一种基于衍生的人参皂苷及其苷元的检测分析方法
【专利摘要】本发明涉及一种基于衍生的人参皂苷及其苷元的检测分析方法，首次使用衍生化试剂4’-羧基罗丹明对人参皂苷及其苷元中的游离羟基进行衍生化，并利用多反应监测模式的超高效液相色谱三重四极杆质谱检测分析的质谱增敏分析方法。本发明的方法可用于分析检测10种人参皂苷4种人参皂苷苷元，通过计算分析检测结果，准确得到人参皂苷及其苷元的含量，该方法的灵敏度高，准确性佳，选择性好，并能显著地改善基质效应，对于药理学、药物筛选、人参药材及人参相关产品质量控制具有重要意义。
【专利说明】-种基于衍生的人参皂苷及其苷元的检测分析方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分析化学领域，具体涉及一种基于衍生的人参皂苷及其苷元的检测分 析方法，尤其是涉及一种利用4' -羧基罗丹明对人参皂苷及其苷元的活性羟基进行衍生化 后利用超高效液相色谱三重四极杆质谱法检测分析的质谱增敏分析方法。
【背景技术】
[0002] 人参皂苷是人参中的主要活性成分，许多研究已报导人参皂苷具有抗癌保健等作 用。绝大多数人参皂苷根据其苷元结构的不同可以分为原人参二醇（pro)型和原人参三醇 (ρρτ)型，而原人参二醇（pro)与原人参三醇（ρρτ)也被认为是人参皂苷在生物体内的最终 代谢产物并体现其药理学活性。人参皂苷因具有优越的生理学、药学特性，成为国内外研究 的热门领域。
[0003] 因为人参皂苷及其苷元缺乏可被高灵敏检测的分子结构，常规的光谱法、色谱法、 质谱法、免疫法的检测灵敏度难以满足微量分析需求。文献《高效液相色谱-串联质谱法同 时测定参麦注射液中9种皂苷》（中华中医药学刊，2014年第32卷，第1期）和《高效液相 色谱串联质谱法分析紫红参中人参皂苷类成分》（药物分析杂志，2013年第33卷第5期)， 研究了色谱-质谱联用技术用于人参皂苷直接检测，但仅仅是针对注射液等皂苷含量较高 的样品进行直接检测，具有灵敏度低、基质干扰严重等局限性。衍生化技术是提高人参皂苷 及其苷元质谱检测灵敏度的有效手段，现有的衍生剂多利用苯甲酰氯等将人参皂苷母核上 的羟基进行衍生化反应，反应时间长、条件苛刻，现有的衍生方法使用吡啶作为溶剂兼催化 齐U，吡啶挥发性强，具有刺激性，污染环境且基质效应较为明显，因此更需要寻找一种更为 方便、有效、环境友好的高灵敏检测分析方法。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是如何准确且灵敏的分析检测人参皂苷及其苷元。本 发明的目的是提供一种基于衍生的人参皂苷及其苷元的检测分析方法，首次使用了 4' -羧 基罗丹明对人参皂苷及其苷元中的活性羟基进行衍生化，同时利用乙腈替代了传统的挥发 性强、具有刺激性的吡啶作为溶剂，解决了反应时间长等问题。利用4'-羧基罗丹明作为衍 生剂联合超高效液相色谱三重四极杆质谱法，由于罗丹明分子结构中含有一个稳定的季铵 型阳离子，因此衍生化方法能够带来显著的质谱增敏检测效果。此法克服了常规方法的灵 敏度不高等问题，且衍生化反应温和快捷，能够提高质谱检测灵敏度、选择性和准确度，并 且大大改善了基质效应，本发明对生物样品中的痕量人参皂苷及其苷元进行定量分析对于 药理学、药物筛选、人参药材及人参相关产品质量控制具有重要意义。
[0005] 本发明提供的技术方案是： 一种基于衍生的人参皂苷及其苷元的检测分析方法，其特征在于，包括以下步骤： a向人参皂苷及其苷元的萃取物中加入4' -羧基罗丹明，2-氯-1-甲基碘代吡啶和 4_二甲氨基吡啶，乙腈，摇匀，置于水浴中加热，4' -羧基罗丹明与人参皂苷及其苷元上的 游离羟基进行衍生化反应，得到衍生化产物； b将a中的衍生化产物经滤膜过滤后利用超高效液相色谱串联质谱法进行分析检测； 所述的人参皂苷及其苷元在C-20或C-3位置具有游离羟基。
[0006] 所述的分析检测方法针对的分析物包括10种人参皂苷和4种人参皂苷苷元，所述 的人身皂苷为原人参二醇型人参皂苷或原人参三醇型人参皂苷，所述的原人参二醇型人参 皂苷为Rg3、Rh2、Rs3或Compound K (C-K)，所述的原人参三醇型人参皂苷为Re、Rf、RgU Rg2、Rhl或Fl,所述的苷元为原人参二醇型人参阜苷苷元或原人参三醇型人参阜苷苷元， 所述的原人参二醇型人参阜苷苷元为原人参二醇（PPD)或人参二醇（PD),所述的原人参三 醇型人参皂苷苷元为原人参三醇（PPT)或人参三醇（PT)。具体结构式如下：
【权利要求】
1. 一种基于衍生的人参皂苷及其苷元的检测分析方法，其特征在于，包括以下步骤： a向人参皂苷及其苷元的萃取物中加入4' -羧基罗丹明，2-氯-1-甲基碘代吡啶和 4_二甲氨基吡啶，乙腈，摇匀，置于水浴中加热，4' -羧基罗丹明与人参皂苷及其苷元上的 游离羟基进行衍生化反应，得到衍生化产物； b将a中的衍生化产物经滤膜过滤后利用超高效液相色谱串联质谱法进行分析检测； 所述的人参皂苷及其苷元在C-20或C-3位置具有游离羟基。
2. 根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于：所述的人身皂苷为原人参二醇 型人参皂苷或原人参三醇型人参皂苷，所述的原人参二醇型人参皂苷为Rg3、Rh2、Rs3或 Compound K，所述的原人参三醇型人参皂苷为Re、Rf、Rgl、Rg2、Rhl或F1，所述的苷元为 原人参二醇型人参皂苷苷元或原人参三醇型人参皂苷苷元，所述的原人参二醇型人参皂苷 苷元为原人参二醇或人参二醇，所述的原人参三醇型人参阜苷苷元为原人参三醇或人参三 醇。
3. 根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于：步骤a中人参皂苷及其苷元的 萃取物的制备方法为超声辅助-分散液液微萃取：将人参皂苷及其苷元的水溶液加入到离 心管中，去离子水定容，再加入萃取剂和分散剂，超声处理形成均匀的乳浊液体系后，离心， 去除上清液得到沉积相，沉积相用氮气吹干后，溶于乙腈，制得人参皂苷及其苷元的萃取 物。
4. 根据权利要求3所述的检测分析方法，其特征在于：萃取剂选自二氯甲烷、三氯甲 烷、三氯乙烯、四氯乙烯或氯苯；分散剂选自丙酮、乙腈、甲醇或乙醇。
5. 根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于：步骤a中的衍生化反应为置于 25-60 ° C水浴中加热10-60分钟。
6. 根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于：步骤a中4' -羧基罗丹明的摩 尔浓度为人参皂苷及其苷元萃取物摩尔浓度的5-15倍，2-氯-1-甲基碘代吡啶的摩尔浓度 为4'-羧基罗丹明摩尔浓度的500-10000倍，4-二甲氨基吡啶的摩尔浓度为4'-羧基罗丹 明摩尔浓度100-1000倍。
7. 根据权利要求6所述的检测分析方法，其特征在于：4' -羧基罗丹明的摩尔浓度为 人参皂苷及其苷元萃取物摩尔浓度的10倍，2-氯-1-甲基碘代吡啶的摩尔浓度为4' -羧 基罗丹明摩尔浓度的7000倍，4-二甲氨基吡啶的摩尔浓度为4' -羧基罗丹明摩尔浓度的 500 倍。
8. 根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于：步骤b中超高效液相色谱中的 色谱分离柱为SB C18柱，采用流动相线性梯度洗脱法，进样体积为2 ML，柱温恒定在30°C。
9. 根据权利要求8所述的检测分析方法，其特征在于：流动相由流动相A和流动相B组 成，流动相A为5%体积分数的乙腈/水溶液含有0. 1%甲酸，流动相B为乙腈含有0. 1%甲 酸；〇分钟时，流动相A与流动相B的体积比为60:40 ;5 min时，流动相A与流动相B的体 积比为35:65。
10. 根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于：步骤b中质谱法为利用三重四 级杆质谱法，质谱条件为：干燥气温度300 ° C，流速10 L/min，喷雾器气压40 psi，鞘气温 度280 ° C，流速11 L/min，毛细管电压3.5 kV。
【文档编号】G01N30/02GK104316604SQ201410430079
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年8月28日 优先权日:2014年8月28日
【发明者】赵先恩, 朱树芸, 尤进茂, 吕涛 申请人:曲阜师范大学