质母细胞瘤患者肿瘤的组织切片，采用以上免疫组化方法的试验步骤检测SAMSNl蛋白在胶质母细胞瘤组织中的相对表达量，计算免疫组化评分。共检测113例胶质母细胞瘤组织，发现SAMSNl在77例(68.14%)胶质母细胞瘤组织中的表达积分高于5分。依据SAMSNl表达高低(当免疫组化评分高于5分为高表达，低于5分为低表达)将胶质母细胞瘤患者分组，绘制总体生存曲线图(图5A)和无进展生存曲线图(图5B)。结果表明肿瘤中SAMSNl呈高表达的患者手术后总体生存时间和无进展生存时间均明显短于低表达者。
[0067]实施例3:
[0068]样本:某胶质母细胞癌患者肿瘤的组织切片，采用以上免疫组化方法的试验步骤检测SAMSNl蛋白在胶质母细胞瘤组织中的相对表达量。胶质母细胞瘤组织的显微图片如图3所示。经计算，该组织的免疫组化评分为9。
[0069]经术后随访知，该患者术后6个月肿瘤复发并死亡，生存期仅6个月。
[0070]实施例4:
[0071]样本:某胶质母细胞瘤患者肿瘤的组织切片，采用以上免疫组化方法的试验步骤检测SAMSNl蛋白在胶质母细胞瘤组织中的相对表达量。胶质母细胞瘤组织的显微图片如图4所示。经计算，该组织的免疫组化评分为O。
[0072]经术后随访知，该患者术后37个月仍健在，且无肿瘤复发。
[0073]由以上试验结果可知，通过采用免疫组化的方法检测SAMSNl蛋白分子相对表达量能预测胶质母细胞瘤患者术后的无进展生存时间和总体生存时间。当免疫组化评分高于5时，胶质母细胞瘤易出现复发，患者术后易死亡。显然，SAMSNl蛋白与胶质母细胞瘤具有相关性，因此，以SAMSNl蛋白作为蛋白质分子标记对其表达量进行检测能预测胶质母细胞瘤手术后复发等事件，并判断预后。相应的，特异性抗SAMSNl蛋白的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，能用于制备确定胶质母细胞瘤手术预后的制剂或试剂盒，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。
[0074]以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
【权利要求】
1.SAMSNl蛋白在制备胶质母细胞瘤预后评估试剂或试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的SAMSNl蛋白在制备胶质母细胞瘤预后评估试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，该应用是以常规方法制备SAMSNl蛋白的抗体，建立检测SAMSNl蛋白的定量方法及配套的试剂或试剂盒。
3.根据权利要求2所述的SAMSNl蛋白在制备胶质母细胞瘤预后评估试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的SAMSNl蛋白的抗体，是单克隆抗体或多克隆抗体。
4.根据权利要求2所述的SAMSNl蛋白在制备胶质母细胞瘤预后评估试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，该应用是指将SAMSNl蛋白作为分子标记，利用SAMSNl单克隆抗体或多克隆抗体，以及免疫组化实验试剂，分析SAMSNl蛋白在胶质母细胞瘤组织中的相对表达量。
5.根据权利要求2至4任一所述的SAMSNl蛋白在制备胶质母细胞瘤预后评估试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的配套的试剂或免疫组化实验试剂包括:二甲苯，乙醇，3%H202甲醇液，1%BSA封闭液，DAB显色试剂，苏木素和辣根过氧化物酶。
6.根据权利要求2至4任一所述的SAMSNl蛋白在制备胶质母细胞瘤预后评估试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，该应用是利用该试剂或试剂盒，体外检测SAMSNl蛋白在胶质母细胞瘤组织中的表达量的方法，该方法包括以下步骤: (a)利用本试剂盒中的免疫组化实验试剂标记羊抗兔IgG将胶质母细胞瘤组织切片进行免疫组化染色； (b)光镜下观察胶质母细细胞瘤组织染色情况，对肿瘤细胞胞浆中SAMSNl抗体染色情况进行积分； (c)根据评分判断SAMSNl在胶质母细胞瘤中高表达或低表达。
【文档编号】G01N33/68GK103954768SQ201410140083
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月9日 优先权日:2014年4月9日
【发明者】严勇, 陈菊祥, 卢亦成, 徐涛, 王洪祥, 秦荣 申请人:中国人民解放军第二军医大学