一种植物病毒纸质检测传感器的制备方法及检测方法
【专利摘要】一种植物病毒纸质检测传感器的制备方法及检测方法，属于病毒检测【技术领域】。本发明利用纳米功能材料羧基修饰短臂碳纳米管，通过Dip-Dry技术对实验滤纸进行包裹，并在包裹过程中在包裹液中加入西瓜花叶病毒二号（WMV-2）的高特异性抗体，从而制备出能够特异性检测西瓜花叶病毒二号的纸质检测传感器。检测灵敏度为0.1nmol/L，与传统的检测方法相比具有相当的检测灵敏度，整个过程不超过30min，检测时间大大缩短，显著的提高了检测效率。在检测过程中，只需要更换纸质检测传感器包裹液中抗体种类，即可以得到对应植物病毒的纸质检测传感器。
【专利说明】一种植物病毒纸质检测传感器的制备方法及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种通用型植物病毒纸质检测传感器的制备方法及检测方法，属于病毒检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]西瓜花叶病毒(Water melon mosaic virus-2, WMV-2)为马铃暮Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)重要成员，主要通过多种姆虫以非持久性方式进行传播。Webb和Scott根据寄主范围的差异血清学关系及交互保护作用的有无把WMV分为WMV-1和WMV-2两株系，后来Purcifull根据病毒在寄主上的反应及血清学关系认为WMV-1 是番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus, PRSV)的西瓜株系(PRSV-W), WMV-2株系即是现在的WMV。
[0003]自然条件下，西瓜花叶病毒可侵染葫芦科藜科豆科等27科170多种植物，主要引起花叶叶片畸形等症状，世界很多国家都已报道了西瓜花叶病毒对葫芦科作物不同程度的危害，很多国家的葫芦科作物都受到了 WMV不同程度的危害。
[0004]目前，植物病毒的检测方法主要采用分子生物学和血清学检测。分子生物学检测技术灵敏度高，但存在RNA抽提繁琐且易降解的问题。血清学检测由于其操作简单且能同时处理大量样品而被广泛采用，但需要购买价格昂贵的血清学检测试剂盒，并且检测结果的准确性取决于抗体的质量。
[0005]在这种情况下，建立一种快速灵敏特异性好的WMV检测方法尤为重要。电化学工作站是电化学测量系统的简称，是电化学研究和教学常用的测量设备，可直接用于超微电极上的稳态电流测量。纳米材料是一种新型的具有特定功能的材料，碳纳米管自1991年被日本科学家Ijima发现以来，由于其特有的结构特点及导电性能，一直受到人们的高度重视，基于碳纳米管的传感器的研制也层出不穷。
[0006]本发明以碳纳米管及实验滤纸为材料，利用碳纳米管对滤纸进行Dip-Dry包裹，在包裹液中加入植物病毒WMV-2的抗体，制备可以响应植物病毒蛋白的高速灵敏传感器。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是制备一种能够快速、高灵敏地检测植物病毒的经济推广型传感器。
[0008]本发明的目的之二是建立基于制备的植物病毒传感器的快速、高灵敏检测方法及技术指标。
[0009]本发明的目的之三是在发明目的一、二的基础上，建立的通用型植物病毒传感器的制备及检测技术。
[0010]本发明的技术方案:
一种植物病毒纸质检测传感器的制备方法，其制备步骤为:
(I)碳纳米管-苯乙烯磺酸钠PSS溶液的制备:将PSS分散于水溶液中得到质量浓度为12.5%的PSS水溶液，再将水溶性的羧基修饰的短臂碳纳米管分散于PSS水溶液中，使碳纳米管终浓度为30mg/mL，超声仪中100W、40KHz功率超声处理6h使得碳纳米管在PSS水溶液中充分分散；
(2)抗体-碳纳米管PSS溶液的制备:步骤(I)制备的碳纳米管-PSS水溶液分散均匀后冷却至室温，加入植物病毒抗体溶液，得到抗体终浓度为15 μ g/mL的抗体-碳纳米管PSS溶液；
(3)传感器的制备:将固定长宽度的滤纸浸没到步骤(2)制备的抗体-碳纳米管PSS溶液中，浸泡IOmin后取出，冷冻干燥后再次浸没到抗体-碳纳米管PSS溶液中IOmin后取出，冷冻干燥；其反复循环操作13个循环，4°C密封保存，即制得植物病毒纸质检测传感器。
[0011]所述植物病毒抗体为西瓜花叶病毒二号WMV-2抗体、即制得西瓜花叶病毒纸质检测传感器；更换西瓜花叶病毒二号WMV-2抗体为建兰花叶病毒抗体或齿舌兰环斑病毒抗体，即制得建兰花叶病毒或齿舌兰环斑病毒纸质检测传感器。
[0012]所述植物病毒纸质检测传感器的检测方法，步骤为:以植物病毒纸质检测传感器为工作电极，以通用型植物病毒配置系列标准浓度的溶液，建立检测通用性植物病毒的电流-植物病毒浓度标准曲线；检测样品上清提取液的稳定电流值，与所建立的电流-植物病毒浓度标准曲线对照，确定检测样品液中的通用型毒素含量。
[0013]当所述病毒为西瓜花叶病毒时，具体步骤如下:
(1)受西瓜花叶病毒侵染的植物叶片标本，加入2倍体积0.2mol/L、pH7.4、含质量浓度为1%巯基乙醇的磷酸钠缓冲溶液，匀浆，过滤，滤液10000r/min离心5min，上清提取液备用；
(2)所制得的西瓜花叶病毒纸质检测传感器为工作电极，Pt电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在电化学工作站控制下，记录随着时间流经工作电极的电流，即1-t曲线；体系为PH7.9 Tris-HCl缓冲溶液，30°C下进行检测；
(3)分别向缓冲溶液体系中加入WMV-2标准品溶液直至体系中WMV-2病毒终浓度分另Ij 为 0.25nmol/L, 0.5nmol/L, lnmol/L, 2nmol/L, 4nmol/L, 8nmol/L, 12nmol/L, 16nmol/L,20nmol/L, 40nmol/L, 80nmol/L, 160nmol/L,分别记录每次检测的 i_t 曲线；
(4)以每次记录的1-t曲线的稳定电流值为纵坐标，以所记录的电流值所对应的WMV-2浓度为横坐标，建立电流-WMV-2浓度标准曲线；
(5)在相同条件下，检测样品上清提取液的稳定电流值，与所建立的电流-WMV-2浓度标准曲线对照，确定检测样品上清提取液中的WMV-2含量。
[0014]通过对植物病毒传感器制备过程中使用抗体的种类的改变，建立通用型的植物病毒纸质检测传感器及检测方法。
[0015]一种通用型植物病毒纸质检测传感器的制备方法，更换植物病毒纸质检测传感器制备方法的步骤(2)中使用的抗体的种类，改用建兰花叶病毒抗体或齿舌兰环斑病毒抗体，用西瓜花叶病毒纸质检测传感器的制备方法相同的条件，制备针对对应植物病毒检测用的通用型植物病毒纸质检测传感器。
[0016]所制备的通用型植物病毒纸质检测传感器的检测方法，以所制备的通用型植物病毒纸质检测传感器为工作电极；以通用型植物病毒更换WMV-2系列溶液；用西瓜花叶病毒纸质检测传感器的检测方法相同的条件，建立检测通用性植物病毒的电流-植物病毒浓度标准曲线；检测样品上清提取液的稳定电流值，与所建立的电流-植物病毒浓度标准曲线对照，确定检测样品液中的通用型毒素含量；
所述通用型植物病毒分别为建兰花叶病毒或齿舌兰环斑病毒。
[0017]本发明的有益效果:本发明提供一种通用型植物病毒快速、方便、高灵敏纸质传感器的制备及使用方法，从而应用于植物病毒的快速灵敏检测。本发明检测灵敏度为
0.lnmol/L，与传统的检测方法相比具有相当的检测灵敏度，但整个过程不超过30min，检测时间大大缩短，显著的提高了检测效率。在检测过程中，只需要更换纸质检测传感器包裹液中抗体种类，即可以得到对应植物病毒的纸质检测传感器。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1制得的西瓜花叶病毒WMV-2纸质检测传感器的照片。0、3、8、13表示滤纸浸入到抗体-碳纳米管PSS溶液中浸泡、冷冻干燥的循环操作次数。
[0019]图2基于不同包裹次数的纸质传感器的稳定电流值。包裹次数从上至下分别为13、10、8、3.图3基于制备的WMV-2传感器的检测结果的电流-WMV-2浓度标准曲线。
【具体实施方式】
[0020]以下通过实施例来对本发明予以进一步的说明，下列实施例仅用于举例说明，本
【发明内容】
并不局限于此。
[0021]实施例1制备西瓜花叶病毒纸质检测传感器
(1)碳纳米管-PSS溶液的制备:将PSS分散与水溶液中得到质量浓度为12.5%的PSS水溶液，再将水溶性的羧基修饰短臂碳纳米管分散于PSS水溶液中，使碳纳米管终浓度为30mg/mL，超声仪中100W、40KHz功率超声处理6h使得碳纳米管在PSS水溶液中充分分散；
(2)抗体-碳纳米管PSS溶液的制备:步骤(I)制备的碳纳米管PSS水溶液分散均匀后冷却至室温，加入一定浓度的WMV-2抗体溶液，得到抗体终浓度为15 μ g/mL的抗体-碳纳米管PSS溶液；
(3)传感器的制备:将固定长宽度6X0.6cm的滤纸浸没到步骤(2)制备的抗体-碳纳米管PSS溶液中，IOmin后取出，冷冻干燥，再次浸没到抗体_碳纳米管PSS溶液中IOmin后取出，冷冻干燥，反复循环操作13个循环，4°C低温密封保存，即制得西瓜花叶病毒纸质检测传感器。
[0022]实施例2植物病毒的快速高灵敏检测方法
1、受西瓜花叶病毒侵染的植物叶片标本，加入2倍体积0.2mol/L磷酸钠缓冲溶液(pH7.4，含1%巯基乙醇)，匀浆，过滤，滤液10000r/min离心5min，上清提取液备用；
2、以所制得的西瓜花叶病毒纸质检测传感器为工作电极，Pt电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在电化学工作站控制下，记录随着时间流经工作电极的电流，即1-t曲线.3、优化体系缓冲溶液及温度，使在体系为pH7.9 Tris-HCl缓冲溶液，30°C下进行检测时响应信号最强；
4、分别向缓冲溶液体系中加入WMV-2蛋白溶液直至体系中WMV-2蛋白终浓度分别为Onmol/L,0.25nmol/L,0.5nmol/L,lnmol/L,2nmol/L,4nmol/L,8nmol/L,12nmol/L,16nmol/L, 20nmol/L, 40nmol/L, 80nmol/L, 160nmol/L,分别记录每次检测的 i_t 曲线；
5、以每次记录的1-t曲线的稳定电流值为纵坐标，以所记录的电流值所对应的WMV-2浓度为横坐标，建立检测WMV-2的电流-WMV-2浓度标准曲线；
6、相同条件下检测样品上清提取液，确定检测样品上清提取液中的WMV-2蛋白的含量。
[0023]实施例3
更换实施例1的步骤2中使用的抗体的种类(建兰花叶病毒抗体或齿舌兰环斑病毒抗体)，制备针对不同植物病毒检测用的纸质检测传感器，建立通用型传感器的制备技术。
[0024]优化通用型传感器的检测条件，建立通用型传感器的检测方法及技术标准。
[0025]以所制备的通用型植物病毒纸质检测传感器的检测方法，以所制备的通用型植物病毒纸质检测传感器为工作电极；以通用型植物病毒更换WMV-2系列溶液；用西瓜花叶病毒纸质检测传感器的检测方法相同的条件，建立检测通用性植物病毒的电流-植物病毒浓度标准曲线；检测样品上清提取液的稳定电流值，与所建立的电流-植物病毒浓度标准曲线对照，确定检测样品上清提取液中的植物病毒含量。
【权利要求】
1.一种植物病毒纸质检测传感器的制备方法，其特征在于步骤为: (1)碳纳米管-苯乙烯磺酸钠PSS溶液的制备:将PSS分散于水溶液中得到质量浓度为12.5%的PSS水溶液，再将水溶性的羧基修饰的短臂碳纳米管分散于PSS水溶液中，使碳纳米管终浓度为30mg/mL，超声仪中100W、40KHz功率超声处理6h使得碳纳米管在PSS水溶液中充分分散； (2)抗体-碳纳米管PSS溶液的制备:步骤(I)制备的碳纳米管-PSS水溶液分散均匀后冷却至室温，加入植物病毒抗体溶液，得到抗体终浓度为15 μ g/mL的抗体-碳纳米管PSS溶液； (3)传感器的制备:将固定长宽度的滤纸浸没到步骤(2)制备的抗体-碳纳米管PSS溶液中，浸泡IOmin后取出，冷冻干燥后再次浸没到抗体-碳纳米管PSS溶液中IOmin后取出，冷冻干燥；其反复循环操作13个循环，4°C密封保存，即制得植物病毒纸质检测传感器。
2.根据权利要求1所述植物病毒纸质检测传感器的制备方法，其特征在于:所述植物病毒抗体为西瓜花叶病毒二号WMV-2抗体，即制得西瓜花叶病毒纸质检测传感器；更换西瓜花叶病毒二号WMV-2抗体为建兰花叶病毒抗体或齿舌兰环斑病毒抗体，即制得建兰花叶病毒或齿舌兰环斑病毒纸质检测传感器。
3.权利要求1所述方法制备的植物病毒纸质检测传感器的检测方法，其特征在于步骤为:以植物病毒纸质检测传感器为工作电极，以通用型植物病毒配置系列标准浓度的溶液，建立检测通用性植物病毒的电流-植物病毒浓度标准曲线；检测样品上清提取液的稳定电流值，与所建立的电流-植物病毒浓度标准曲线对照，确定检测样品液中的通用型毒素含量。
4.根据权利要求3所述植物病毒纸质检测传感器的检测方法，其特征在于所述病毒为西瓜花叶病毒时，具体步骤如下: (1)受西瓜花叶病毒侵染的植物叶片标本，加入2倍体积0.2mol/L、pH7.4、含质量浓度为1%巯基乙醇的磷酸钠缓冲溶液，匀浆，过滤，滤液10000r/min离心5min，上清提取液备用； (2)所制得的西瓜花叶病毒纸质检测传感器为工作电极，Pt电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在电化学工作站控制下，记录随着时间流经工作电极的电流，即1-t曲线；体系为PH7.9 Tris-HCl缓冲溶液，30°C下进行检测； (3)分别向缓冲溶液体系中加入WMV-2标准品溶液直至体系中WMV-2病毒终浓度分另Ij 为 0.25nmol/L, 0.5nmol/L, lnmol/L, 2nmol/L, 4nmol/L, 8nmol/L, 12nmol/L, 16nmol/L,20nmol/L, 40nmol/L, 80nmol/L, 160nmol/L,分别记录每次检测的 i_t 曲线； (4)以每次记录的1-t曲线的稳定电流值为纵坐标，以所记录的电流值所对应的WMV-2浓度为横坐标，建立电流-WMV-2浓度标准曲线； (5)在相同条件下，检测样品上清提取液的稳定电流值，与所建立的电流-WMV-2浓度标准曲线对照，确定检测样品上清提取液中的WMV-2含量。
5.根据权利要求3所述植物病毒纸质检测传感器的检测方法，其特征在于:所述植物病毒分别为西瓜花叶病毒、建兰花叶病毒或齿舌兰环斑病毒。
【文档编号】G01N27/26GK103995031SQ201410255539
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年6月10日 优先权日:2014年6月10日
【发明者】马伟, 胥传来, 孔德昭, 匡华, 徐丽广, 刘丽强, 宋珊珊, 吴晓玲 申请人:江南大学