基于气压检测的多种靶标的高灵敏定量分析方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于气压检测的高灵敏定量分析方法，可用于无机离子、小分子、生物大分子例如蛋白质、DNA、甚至病毒、细菌、细胞等多种靶标的高灵敏度定量检测。本发明利用酶或纳米粒子等催化双氧水生成大量气体，将检测靶标分子的信号转换为气体压强信号，实现信号放大，并最终通过气压计将压强变化转换成电信号进行读取，实现高灵敏定量检测。本发明中，利用气压计以三个不同的检测体系，分别为：DNA水凝胶、功能化DNA传感、ELISA体系，证明了该发明的可行性、广泛适用性、及可靠性。
【专利说明】基于气压检测的多种靶标的高灵敏定量分析方法
【技术领域】
[0001]本发明公开了一种基于气压检测的高灵敏定量分析方法，可用于无机离子、小分子、生物大分子例如蛋白质、DNA、甚至病毒、细菌、细胞等多种靶标的高灵敏度定量。属于医药器械、生物试剂、分析仪器等领域。
【背景技术】
[0002]发展新颖、灵敏、高选择性、廉价、方便的定量检测分析方法一直是科研工作中最为热门的课题。现有的定量检测分析方法通常都依赖于各种大型精密仪器，例如光谱仪、质谱仪、色谱仪、电泳等。在这些定量分析方法经过长时间的发展，已经建立起成熟的检测方法和技术，因而被广泛应用于生物、化学、医学、食品等总多领域的样品检测和分析中，例如各种有机小分子、生物大分子乃至细菌、病毒、细胞等。然而，无论是质谱、色谱、电泳，或是光学分析仪器，要实现高灵敏的定量检测和分析，对仪器的精密程度和对检测部件的灵敏度都有很高的要求，以致使得检测仪器和检测实验的成本一直难以降低。
[0003]以基于光学的定量分析仪器为例，常见的如紫外-可见分光光度计、紫外谱仪、荧光仪等。为了实现高灵敏度的精确定量检测分析，这些仪器不仅需要提供复杂而精密的光路部件，例如光栅、滤镜、透镜组，还需要经过良好培训的操作人员对仪器进行精确的调控。除此之外，为了提高仪器的灵敏度，还需要提供高功率的光源来实现光学信号的富集和增益。同时，基于光学的检测方法对检测体系有极高的要求。一方面，检测体系的成分不能过于复杂，当靶标之外的分子或物质具有与检测靶标分子近似的光学特性时，都会严重影响检测的准确度，因而光学检测体系通常需要复杂的前处理步骤以避免该问题；另一方面，并非所有的分子都具有良好的光学特性，因而通常会使用分子识别技术对分子进行标记和信号放大，例如酶联免疫法，即利用免疫学方法将能够催化生产一定荧光特性或光学吸收特性的产物，来实现对祀标抗原的检测(1、Engvall E, Perlmann P.Enzyme-linkedimmunosorbent assay (ELISA) quantitative assay of immunoglobulin G.1mmunochemistry[J], 1971,8(9):871-874.)。上述问题都使得光学定量检测分析方法的成本都难以进一步降低。因此，如何开发一种廉价可行的但又具有良好灵敏度的定量检测方法日益受到研究人员的关注。
[0004]与此同时，随着科技的发展，以及对科学和生命本质认知的提高，人们已经不再满足于实验室中昂贵而又耗时的实验检测，他们更加迫切的希望科技能与生活中的应用相结合，真正实现“科技改变生活”。例如“即时诊断”的概念日益受到关注(2、R.J.Davies，S.S.E., S.J.Carlisle, Handbook of Biosensors and Biochips, Wiley, Hoboken[M].2008.；3、Liu, H., Xiang, Y., Lu, Y., Crooks, R.M., Aptamer-based origami paperanalytical device for electrochemical detection of adenosine, AngewandteChemie-1nternational Edition[J].2012, 51.6925-8.；4> Liu, J.ff., Oligonucleotide-functionalized hydrogels as stimuli responsive materials and biosensors, SoftMatter [J], 2011, 7.6757-6767.) ? 所谓即时诊断(Point of Care Test, POC Test)，是指在发病或者发生事件的地点进行即时检测和诊断，从而实现迅速的监控和治疗。现代的POC检测方法通常利用免疫分析技术，即特异性抗体会与抗原相结合，来捕捉目标物进行分析。以疾病特异性目标蛋白标记物作为检测目标，实现对疾病的诊断，如妊娠测试试剂盒以妊娠激素人绒毛膜促性腺激素(hCG)为靶标。然而，失去了精密仪器的支持，POC检测的灵敏度势必会受到影响。现有的POC检测一般只能实现定性或半定量检测，以致无法实现对疾病或身体状况的精确诊断。所以尽管POC检测在即时诊断和紧急情况应对上能够提供一定的信息，但却无法为更为快速的临床治疗提供更为准确的依据。建立一种小型化，同时又具有高灵敏度的快速廉价的检测方法迫在眉睫。
[0005]综上所述，在未来的科学研究中，如何发展一种既不影响实验方法高灵敏度、高选择性、高准确性等优点，又能显著降低检测仪器和实验成本，既能实现实验室中高灵敏、高准确性的实验要求，又能具有微型化、便携低能耗等优点，可应用于即时诊断的的定量检测分析方法是亟待解决的问题。
【发明内容】
[0006]本发明针对现有高灵敏定量检测分析方法及其仪器设备价格昂贵、实验方法成本闻等缺点，发展了一种基于气压检测的闻灵敏度、闻选择性、闻准确性同时廉价便携的定量检测分析方法，即可用于实验室中高灵敏度、高选择性的无机离子、小分子、生物大分子例如蛋白质、DNA、甚至病毒、细菌、细胞等多种靶标的高灵敏度定量，又能用于快速的高灵敏度POC定量检测分析。
[0007]本发明的技术方案如下:
[0008]一种基于气压检测靶标的高灵敏、通用的定量检测方法，其特征在于，在密闭体系中，利用分子识别引入信号放大分子如酶或纳米粒子，通过信号放大分子或粒子催化底物释放出大量气体分子，导致体系气压增强。利用体系的压强变化实现靶标浓度的高灵敏定量检测。
[0009]其中，所述的分子识别技术为，利用如抗体、核酸适配体、核酸探针等具有特异性识别功能的分子对靶标进行识别或标记，并通过将这些识别分子将信号放大分子或粒子引入检测体系中。
[0010]其中，利用分子识别技术对靶标进行识别或标记，靶标包括但不局限于蛋白、核酸、肽链、糖类、脂类、有机小分子、无机离子、细胞、细菌、病毒。
[0011]其中，信号放大分子包括过氧化氢酶、金纳米粒子、钼纳米粒子、金钼纳米粒子、锰氧化物纳米粒子或其他可以催化底物产生气体的催化剂或酶，其催化底物为受催化后可产生大量气体分子的物质(如H2O2)，气体分子为底物受催化后的产物(如O2)。
[0012]其中，在密闭体系中，其反应检测体系包括酶联免疫吸附法体系、DNA水凝胶体系、功能化DNA传感体系中的至少一种。
[0013]在酶联免疫吸附法体系中，基于气压检测靶标的定量分析方法优选包括如下步骤:(1)根据要检测的抗原选择相对应的捕获抗体及检测抗体；(2)对信号放大分子进行修饰，使其与检测抗体分子偶联结合，或使其能够特异性的与检测抗体结合；(3)在多孔板(例如96孔板)或磁珠或微球等能够用于酶联免疫吸附法的固相表面进行包被，加入捕获抗体使其结合于包被后的固相表面，之后进行封闭液封闭，加入待检测抗原，再加入检测抗体，形成双抗夹心结构，洗去多余检测抗体；(4)引入信号放大分子；(5)在多孔板中加入底物，密封反应腔体，信号放大分子催化底物分子，生成大量气体分子，产生可由气压计读取的压强变化信号；(6)根据气压计显示的压强变化数值，实现靶标分子的高灵敏定量检测。
[0014]其中，可以利用多孔板表面为捕获抗体吸附的固相表面，用于靶标分子的捕获；也可以使用磁珠或微球作为捕获抗体吸附的固相表面，通过磁场或离心等方法来实现靶标分子的捕获。
[0015]其中，引入信号放大分子或纳米粒子的方法可以直接通过对检测抗体进行偶联标记，也可以通过将特异性识别检测抗体的分子修饰于信号放大分子或纳米粒子，在检测抗体与靶标分子结合后，再将信号放大分子或纳米粒子与检测抗体结合，使得信号放大分子或纳米粒子具有更好的通用性和适用性。
[0016]在DNA水凝胶体系中，基于气压检测的多种靶标的即时可视化定量分析方法优选包括如下步骤:(I)将两条丙烯酰胺/DNA高聚链、一条核酸适体分子与酶分子或纳米粒子混合，制备核酸适体交联水凝胶；(2)将含有不同已知浓度分析物的溶液加入上述水凝胶中，30°C条件下反应I小时，释放出酶或纳米粒子；(3)反应结束后，取反应上清液，置于反应试管中，使酶或纳米粒子与底物发生催化反应；密闭体系中，产生的大量气体使体系内的压强升高，利用气压计进行读数，并记录数据，进而可建立标准曲线，从而检测未知样品中革巴标含量。
[0017]其中，利用两条丙烯酰胺/DNA高聚链，一条两端能够分别与两条高聚链上DNA序列互补配对的核酸适配体形成DNA水凝胶。
[0018]其中，将酶分子或纳米离子包裹在形成的DNA水凝胶中DNA三链结构形成的腔体中，利用分子之间的位阻限制酶分子或纳米离子使其不能够自由扩散。靶标分子存在时，核酸适配体发生构象变化，导致DNA水凝胶瓦解，释放出其中的酶分子或纳米粒子。
[0019]在功能化DNA传感体系中，基于气压检测的多种靶标的即时可视化定量分析方法优选包括如下步骤:(I)针对靶标分子选择合适的核酸适配体，在核酸适配体一段添加上与捕获探针互补的序列；(2)根据核酸适配体的序列设计合适的检测探针序列，使得无靶标分子存在时检测探针能够通过碱基之间的相互作用结合于核酸适配体链上，当靶标分子存在时，能够竞争下检测探针；(3)利用生物或化学的偶联方法，例如脱羧反应或生物素-亲和素相互作用将捕获探针连接在磁珠表面，加入检测DNA以及核酸适体，使其在磁珠表面形成功能化DNA三明治杂交结构；(4)在DNA三明治杂交体系中加入靶标，靶标与核酸适体结合，置换出三链结构上的检测探针；(5)利用磁铁将磁珠富集，并取上清加入反应试管中，同时加入溶液相底物，信号放大分子作用于溶液相底物，产生可由气压计读取的信号分子。(6)根据气压计显示示数，记录检测结果。
[0020]其中，检测探针上偶联有能够催化底物产生大量气体的信号放大分子，例如酶或纳米粒子。
[0021]其中，利用核酸适配体与靶标分子的结合，使得靶标分子存在时能够竞争下偶联有信号放大分子(酶或纳米粒子)的检测探针，并实现后续的信号放大。
[0022]其中，步骤(3)中使用的磁珠可以替换为微球或多孔板，相对应的去除未被替代的检测探针的方法可以使用离心(微球)或直接吸取上清(多孔板)。
[0023]其中，使用的检测探针通过化学或生物的偶联方法与信号放大分子(酶或纳米粒子)偶联，通过检测探针的特异性引入酶或纳米粒子。
[0024]本发明的优点在于:首先，该方法在设计上符合ASSURED (Martinez A.，Phillips
S., Whitesides G., et.al., Diagnostics for the Developing World:MicrofluidicPaper-Based Analytical Devices, Analytical Chemistry [J].2010, 82.3-10.)的国际标准，同时它灵敏度高、选择性好，检测结果可靠的；其次，AuiPtNPs具有可长时间催化，易保存等特点。通过延长AuOPtNPs与H2O2的反应时间，即可实现超低靶标的检测，将产生O2的体积量转化为压强，最终我们建立起了靶标浓度和气压计示数的定量关系；另外，由于SELEX技术的飞速发展，现在已经有很多可用的核酸适体，此外还可以通过SELEX筛选得到更广泛的靶标的核酸适体，在水凝胶以及功能化DNA传感体系中，而我们只需简单的将特异性的核酸适体序列替换掉就能够将我们的发展方法用于更多其它靶标的快速、定量分析。此外，在ELISA体系中，由于传统的ELISA，需利用其标记的HRP酶或其他酶的显色反应，进而对抗体或抗原实现定量检测，需依赖大型仪器，意味着其必须在实验室或在医院中使用，无法实现即时诊断，在此发明中，只需使用简易的气压计即可实现定量检测，且只需简单的将抗体抗原更换，便可实现不同抗原的检测。鉴于成本低廉，检测快速，用户友好以及气压计的广泛可用性，我们提出的基于气压检测的可视化定量分析方法有可能发展成为公众用于广泛的靶标定量检测工具。
[0025]本发明方法检测灵敏度高，且具有操作简单、价格低廉、反应快速、不需要对样品进行复杂前处理等优点，且通用性好，可用于复杂体系，包括生物小分子、重金属离子、蛋白质等各种物质的快速 、闻灵敏定量检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为在25°C条件下，不同浓度Pt纳米粒子在5min时间内的催化效率。
[0027]图2为在25°C条件下，不同浓度Pt纳米粒子在Ihr时间内的催化效率。
[0028]图3为在25°C条件下，ELISA体系中，常规ELISA蛋白体系可行性验证。
[0029]图4为在25°C条件下，ELISA体系中，使用纳米粒子，对不同浓度靶标蛋白，H5N1禽流感病毒HA蛋白进行检测。
[0030]图5为在25°C条件下，DNA水凝胶体系中，用于不同浓度的可卡因(cocaine)检测，反应时间为5min。
[0031]图6为在25°C条件下，DNA水凝胶体系中，用于不同浓度的腺苷(Adenosine)检测，反应时间为5min。
[0032]图7为在25°C条件下，DNA水凝胶体系中，以可卡因代谢产物苯甲酰芽子碱和芽子碱甲酯为负对照，考察该体系的选择性，图为对于250 μ M可卡因和2.5mM苯甲酰芽子碱和芽子碱甲酯的响应，反应时间为5min。
[0033]图8为在25°C条件下，功能化DNA传感体系中，考察纳米粒子上不同DNA修饰条数对气压计灵敏度的影响实验，以腺苷体系为例，反应时间为1.5hr。
[0034]图9为在25?条件下,功能化DNA传感体系中，用于不同浓度的腺苷(Adenosine)检测，反应时间为1.5hr。
【具体实施方式】[0035]实施例1丙烯酸亚磷酰胺单体的合成
[0036]丙烯酸亚磷酰胺单体的合成分为三个步骤:1)将6-氨基-1-己醇(lg，
8.53mmol),三乙胺(2.36mL, 17mmol)加入IOOmL 二氯甲烧中冰浴，在无水无氧条件下逐滴加入甲基丙烯酰氯(2.67g，2.55mmol)，之后整个体系在室温条件下搅拌反应2小时。2)将溶剂旋干，向产物中加入IOmL乙醇和15% NaOH(4mL)将产物选择性水解成 N-(6-hydroxyhexyl)methacrylamide ο 将 N- (6-hydroxyhexyI)methacrylamide 用乙酸乙酯在娃胶柱分离之后进行下一步反应。3)将纯化后的N- (6-hydroxyhexyl)methacrylamide (0.50g, 2.70mmol)溶于IOmL无水二氯甲烧中，在0°C条件下逐滴加入N, N- 二异丙基乙胺(DIPEA，0.98g，7.5mmol)，再逐滴加入2-氰乙基N，N- 二异丙基氯代亚磷酰胺(0.87mL，3.25mmol)，在室温反应2小时。将溶剂旋干后，将产物用乙酸乙酯:石油醚:三乙胺40:60:3的洗脱液在硅胶柱上洗脱。得到的终产物为无色油状液体。终产物的核磁表征数据如下=1H NMR(CDCl3): δ 5.92 (br, 1H), 5.63 (m, 1H), 5.27 (m.1H), 3.86-3.72 (m，2H)，3.66-3.49 (m, 4H)，3.30-3.23 (m, 2H), 2.61 (t, 2H)，1.92 (m, 3H)，1.58-1.50 (m, 4H) 1.37-1.32 (m, 4H) 1.17-1.13 (m, 12H).13C NMR (CDCl3): δ 168.6，140.4，119.3，118.0, 63.8，63.6，58.6，58.3，43.2，43.1, 39.8，31.3，29.7，26.8，25.8，24.9，24.8，24.7，19.0.31P(CDC13):δ 148.[0037]实施例2甲基丙烯基团、biotin基团及巯基基团修饰的核酸分子的合成与纯化
[0038]以普通CPG作为固相载体，以DNA单体碱基为原料，在DNA合成仪上由3'端向5'端合成链A、链B、linker核酸适体、检测DNA，ELISA DNA,最后链A和B的Y端修饰(在合成仪上修饰)上实施例1中合成的丙烯酸亚磷酰胺单体，检测DNA上修饰巯基，具体合成的序列见表1，表2，表3。以biotin修饰的CPG作为固相载体，以DNA单体碱基为原料，在DNA合成仪上由3'端向5'端合成在捕获DNA，具体合成的序列见表2。合成结束后，将上述CPG转移至2mL洁净灭菌的Eppendorf管中，加入0.5mL甲胺:氨水=1:1的溶液,在65°C下氨解30min，使DNA从CPG上切割下来。氨解完毕后提取上清,并用少量超纯水清洗CPG,合并上清。向体系中加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇和0.1倍体积的3mol/L NaCl，于_2(TC冰箱进行酒精沉淀30min。酒精沉淀完毕后,在14，OOOrpm的转速下离心IOmin,弃上清。将得到的粗产物溶解在PH8的0.lmol/L的醋酸三乙胺(TEAA)中，使用反相高效液相色谱仪进行纯化。将通过反相-HPLC纯化后的产品进行真空干燥。除巯基修饰DNA外，其余DNA溶于80%乙酸中脱DMT，反应30min后，抽干再用超纯水后溶解，使用凝胶过滤柱进行脱盐处理。使用紫外-可见分光光度计测定260nm处核酸的吸光度，根据DNA的消光系数计算出其相应的物质的量和浓度值。定量后真空浓缩。巯基修饰DNA在HPLC纯化后，加入pH6.5的0.1M TEAA溶解DNA，测A260，将其稀释至A260 = 100，记录总体积为V ;之后加入0.15V的IM AgN03,混匀，室温反应30min ;再加入0.20V的IM DTT ( 二硫苏糖醇)，混匀，室温反应5min ;离心，取上清(DTT络合物)，沉淀用1V0.1M TEAA洗涤，合并洗涤液；使用凝胶过滤柱进行脱盐处理。使用紫外-可见分光光度计测定260nm处核酸的吸光度，根据DNA的消光系数计算出其相应的物质的量和浓度值。定量后真空浓缩。
[0039]表I实施例2中所用DNA序列
[0040]
【权利要求】
1.一种基于气压检测靶标的高灵敏、通用的定量检测方法，其特征在于，在密闭体系中，利用分子识别引入信号放大分子或粒子，通过信号放大分子或粒子催化底物释放出气体分子，导致该密闭体系气压增强，利用体系的压强变化检测实现靶标浓度的高灵敏定量检测。
2.如权利要求1所述的一种基于气压检测靶标的高灵敏、通用的定量检测方法，其特征在于:所述的分子识别包括，利用具有特异性识别功能的分子对靶标进行识别或标记，并通过将这些识别分子将信号放大分子或粒子引入检测体系中。
3.如权利要求1所述的一种基于气压检测靶标的高灵敏、通用的定量检测方法，其特征在于:利用分子识别技术对靶标进行识别或标记，靶标包括蛋白、核酸、肽链、糖类、脂类、有机小分子、无机离子、细胞、细菌或病毒中的至少一种。
4.如权利要求1所述的一种基于气压检测靶标的高灵敏、通用的定量检测方法，其特征在于:信号放大分子包括可以催化底物产生气体的催化剂或酶，其催化底物为受催化后可产生大量气体分子的物质，气体分子为底物受催化后的产物。
5.如权利要求1所述的一种基于气压检测靶标的高灵敏、通用的定量检测方法，其特征在于:在密闭体系中，其反应检测体系包括酶联免疫吸附法体系、DNA水凝胶体系、功能化DNA传感体系中的至少一种。
6.如权利要求5所述的一种基于气压检测靶标的高灵敏、通用的定量检测方法，其特征在于:酶联免疫吸附法体系中，基于气压检测靶标的定量分析方法包括如下步骤:(I)根据要检测的抗原选择相对应的捕获抗体及检测抗体；(2)对信号放大分子进行修饰，使其与检测抗体分子偶联结合，或使其能够特异性的与检测抗体结合；(3)在多孔板或磁珠或微球等能够用于酶联免疫吸附法的固相表面进行包被，加入捕获抗体使其结合于包被后的固相表面，之后进行封闭液封闭，加入待检测抗原，再加入检测抗体，形成双抗夹心结构，洗去多余检测抗体；(4)引入信号放大分子；(5)在多孔板中加入底物，密封反应腔体，信号放大分子催化底物分子，生成大量气体分子，产生可由气压计读取的压强变化信号；(6)根据气压计显示的压强变化数值，实现靶标分子的高灵敏定量检测。
7.如权利要求5所述的一种基于气压检测靶标的高灵敏、通用的定量检测方法，其特征在于:DNA水凝胶体系中，基于气压检测的多种靶标的即时可视化定量分析方法包括如下步骤:(I)将两条丙烯酰胺/DNA高聚链、一条核酸适体分子与酶分子或纳米粒子混合，制备核酸适体交联水凝胶；(2)将含有不同已知浓度分析物的溶液加入上述水凝胶中，30°C条件下反应I小时，释放出酶或纳米粒子；(3)反应结束后，取反应上清液，置于反应试管中，使酶或纳米粒子与底物发生催化反应；密闭体系中，产生的大量气体使体系内的压强升高，利用气压计进行读数，并记录数据，进而可建立标准曲线，从而检测未知样品中靶标含量。
8.如权利要求1所述的一种基于气压检测靶标的高灵敏、通用的定量检测方法，其特征在于:功能化DNA传感体系中，基于气压检测的多种靶标的即时可视化定量分析方法包括如下步骤:(I)针对靶标分子选择合适的核酸适配体，在核酸适配体一段添加上与捕获探针互补的序列；(2)根据核酸适配体的序列设计合适的检测探针序列，使得无靶标分子存在时检测探针能够通过碱基之间的相互作用结合于核酸适配体链上，当靶标分子存在时，能够竞争下检测探针；(3)利用生物或化学的偶联方法，例如脱羧反应或生物素-亲和素相互作用将捕获探针连接在磁珠表面，加入检测DNA以及核酸适体，使其在磁珠表面形成功能化DNA三明治杂交结构；(4)在DNA三明治杂交体系中加入靶标，靶标与核酸适体结合，置换出三链结构上的检测探针；(5)利用磁铁将磁珠富集，并取上清加入反应试管中，同时加入溶液相底物，信号放大分子作用于溶液相底物，产生可由气压计读取的信号分子。(6)根据气压计显示示数，记录检测结果。
9.如权利要求8所述的一种基于气压检测靶标的高灵敏、通用的定量检测方法，其特征在于:检测探针上偶联有能够催化底物产生大量气体的信号放大分子。
10.如权利要求8所述的一种基于气压检测靶标的高灵敏、通用的定量检测方法，其特征在于:利用核酸适配体与靶标分子的结合，使得靶标分子存在时能够竞争下偶联有信号放大分子的检测探针， 并实现后续的信号放大。
【文档编号】G01N7/18GK103994946SQ201410252334
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年6月9日 优先权日:2014年6月9日
【发明者】杨朝勇, 官志超, 郏莎莎, 朱志, 刘丹, 张明霞, 林水潮, 李久兴, 庄峙厦 申请人:厦门大学