一种检测β-hCG含量的时间分辨免疫荧光试剂盒及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测β-hCG含量的时间分辨免疫荧光试剂盒，包括盒体和盒体上方的盒盖，所述盒体内设有放置包被抗β-hCG单克隆抗体的酶标板的隔层；所述盒体内设有放置试剂瓶的容器孔，所述容器孔内放置有：装有分析液的试剂瓶；装有清洗液的试剂瓶；装有增强液的试剂瓶；装有β-hCG校准品的试剂瓶；装有标记的抗α-TSH单克隆抗体的试剂瓶。此外，本发明还公开了该试剂盒的制备方法及其在检测β-hCG含量中的应用。本发明试剂盒的灵敏度高、检测范围广、稳定性好。本发明可利用全自动时间分辨荧光免疫分析仪进行全自动操作，操作简单省时，灵敏度高，可达到0.01mIU/ml；准确性好、且无辐射污染。
【专利说明】—种检测β -hCG含量的时间分辨免疫荧光试剂盒及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及体外免疫诊断试剂领域，尤其涉及一种检测尿液中β-hCG的时间分辨免疫荧光试剂盒及其制备方法和应用，实现对尿液中β -hCG含量的定量检测。
【背景技术】
[0002]人绒毛膜促性腺激素(hCG)，是由胎盘绒毛膜的合体滋养层产生的一种糖蛋白，β亚单位是特异性抗原，其结构与其它垂体前叶激素不同。
[0003]质量是一家生产型企业的立足之本。许多做hCG测试笔的体外诊断公司，需要利用含一定浓度β -hCG标准品进行测试笔功能性检测，从而确认此批测试笔是否达到标准，能否出售，这是一个关键质量控制点。标准品若不合格，有可能对测试笔的性能进行误判，对企业产生不利的影响。因此有必要发展一种灵敏度高、检测范围广、稳定性好的定量检测试剂盒，用于监测含一定浓度的β -hCG标准品的性能。
[0004]目前市售的试剂盒大多以酶联免疫为主，以血清为标本进行定量检测β-hCG含量，灵敏度一般，检测范围偏窄，取样操作复杂、不方便。尿液中β-hCG含量的测定已经是体外快速检测产品的一项重要指标，通过尿液中β-hCG含量的多少，可直接判断出是否怀孕以及怀孕的周数，取样简单、便捷。作为早早孕体外快速检测产品的质控标准品，也是用尿液来配制或者标定的；容易引起疏忽的是:不管是正常男性或妇女的尿液中，本身就存在一定含量(极低水平)的β-hCG抗原。因此定量测定尿液中β-hCG的含量，可为标准品的准确性提供一种定量的保证，也可辅助早期判断妊娠、流产、宫外孕等。
[0005]时间分辨免疫突光分析法(Time-resolvedfluoroimmunoassay, TRFIA),是利用具有独特荧光特性的镧系元素作为标记示踪物，代替酶、同位素等，成为发光免疫分析中的一种重要方法，具有灵敏度高、示踪物稳定、不受样品自然荧光干扰、无放射性污染等许多优点。
[0006]目前，对于采用时间分辨免疫荧光分析法检测尿液中β-hCG含量尚未见报道。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的技术问题之一是提供一种检测尿液中β -hCG含量的时间分辨免疫荧光试剂盒，其灵敏度高、检测范围广、稳定性好，取样方便，快速。
[0008]本发明要解决的技术问题之二是提供该试剂盒的制备方法。
[0009]本发明要解决的技术问题之三是提供该试剂盒在检测β -hCG含量中的应用。
[0010]为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案:
[0011]在本发明的一方面，提供一种检测β-hCG含量的时间分辨免疫荧光试剂盒，包括盒体和盒体上方的盒盖，所述盒体内设有放置包被抗β-hCG单克隆抗体的酶标板的隔层；所述盒体内设有放置试剂瓶的容器孔，所述容器孔内放置有:
[0012]装有分析液的试剂瓶；
[0013]装有清洗液的试剂瓶；
[0014]装有增强液的试剂瓶；
[0015]装有β -hCG校准品的试剂瓶；其中，β -hCG校准品的浓度已知，用于建立标准曲线.-^4 ，
[0016]装有标记的抗a -TSH单克隆抗体的试剂瓶。
[0017]作为本发明优选的技术方案，所述容器孔内还放置有:装有包被液的试剂瓶、装有封闭保护液的试剂瓶、以及装有洗脱液的试剂瓶。
[0018]作为本发明优选的技术方案，所述酶标板为带保护膜的96孔酶标板。
[0019]作为本发明优选的技术方案，所述抗β _hCG单克隆抗体的浓度为l-ΙΟμ g/ml。
[0020]所述标记的抗a -TSH单克隆抗体的标记物可以采用本领域常用的标记物，例如镧系元素。作为本发明优选的技术方案，所述标记的抗a-TSH单克隆抗体的标记物优选是三价铕离子。
[0021]作为本发明优选的技术方案，所述标记的抗a-TSH单克隆抗体中抗体与标记物的标记重量比例是(6-10):1。
[0022]作为本发明优选的技术方案，所述β-hCG校准品为尿液配制的β-hCG标准品。
[0023]在本发明的另一方面，还提供了一种上述试剂盒的制备方法，包括以下步骤:
[0024](I)抗β -hCG单克隆抗体包被酶标板的制备:
[0025]将抗β -hCG单克隆抗体在包被液中透析，再加入到酶标板上，于2_8°C包被48小时以上；用清洗液清洗酶标板后，加入封闭保护液，室温封闭20小时以上；甩干封闭保护液干燥密封，置于2-8°C冰箱备用；
[0026](2)三价铕标记的抗a -TSH单克隆抗体的制备:
[0027]将抗C1-TSH单克隆抗体，用标记液进行透析，取透析好的抗a-TSH单克隆抗体，用标记液稀释；将抗体加入到冻干的铕标记液中缓慢摇匀后置于2-8°C冰箱中过夜；用纯化柱纯化2-8°C过夜的标记液，收集标记物，加入0.1 % BSA置于_80± 10°C冷冻保存备用；
[0028](3) β -hCG校准品的制备:
[0029]用3-1^6干粉和阴性尿液配制浓度为0、15、25、37.5、50、75和100mIU/ml的β -hCG校准尿液，置于_80± 10°C冷冻保存备用；
[0030]所述清洗液、分析液和增强液为市售商品。
[0031]作为本发明优选的技术方案，步骤(2)中，所述将抗体加入到冻干的铕标记液中，其中抗体与铕标记液的重量比例为(6-10):1。
[0032]作为本发明优选的技术方案，步骤(2)中，所述用纯化柱纯化2_8°C过夜的标记液，收集标记物具体为:取纯化柱，用洗脱液洗脱平衡至少2小时，将2-8°C过夜的标记液全部转入柱子的顶端，重力自然洗脱，以0.25ml/管为单位进行收集。
[0033]在本发明的另一方面，还提供该试剂盒在检测β-hCG含量中的应用，该检测方法包括如下步骤:
[0034](I)将β -hCG校准品和待检样品依次加入到抗β -hCG单克隆抗体包被的酶标板上，再加入分析液，震荡孵育；
[0035](2)将清洗液用去离子水进行稀释，然后用已稀释的清洗液清洗酶标板并甩干；
[0036](3)将纯化好的三价铕标记的抗a-TSH单克隆抗体，用分析液稀释，加入酶标板中，震汤鮮育；
[0037](4)用清洗液清洗酶标板并甩干；
[0038](5)加入增强液，使用全自动时间分辨荧光免疫分析仪检测荧光信号；
[0039](6)根据荧光数值建立标准曲线，将待检样品的荧光信号代入到标准曲线中，求得待检样品的浓度。
[0040]上述术语说明如下:
[0041]本发明所述的“分析液”:Assay Buffer,市售商品，采购自Perkin Elmer,货号:4002-0010。在检测时使用的缓冲液。
[0042]本发明所述的“清洗液”:Wash Solut1n,市售商品,采购自Perkin Elmer,货号:B117-100。用于酶标板清洗的溶液。
[0043]本发明所述的“增强液” !Enhancement Solut1n,市售商品，采购自PerkinElmer，货号:Β118_100。可使标记物从反应复合物上解离下来的溶液。
[0044]本发明所述的“包被液”:可自行配制，用于将抗体包被在酶标板上的溶液。
[0045]本发明所述的“标记液”:可自行配制，用于将抗原与标记物结合到一起的溶液。
[0046]本发明所述的“封闭保护液”:可自行配制，用于将包被在酶标板上的抗体封闭保护在酶标板上的溶液。
[0047]本发明所述的“洗脱液”:可自行配制，用于洗脱平衡ro1柱子的溶液。
[0048]和现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
[0049]I使用本发明能够准确定量检测QC标准品中β -hCG含量，即确认标准品性能，为准确检测hCG测试笔提供保障，增加了企业对hCG测试笔的质量控制，避免了因标准品问题引起的产品质量调查、返工、客户投诉等，节约了企业的人力、物力和时间成本，具有良好的经济效益。
[0050]2使用本发明也能够用于定量检测尿液中β-hCG的含量，对于早期判断妊娠、流产、宫外孕等起到一定帮助，定量检测尿液中β-hCG的含量相比检测血液中的β-hCG的含量，其取样更简便，操作性更强。
[0051]3与现有技术相比，本发明可利用AutoDELFIA1235(全自动时间分辨荧光免疫分析仪)进行全自动操作，操作简单省时，加样量小(50ul/份)；灵敏度高，可达到0.0lmIU/ml ;准确性好，标准曲线R2值接近1，线性稳定，由标准曲线拟合出的回归方程准确，便于样品浓度计算；无辐射污染；检测样品量大，一次可最多检测953份样品。
[0052]4.本发明检测范围广，可检测β-hCG含量范围为O?3500IU/ml。
【专利附图】
【附图说明】
[0053]图1是时间免疫荧光试剂盒的原理示意图；
[0054]图2是本发明一种检测β -hCG含量的时间分辨免疫荧光试剂盒的结构示意图；
[0055]图3是本发明的试剂瓶的结构示意图；
[0056]图4是本发明的酶标板的结构示意图；
[0057]图5是本发明实施例1中的洗脱曲线示意图；
[0058]图6是本发明实施例2中荧光数值建立标准曲线示意图。
[0059]图中附图标记说明:
[0060]I是装有分析液的试剂瓶，2是装有清洗液的试剂瓶，3是装有增强液的试剂瓶，4是装有包被液的试剂瓶，5是装有封闭保护液的试剂瓶，6是装有洗脱液的试剂瓶，7是装有β-hCG校准品的试剂瓶，8是装有标记的抗a-TSH单克隆抗体的试剂瓶，9是酶标板，11是包被在酶标板上的抗β-hCG单克隆抗体，12是待测样品中的β-hCG抗原，13是三价铕离子(Eu3+)标记的抗a-TSH单克隆抗体，14是双抗体夹心法免疫复合物，15是含铕的荧光物质，21是5ml试剂瓶，22是30ml试剂瓶，91是加样孔，92是保护膜。
【具体实施方式】
[0061]下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
[0062]如图1所示,本发明的原理是双抗体夹心法,具体包括如下步骤:将抗β -hCG单克隆抗体包被到96孔酶标板上,形成包被在酶标板上的抗β -hCG单克隆抗体11,标记物是三价铕离子(Eu3+)标记的抗α-TSH单克隆抗体3，待测样品中的β-hCG抗原12先与包被在酶标板上的抗β -hCG单克隆抗体I反应(震荡、洗板)，然后与Eu3+标记的抗a -TSH单克隆抗体13反应(震荡、洗板)，形成双抗体夹心法免疫复合物14，加入增强液震荡反应，加入含铕的荧光物质15在荧光检测设备如AutoDELFIA1235上读荧光信号，进行TRFIA检测从而确定标准品中β -hCG的浓度。
[0063]如图2所示，本发明的一种检测β -hCG含量的时间分辨免疫荧光试剂盒，包括盒体和盒体上方的盒盖，所述盒体内设有放置包被抗β-hCG单克隆抗体的酶标板9的隔层；所述盒体内设有放置试剂瓶的容器孔，所述容器孔内放置有:装有分析液的试剂瓶I ;装有清洗液的试剂瓶2 ;装有增强液的试剂瓶3 ;装有包被液的试剂瓶4 ;装有封闭保护液的试剂瓶5 ;装有洗脱液的试剂瓶6 ;装有β-hCG校准品的试剂瓶7 ;装有标记的抗a-TSH单克隆抗体的试剂瓶8。
[0064]如图3所示，试剂瓶采用5ml试剂瓶21或30ml试剂瓶22。5ml试剂瓶21是塑料广口瓶(采用聚丙烯材质)。30ml试剂瓶22是塑料离心管(采用聚丙烯材质)。
[0065]如图4所示，酶标板9为带保护膜92的96孔酶标板，有96个加样孔91。
[0066]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
[0067]实施例1试剂盒的制备
[0068]上述试剂盒的制备方法如下:
[0069]1.200mmol/L pH = 6.8±0.1 包被液的配制
[0070]将35.08g Na2HPO4.12Η20、5.91g NaH2PO4.2H20 和 9g NaCl 加入到 600ml 去离子水中，用IN HCl和IN NaOH调整PH值至6.8 ±0.1，定容到1L。
[0071]2.50mmol/L pH = 6.8封闭保护液的配制
[0072]将8.77g Na2HPO4.Iffi2O 和 3.98g NaH2PO4.2H20 加入到 600ml 去离子水中，再依次加入Ig BSA(牛血清白蛋白)，60g Trehalose (海藻糖)和Ig Diazolidinyl Urea(双咪唑烷基脲)，待完全溶解后调整PH值至6.8±0.1，定容到1L。
[0073]3.100mmol/L pH = 9.3Eu3+标记液的配制
[0074]将2.12g Na2CO3 和 6.72g NaHCO3 加入到 600ml 去离子水中，用 IN HCl 和 IN NaOH调整PH值至9.3±0.1，定容到IL0
[0075]4.50mmol/L pH = 7.8±0.1 洗脱液的配制
[0076]将6.057g Tris，9g NaCl 和 345ml 0.1N HCl 加入 600ml 去离子水中，用 IN HCl和IN NaOH调整PH值至7.8±0.1，定容到IL0
[0077]5.抗β -hCG单克隆抗体包被酶标板的制备
[0078]5.1从冰箱中取出抗β -hCG单克隆抗体(采购自AlereSanDiego，货号:3468，作为包被抗体使用)，用200mmol/L pH = 6.8±0.1的包被液进行透析，将透析好的抗β _hCG单克隆抗体在紫外分光光度计下测定浓度，然后用此包被液将抗体稀释到8μ g/ml，混匀备用。
[0079]5.2取出96孔酶标板，恢复至室温，每孔加入150 μ I用包被液稀释好的8 μ g/ml抗β -hCG单克隆抗体，将96孔酶标板置于2-8°C包被48小时以上。
[0080]5.3取出96孔酶标板，将液体甩干，用1:25清洗液清洗3次，甩干，仔细检查孔中不能存有液体。每孔加入200 μ I 50mmol/L pH = 6.8±0.1的封闭保护液，于室温封闭20小时以上。
[0081]5.4取出96孔酶标板，将封闭保护液甩干，放入自封袋中并同时放入适量的干燥剂，2-8 °C冰箱干燥备用。
[0082]6.抗a-TSH单克隆抗体的三价铕(Eu3+)标记
[0083]6.1将抗a -TSH单克隆抗体(采购自AlereSanDiego，货号:3299，作为标记抗体使用)，用100mmol/L pH = 9.3±0.1的标记液进行透析。
[0084]6.2取透析好的抗a -TSH单克隆抗体,用标记液稀释至1.2mg/ml。
[0085]6.3按照抗体与铕标(6-10):1的结合比例，将1.2mg/ml抗a -TSH单克隆抗体加入到冻干的Eu-Labelling Reagent (铕标记液)中，缓慢摇勻，置于2_8°C冰箱中过夜,待用。
[0086]6.3 取 PD-10(S印hadex G-50M 填料)纯化柱，用 50 m mol/L PH = 7.8±0.I 的洗脱液洗脱平衡至少2小时。
[0087]6.4将2_8°C过夜的标记液(含抗a -TSH单克隆抗体)全部转入柱子的顶端，重力自然洗脱，以0.25ml/管为单位进行收集。收集好后，每管取10 μ L依次加入到96孔酶标板中，用AutoDELFIA 1235 (全自动时间分辨荧光免疫分析仪)进行荧光读数，将所得数据利用Excel (或其它软件)进行描绘曲线。
[0088]6.5按照图5的洗脱曲线，收集两个箭头中间的部分用于检测，把两个箭头中间的部分合并后，根据体积估算，加入总体积0.1 %的BSA，_80± 10°C冷冻保存备用。
[0089]7.β-hCG校准品(浓度已知，用于建立标准曲线)
[0090]用β-hCG干粉(来源于世界卫生组织WHO)和阴性尿液配制浓度为0、15、25、37.5,50,75和100mIU/ml的β -hCG校准尿液，_80± 10°C冷冻保存备用。
[0091]8.分析液(市售商品)Assay Buffer,采购自 Perkin Elmer,货号:4002_0010。
[0092]9.清洗液(市售商品)Wash Solut1n,采购自 Perkin Elmer,货号:Β117_100。
[0093]10.增强液(市售商品)Enhancement Solut1n,米购自 Perkin Elmer,货号:B118-100。
[0094]实施例2试剂盒的应用
[0095]本发明还提供了试剂盒的应用方法:
[0096]1.将浓度为0、15、25、37.5、50、75和100mIU/ml的β -hCG校准品和待检样品依次加入到抗β -hCG单克隆抗体包被的酶标板上，每个校准品和待检样品重复三孔，每孔加样50 μ 1，再加入150 μ I分析液，震荡孵育30分钟。
[0097]2.将清洗液用去离子水进行25倍稀释，然后用已稀释的清洗液清洗酶标板3次并甩干。
[0098]3.将纯化好的三价铕标记的抗a -TSH单克隆抗体，用分析液1:100稀释，200 μ I/孔加入酶标板中，震荡孵育30分钟。
[0099]4.用1:25清洗液清洗酶标板6次并甩干。
[0100]5.每孔加入300 μ I增强液，使用AutoDELFIA 1235检测荧光信号。
[0101]6.使用EXCEL或其他软件，根据荧光数值建立标准曲线(见图6)，将待检样品的荧光信号代入到标准曲线中，可求得待检样品的浓度，即检测出β -hCG的含量。
【权利要求】
1.一种检测β-hCG含量的时间分辨免疫荧光试剂盒，包括盒体和盒体上方的盒盖，其特征在于，所述盒体内设有放置包被抗β-hCG单克隆抗体的酶标板的隔层；所述盒体内设有放置试剂瓶的容器孔，所述容器孔内放置有: 装有分析液的试剂瓶； 装有清洗液的试剂瓶； 装有增强液的试剂瓶； 装有β -hCG校准品的试剂瓶； 装有标记的抗a-TSH单克隆抗体的试剂瓶。
2.如权利要求1所述的一种检测β-hCG含量的时间分辨免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述容器孔内还放置有:装有包被液的试剂瓶、装有封闭保护液的试剂瓶、以及装有洗脱液的试剂瓶。
3.如权利要求1所述的一种检测β-hCG含量的时间分辨免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述酶标板为带保护膜的96孔酶标板。
4.根据权利要求1所述的一种检测β-hCG含量的时间分辨免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述抗β-hCG单克隆抗体的浓度为l-10yg/ml。
5.根据权利要求1所述的一种检测β-hCG含量的时间分辨免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述标记的抗a -TSH单克隆抗体的标记物是三价铕离子。
6.根据权利要求1或5所述的一种检测β-hCG含量的时间分辨免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述标记的抗a-TSH单克隆抗体中抗体与标记物的标记重量比例是(6-10):1。
7.根据权利要求1所述的一种检测β-hCG含量的时间分辨免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述β-hCG校准品为尿液配制的β-hCG标准品。
8.一种根据权利要求5所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)抗β-hCG单克隆抗体包被酶标板的制备: 将抗β-hCG单克隆抗体在包被液中透析，再加入到酶标板上，于2-8°C包被48小时以上；用清洗液清洗酶标板后，加入封闭保护液，室温封闭20小时以上；甩干封闭保护液干燥密封，置于2-8°C冰箱备用； (2)三价铕标记的抗a-TSH单克隆抗体的制备: 将抗a-TSH单克隆抗体，用标记液进行透析，取透析好的抗a-TSH单克隆抗体，用标记液稀释；将抗体加入到冻干的铕标记液中缓慢摇匀后置于2_8°C冰箱中过夜；用纯化柱纯化2-8°C过夜的标记液，收集标记物，加入0.1 % BSA置于_80± 10°C冷冻保存备用； (3)β-hCG校准品的制备: 用@-1^6干粉和阴性尿液配制浓度为0、15、25、37.5、50、75和100mIU/ml的β-hCG校准尿液，置于_80±10°C冷冻保存备用； 所述清洗液、分析液和增强液为市售商品。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述将抗体加入到冻干的铕标记液中，其中抗体与铕标记液的重量比例为(6-10):1。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述用纯化柱纯化2_8°C过夜的标记液，收集标记物具体为:取纯化柱，用洗脱液洗脱平衡至少2小时，将2_8°C过夜的标记液全部转入柱子的顶端，重力自然洗脱，以0.25ml/管为单位进行收集。
11.一种根据权利要求1所述的试剂盒在检测β-hCG含量中的应用，其特征在于，该检测方法包括如下步骤: (1)将β-hCG校准品和待检样品依次加入到抗β -hCG单克隆抗体包被的酶标板上，再加入分析液，震荡孵育； (2)将清洗液用去离子水进行稀释，然后用已稀释的清洗液清洗酶标板并甩干； (3)将纯化好的三价铕标记的抗a-TSH单克隆抗体，用分析液稀释，加入酶标板中，震荡孵育； (4)用清洗液清洗酶标板并甩干； (5)加入增强液，使用全自动时间分辨荧光免疫分析仪检测荧光信号； (6)根据荧光数值建立标准曲线，将待检样品的荧光信号代入到标准曲线中，求得待检样品的浓度。
【文档编号】G01N33/531GK104181310SQ201410368022
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年7月30日 优先权日:2014年7月30日
【发明者】赵金博, 张展英, 周蓓昕 申请人:美艾利尔（上海）诊断产品有限公司