新型多角度多模式快速切换环状光学照明显微成像系统的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种新型多角度多模式快速切换环状光学照明显微成像系统。本发明包括激光器、单模光纤、准直透镜、扫描振镜、扫描透镜、第一场镜、聚焦镜、二色镜、TIRF显微物镜、样品台、滤波片、第二场镜、探测器；单模光纤、准直透镜、扫描振镜依次位于激光器出射光束的光轴之上,扫描透镜、第一场镜、聚焦镜、二色镜依次位于经扫描振镜射出光束的光轴上；TIRF显微物镜、样品台依次位于二色镜反射光束光轴上，滤波片、第二场镜、探测器依次位于二色镜透射光束光轴上；样品台位于TIRF显微物镜的焦平面处，探测器的采集孔位于第二场镜的焦平面处；本发明在TIRF的基础上实现方便快捷、高分辨率和低噪声的显微实验观察。
【专利说明】新型多角度多模式快速切换环状光学照明显微成像系统
【技术领域】
[0001]本发明属于新型显微方式领域，尤其涉及一种新型多角度多模式快速切换环状光学照明显微成像系统。
【背景技术】
[0002]全内反射突光显微镜(totalinternal reflection fluorescence microscope,TIRFM)，利用光线全反射后在介质另一面产生衰逝波的特性，激发荧光分子以观察荧光标定样品的极薄区域，观测的动态范围通常在200nm以下。因为激发光呈指数衰减的特性，只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射，大大降低了背景光噪声干扰观测标本，能帮助研究者获得高质量的成像质量和可靠的观测数据。故此项技术广泛应用于细胞表面物质的动态观察。在生物应用中的入射光通常是激光和接口的玻璃盖玻片，盖玻片和贴壁细胞的膜之间的水溶液。
[0003]环状TIRF利用一个环状光圈形成TIRF照明成像，它的优势在于减少了干涉条纹，快速的多角度成像减少了 3D成像以及单角度成像产生的色差，并提供了进行图像3D断层重建的可能。
[0004]EPI是垂直式荧光显微成像方式。
[0005]HILO (Highly inclined laminated optical)是在入射角将要进入 TIRF 时产生的，成像时噪声比例非常小，信噪比可以达到EPI的数倍，非常适合观察活细胞的活动，但是与TIRF相比很难测定成像的深度，无法进行定量分析。
[0006]目前市场上的商业全内反射荧光显微镜并不具备能自由切换角度和TIRF环大小的功能，也无法实现便捷的荧光成像模式转换。
【发明内容】
[0007]本发明提的目的是针对现有技术不足，提供一种新型多角度多模式快速切换环状光学照明显微成像系统。
[0008]本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下:
[0009]本发明包括激光器、单模光纤、准直透镜、扫描振镜、扫描透镜、第一场镜、聚焦镜、二色镜、TIRF显微物镜、样品台、滤波片、第二场镜、探测器；
[0010]单模光纤、准直透镜、扫描振镜依次位于激光器出射光束的光轴之上，扫描透镜、第一场镜、聚焦镜、二色镜依次位于经扫描振镜射出光束的光轴上；TIRF显微物镜、样品台依次位于二色镜反射光束光轴上，滤波片、第二场镜、探测器依次位于二色镜透射光束光轴上；所述样品台位于TIRF显微物镜的焦平面处，所述探测器的采集孔位于第二场镜的焦平面处；
[0011]激光器发射的准直激光光束，首先被导入单模光纤，从单模光纤射出的激光光束，经过准直透镜完成准直；经过准直后的光束入射到扫面振镜中进行光路偏折，之后入射到扫描透镜进行聚焦；由扫描透镜射出的光束经过第一场镜扩束之后，平行射出分别经聚焦镜和二色镜的聚焦和反射后，光束聚焦于TIRF显微物镜并投射于样品台上的待测样品之上；待测样品所发射的信号光被TIRF显微物镜收集，先通过二色镜透射后再依次经过滤波片滤去杂散光，其次经第二场镜聚焦，最终被探测器采集，探测器记录此时的探测到的光强信号。
[0012]所述的光束聚焦于TIRF显微物镜并投射于样品台10的待测样品之上时，若入射光束的入射角Θ大于临界角Θ。，则入射激光就会在样品接触面上发生全内反射，临界角Θ。计算公式如下:
[0013]Θ c = Sirf1Oi1Zn3)
[0014]其中，Ii1和n3分别是光疏物质和光密物质的折射系数；
[0015]此时，在待测样品接触表面的另一侧会产生衰逝波，并随着离接触待测样品表面距离Z呈指数衰减；该衰逝场能够激发在表面附近的荧光基团同时也能避免更深处的荧光基团被激发；该无限宽光束的衰逝场强度的测量公式如下:
[0016]I (Z) = I (O) e_z/d(2)
[0017]其中，
[0018]
【权利要求】
1.新型多角度多模式快速切换环状光学照明显微成像系统，其特征在于包括激光器、单模光纤、准直透镜、扫描振镜、扫描透镜、第一场镜、聚焦镜、二色镜、TIRF显微物镜、样品台、滤波片、第二场镜、探测器； 单模光纤、准直透镜、扫描振镜依次位于激光器出射光束的光轴之上，扫描透镜、第一场镜、聚焦镜、二色镜依次位于经扫描振镜射出光束的光轴上；TIRF显微物镜、样品台依次位于二色镜反射光束光轴上，滤波片、第二场镜、探测器依次位于二色镜透射光束光轴上；所述样品台位于TIRF显微物镜的焦平面处，所述探测器的采集孔位于第二场镜的焦平面处； 激光器发射的准直激光光束，首先被导入单模光纤，从单模光纤射出的激光光束，经过准直透镜完成准直；经过准直后的光束入射到扫描振镜中进行光路偏折，之后入射到扫描透镜进行聚焦；由扫描透镜射出的光束经过第一场镜扩束之后，平行射出分别经聚焦镜和二色镜的聚焦和反射后，光束聚焦于TIRF显微物镜并投射于样品台上的待测样品之上；待测样品所发射的信号光被TIRF显微物镜收集，先通过二色镜透射后再依次经过滤波片滤去杂散光，其次经第二场镜聚焦，最终被探测器采集，探测器记录此时的探测到的光强信号。
2.如权利要求1所述的新型多角度多模式快速切换环状光学照明显微成像系统，其特征在于: 所述的光束聚焦于TIRF显微物镜并投射于样品台10的待测样品之上时，若入射光束的入射角Θ大于临界角Θ。，则入射激光就会在样品接触面上发生全内反射，临界角Θ。计算公式如下:
Θ c = sirT1 OVn3) 其中，Ii1和n3分别是光疏物质和光密物质的折射系数； 此时，在待测样品接触表面的另一侧会产生衰逝波，并随着离接触待测样品表面距离Z呈指数衰减；该衰逝场能够激发在表面附近的荧光基团同时也能避免更深处的荧光基团被激发；该无限宽光束的衰逝场强度的测量公式如下:
I (Z) = I (O) e_Vd (2) 其中，
3.如权利要求1所述的新型多角度多模式快速切换环状光学照明显微成像系统，其特征在于: 所述的显微物镜为TIRF型显微物镜，其数值孔径NA = 1.45，探测器为CXD相机，能够进行信号采集。
4.如权利要求1所述的新型多角度多模式快速切换环状光学照明显微成像系统，其特征在于: 所述的用于改变光束偏折方向的扫描振镜能够通过控制器调控其上所加载电压，改变样品表面照明光束入射角的大小，从而实现多角度TIRF ;也能够通过控制器的调控实现环状TIRF照明；在环状TIRF情况下控制器对扫描振镜控制使得入射光环绕一圈时间恰好等于探测器的曝光时间， 从而达到探测与扫描的时间上同步。
【文档编号】G01N21/64GK103940796SQ201410163277
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月22日 优先权日:2014年4月22日
【发明者】许迎科, 南迪, 樊剑南, 孙永红, 刘旭, 匡翠芳 申请人:浙江大学