肾炎清片中土大黄主要成分含量的检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种肾炎清片中土大黄主要成分含量的检测方法，采用反相色谱法测定肾炎清片中大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量，色谱条件采用C18柱，流动相为甲醇—0.1%磷酸溶液，检测波长210-320nm。该方法操作简便、灵敏度高，重现性好，可为肾炎清片质量标准的制定提供了依据。
【专利说明】肾炎清片中土大黄主要成分含量的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及中成药有效成分的检测，特别涉及肾炎清片中大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量检测方法。
【背景技术】
[0002]肾炎清片是由益母草、黄芪、白茅根、篇蓄、瞿麦、小蓟、石韦、地榆炭、土大黄、甘草等制成的中药复方制剂。方中君药土大黄为酸模属植物巴天酸模Rumex patientia L.的干燥根，从巴天酸模中发现的化合物主要包括蒽醌、萘及萘醌、黄酮、二苯乙烯苷和苯并呋喃酮等(朱晶晶，王峥涛，张朝凤等.酸模属植物中化学成分及其药理活性研究进展[J].中草药，2008,39(3):450-454.)，蒽醌类成分作为其主要活性成分目前分离得到的主要有大黄素、大黄酚、大黄素甲醚及其苷等(刘景，夏忠庭，周桂荣等.巴天酸模根化学成分研究[J].中草药，2011,34(6):893-895 ;高黎明1，魏小梅，郑尚珍等.巴天酸模中化学成分的研究[J].中草药，2002，33 (3):207-209.)。
[0003]目前，该药材未被《中国药典》收载，仅在天津、北京等地方标准中有载，但这些地方标准大多为上世纪九十年代制定，检测手段落后，其检测方法只停留在简单的定性鉴别上，未收载可靠的含量测定方法，难以有效的控制药材质量。尤其在各级药品标准以及各文献检索中，对含土大黄制剂的含测控制方法未见研究，这样不能保证含土大黄复方制剂的安全、有效。为此，结合土大黄药材的含量测定标准建立含土大黄复方制剂的含测标准，对复方制剂的质量控制意义重大。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种简便、快速、准确的检测肾炎清片中土大黄主要有效成分含量的方法，为肾炎清片质量标准的制定提供依据。
[0005]本发明提供的肾炎清片中土大黄主要有效成分(大黄素、大黄酚和大黄素甲醚)含量的检测方法，包括以下步骤:
[0006]1)以大黄素、大黄酚、大黄素甲醚为对照品，制成一定含量的大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的溶液，通过高效液相色谱法测定其图谱，由大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的特征吸收峰峰面积和对照品进样量绘制标准曲线；
[0007]2)将待测肾炎清片研细，加溶剂超声处理，然后过滤取滤液，制得供试品；
[0008]3)在与步骤1)相同的色谱条件下测定步骤2)制得的供试品的高效液相色谱图谱，并分别计算大黄素、大黄酚和大黄素甲醚相应特征吸收峰的峰面积，根据步骤1)绘制的标准曲线得到待测肾炎清片中大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量。
[0009]上述步骤1)优选用80-100%甲醇溶解大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品，制成大黄素浓度为6-25 μ g/ml、大黄酹浓度为6_25 μ g/ml和大黄素甲醚浓度为4_16 μ g/ml的对照品溶液，然后上样进行高效液相色谱。当大黄素进样量在20.52-1026ng范围内特征吸收峰峰面积与进样量呈良好的线性关系；当大黄酚进样量在17.12-856ng范围内特征吸收峰峰面积与进样量呈良好的线性关系；当大黄素甲醚进样量在11.68-584ng范围内特征吸收峰峰面积与进样量呈良好的线性关系。
[0010]上述步骤2)肾炎清片研细后加入6-15%盐酸溶液中，超声使之溶散，再加入三氯甲烷，加热回流0.5-2小时，冷却，分液，取有机相，去除溶剂，残渣用80-100%甲醇溶解，过滤取滤液。优选的，180mg研细的肾炎清片粉末加入10mL 8%盐酸溶液中，超声使之溶散，再加三氯甲烷15mL，加热回流1小时，冷却后分液，取三氯甲烷层(即有机相)，水相(即酸液)用三氯甲烷提取3次，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂或水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，微孔滤膜(优选0.45 μ m)滤过，即得。
[0011]上述步骤1)和3)中，所述高效液相色谱法是反相色谱法，其色谱条件是:采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相是甲醇-(0.02、.2% )磷酸溶液，体积比为(0.5?19):1 ;检测波长为210-320nm。在此条件下，色谱峰可以得到较好的分离，理论板数按大黄素计算应不低于3000。
[0012]上述十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱优选为Agilent 38_(:18柱，柱体积为 4.6X250mm，粒度为 5μπι;流速:0.8-1.5mL/min ;柱温:25_40°C;流动相:甲醇-0.1%磷酸溶液(体积比85: 15);检测波长为254nm。
[0013]本发明采用反相色谱法对肾炎清片中的土大黄主要有效成分大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量进行测定，所提供的色谱条件可以使得色谱峰得到较好的分离，操作简便、灵敏度高，重现性好。并且，通过这些有效成分的含量了解肾炎清片在生产过程中是否达到生产要求，为肾炎清片质量标准的制定提供了依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1是实验例1得到的大黄素标准曲线；
[0015]图2是实验例1得到的大黄酚标准曲线；
[0016]图3是实验例1得到的大黄素甲醚标准曲线。
【具体实施方式】
[0017]肾炎清片中大黄主要成分含量测定的方法学研究
[0018]肾炎清片为中药复方制剂，为了有效地控制本品的质量，质量标准中以君药土大黄中蒽醌类成分水解后的蒽醌苷元大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的总量为含测指标，采用高效液相色谱法测定本品含量。
[0019]1、仪器与试验用药
[0020]仪器高效液相色谱仪:Waters 2695进样系统，Waters 2424ELSD检测器；WatersEmpower色谱工作站；Mettler AE240 (十万分之一)天平(梅特勒-托利多上海仪器有限公司)。
[0021]试验用药大黄素购自中国药品生物检定所(批号110756-200110)；
[0022]大黄酚购自中国药品生物检定所(批号110796-200615)；
[0023]大黄素甲醚购自中国药品生物检定所(批号110758-200912)；
[0024]甲醇为色谱纯；水为二纯水；检验样品及阴性样品(由天士力制药集团股份有限公司提供)。[0025]2、色谱条件的选择
[0026]色谱柱:AgilentZORBAX SB_C18 (5 μ m，250X4.6mm);流动相:甲醇 _0.1% 磷酸溶液水(体积比85:15);柱温:30°C;流速lml/min ;检测波长为254nm。在此色谱条件下，大黄素、大黄酚、大黄素甲醚与样品中其它组分分离良好，理论板数按大黄素峰计算大于3000。
[0027]3、供试品溶液的制备
[0028]取重量差异项下肾炎清片内容物，研细或粉碎，混匀，精密称定180mg，置具塞锥形瓶中，加入8%盐酸溶液10ml，超声使溶散，再加三氯甲烷15ml，加热回流1小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤具塞锥形瓶，并入分液漏斗中，分液取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜(0.45 μ m)滤过，即得。
[0029]4、空白试验
[0030]取缺土大黄的阴性样品，按供试品溶液制备方法操作，依法进样测定，记录色谱图。结果，在对照品相同保留时间(6.5min、8.5min、10.7min)处无吸收峰。表明样品中无干扰大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的成分存在。
[0031]5、线性关系的考察
[0032]精密称取大黄素对照品5.13mg、大黄酚对照品4.28mg、大黄素甲醚对照品
2.92mg,置50ml量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品母液，精密吸取上述混合对照品母液1ml置5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液；精密吸取上述混合对照品溶液各1μ 1、2μ 1、5μ 1、10μ 1、15μ 1、20μ 1、30μ 1、40μ 1、50 μ 1，分别注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积，以对照品进样量x(ng)为横坐标，以峰面积值Y(mv.s)为纵座标，绘制标准曲线，结果如下。
[0033]表1.大黄素线性范围测定结果
[0034]
【权利要求】
1.一种肾炎清片中大黄素、大黄酚和大黄素甲醚含量的检测方法，包括以下步骤:1)以大黄素、大黄酚、大黄素甲醚为对照品，制成一定含量的大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的溶液，通过高效液相色谱法测定其图谱，由大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的特征吸收峰峰面积和对照品进样量绘制标准曲线；2)将待测肾炎清片研细，加溶剂超声处理，然后过滤取滤液，制得供试品；3)在与步骤1)相同的色谱条件下测定步骤2)制得的供试品的高效液相色谱图谱，并分别计算大黄素、大黄酚和大黄素甲醚相应特征吸收峰的峰面积，根据步骤1)绘制的标准曲线得到待测肾炎清片中大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤1)用80-100%甲醇溶解大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品，制成大黄素浓度为6-25μ g/ml、大黄酚浓度为6-25μ g/ml和大黄素甲醚浓度为4-16μ g/ml的对照品溶液，然后上样进行高效液相色谱。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤2)将肾炎清片研细后加入6-15%盐酸溶液中，超声使之溶散，再加入三氯甲烷，加热回流0.5-2小时，冷却，分液，取有机相，去除溶剂，残渣用80-100%甲醇溶解，过滤取滤液，制得供试品。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤2)取180mg研细的肾炎清片粉末加入10mL 8%盐酸溶液中，超声使之溶散，再加三氯甲烷15mL，加热回流1小时，冷却后分液，取三氯甲烷层，水相用三氯甲烷提取3次，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂或水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，微孔滤膜滤过，即得供试品。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤1)和3)中采用的高效液相色谱法是反相色谱法。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤1)和3)进行高效液相色谱的色谱条件是:采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相是甲醇-(0.02、.2% )磷酸溶液，体积比为(0.5?19):1 ;检测波长为210-320nm。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱是Agilent 313-(318柱，柱体积为4.6X 250mm,粒度为5 μ m ;流速:0.8-1.5mL/min ；柱温:25-40°C。
【文档编号】G01N30/02GK103675111SQ201210327760
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月6日 优先权日:2012年9月6日
【发明者】周桂荣, 鄂秀辉, 刘艳, 张兰兰, 周水平 申请人:天士力制药集团股份有限公司