产人参皂苷元的重组酿酒酵母及其构建方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了产人参皂苷元的重组酿酒酵母及其构建方法与应用。本发明所提供的一株能同时产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇等三种人参皂苷元的重组酿酒酵母是酿酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)GY-1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC?No.7725。酿酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)GY-1能同时生产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇等三种人参皂苷元，产量分别达21.4mg/L发酵液，17.2mg/L发酵液和15.9mg/L发酵液，占总人参皂苷元比例分别为39.3%,31.5%和29.2%。
【专利说明】产人参皂苷元的重组酿酒酵母及其构建方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及产人参皂苷元的重组酿酒酵母及其构建方法与应用。
【背景技术】
[0002]人参阜苷(Ginsenoside)是五加科(Araliaceae)植物人参(Panaxginseng)和西洋参(Panax quinquefolium)的主要活性成分。迄今为止已经发现的人参阜苷约有40余种，它们具有相似的基本结构，都含有由30个碳原子排列成四个环的留烷类固醇核。依糖苷基架构的不同，人参皂苷分为人参二醇型，人参三醇型和齐墩果酸型三种，如下:
[0003]人参二醇型，包含种类最多的人参皂苷，如人参皂苷Rb 1、Rb2、Rb3、Re、RcU Rg3、Rh2及糖苷基ro ；
[0004]人参三醇型，包含人参皂苷Re、Rgl、Rg2、Rhl及糖苷基PT ；
[0005]齐墩果烷型，包含人参皂苷RO。
[0006]I)达玛二烯(dammarenediol-1I)为人参二醇型和人参三醇型人参阜苷生物合成的共同前体。
[0007]原人参二醇(protopanaxadiol)为人参二醇型人参阜苷的苷元,其本身具有抗癌、抗抑郁、激活氯离子通道和抑制钠离子通道去极化的作用、抑制人胚肾HEK-293细胞和幽门螺旋杆菌生长等多种药理活性。原人参二醇的糖基化产物:人参二醇型人参皂苷类化合物，如人参皂苷Rh2、人参皂苷Rg3等在心脑血管，抗肿瘤等方面也有很好的药理活性，这类化合物的相关产品已在临床广泛使用。
`[0008]原人参三醇(protopanaxatriol)为人参三醇型人参阜苷的苷元,其糖基化产物形成了系列药理作用显著的人参皂苷。
[0009]2) β -香树脂(β -amyrin)为齐墩型药用三萜酸化合物生物合成的共同前体，这类物质包括齐墩果酸(oleanolic acid),及其他药用植物来源的甘草酸(glycyrrhizin),山楂酸(maslinic acid)等重要化合物。其中齐墩果酸具有抗病毒、抗炎、抗变态反应、抗氧化应激及促进肝糖原合成和肝细胞再生作用等药理活性，齐墩果酸片等药品已在临床广泛应用于肝脏保护。在人参中为人参皂苷RO的苷元。
[0010]人参皂苷类化合物的主要来源是通过中药材人参中直接提取，然而作为人参皂苷的主要来源，人参、西洋参需要4-15年的生长栽培阶段，生产上由于连作障碍和病虫害的困扰，其品质及其生长环境受到严重限制。人参皂苷类化合物产量已经远不能满足社会的需求，严重影响了人参的临床应用和人参皂苷类制药原料中间体的开发和应用，亟待需要提供新的资源途径。
【发明内容】
[0011]本发明所要解决的技术问题是提供产人参皂苷元的重组酿酒酵母及其构建方法与应用。
[0012]本发明所提供的一株能同时产齐墩果酸(0A)，原人参二醇(PPD)和原人参三醇(PPT)等三种人参阜苷元的重组酿酒酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GY-1,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC N0.7725。
[0013]本发明所提供的一株产β -香树脂的重组酿酒酵母是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) BY-β A,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC N0.7726。
[0014]本发明还提供了构建产齐墩果酸和β -香树脂的重组酿酒酵母菌的方法。
[0015]本发明所提供的构建产齐墩果酸和β -香树脂的重组酿酒酵母菌的方法，包括向重组酿酒酵母菌BY- β A中导入GgbAS表达盒，AtCPRl表达盒和MtOAS表达盒得到产齐墩果酸和β -香树脂的重组酿酒酵母菌BY-OA的步骤；所述GgbAS是由SEQ ID N0.2的第8-2305位的核苷酸序列编码的蛋白质；所述AtCPRl是由SEQ ID N0.1的核苷酸序列编码的蛋白质；所述MtOAS是由SEQ ID N0.3的第8-1447位的核苷酸序列编码的蛋白质；所述重组酿酒酵母菌BY-β A为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) BY-β A,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC N0.7726。
[0016]上述构建产齐墩果酸和香树脂的重组酿酒酵母菌的方法中,所述方法还包括向所述重组酿酒酵母菌BY-OA中导入所述GgbAS表达盒，所述AtCPRl表达盒和所述MtOAS表达盒得到产齐墩果酸和β -香树脂的重组酿酒酵母菌ΒΥ-20Α的步骤。
[0017]上述构建产齐墩果酸和β -香树脂的重组酿酒酵母菌的方法中，向所述重组酿酒酵母菌BY- β A的Trpl位点导入所述GgbAS表达盒，所述AtCPRl表达盒和所述MtOAS表达盒；向所述重组酿酒 酵母菌BY-OA的His3位点导入所述GgbAS表达盒，所述AtCPRl表达盒和所述MtOAS表达盒。
[0018]上述构建产齐墩果酸和香树脂的重组酿酒酵母菌的方法中，所述GgbAS表达盒由所述GgbAS的编码基因，启动所述GgbAS的编码基因转录的启动子Prcia和终止所述GgbAS编码基因转录的终止子Tadhi组成；所述启动子Praa为酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因(PGKl)的启动子，所述终止子Tadhi为酿酒酵母乙醇脱氢酶基因I(ADHl)终止子；
[0019]所述AtCPRl表达盒由所述AtCPRl的编码基因，启动所述AtCPRl的编码基因转录的启动子Ptdh3和终止所述AtCPRl的编码基因转录的终止子Ttpii组成；所述启动子Ptdh3为酿酒酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶3基因(TDH3)的启动子，所述终止子Ttpii为酿酒酵母磷酸丙糖异构酶基因(TPIl)的终止子；
[0020]所述MtOAS表达盒由所述MtOAS的编码基因、启动所述MtOAS的编码基因转录的启动子Ptef1、终止所述MtOAS的编码基因转录的终止子Tcra组成；所述启动子Ptefi为酿酒酵母翻译延伸因子I基因(TEFl)的启动子，所述终止子Tcra为酿酒酵母细胞色素Cl基因(CYCl)的终止子。
[0021 ] 在本发明的一个实施方式中，所述GgbAS表达盒(PrcK1-GgbAS_TADH1)中，启动子Praa的功能序列(具有启动子功能的序列)为SEQ ID N0.6的第63-812位，GgbAS基因的编码序列为SEQ ID N0.2的第8-2305位，终止子Tadhi的功能序列(具有终止子功能的序列)为SEQID N0.6 的第 3143-3300 位 Jy^iAtCPRl 表达盒(PTDH3-AtCPRl_TTPI1)中，启动子 Ptdh3 的功能序列为SEQ ID N0.10，终止子Tmi的功能序列为SEQ ID N0.11，AtCPRl基因的编码序列为SEQ ID N0.1 ;所述MtOAS表达盒(PTEF1-MtOAS-TCYC1)中，启动子Ptefi的功能序列为SEQ IDN0.8，终止子Tcyci的功能序列为SEQ ID N0.9，MtOAS基因的编码序列为SEQ ID N0.3的第8-1447 位。
[0022]在本发明的一个实施方式中，向所述重组酿酒酵母菌ΒΥ-β A的Trpl位点导入所述GgbAS表达盒，所述AtCPRl表达盒和所述MtOAS表达盒是通过同源重组实现的，所述GgbAS表达盒，所述AtCPRl表达盒和所述MtOAS表达盒通过Trpl位点上游同源片段Ml和Trpl位点下游同源片段Μ5导入所述重组酿酒酵母菌BY- β A的Trpl位点；所述Trpl位点上游同源片段Ml的核苷酸序列是SEQ ID N0.7的第1429-1861位，所述Trpl位点下游同源片段Μ5的核苷酸序列是SEQ ID N0.12的第1-455位。
[0023]在本发明的一个实施方式中，向所述重组酿酒酵母菌BY-OA的His3位点导入所述GgbAS表达盒，所述AtCPRl表达盒和所述MtOAS表达盒是通过同源重组实现的，所述GgbAS表达盒，所述AtCPRl表达盒和所述MtOAS表达盒通过His3位点上游同源片段Ml和His3位点下游同源片段M5导入所述重组酿酒酵母菌BY-OA的His3位点；所述His3位点上游同源片段Ml的核苷酸序列是SEQ ID N0.14的第1059-1507位，所述His3位点下游同源片段M5的核苷酸序列是SEQ ID N0.15的第1-463位。
[0024]由上述构建产齐墩果酸和香树脂的重组酿酒酵母菌的方法构建的产齐墩果酸和β-香树脂的重组酿酒酵母菌也属于本发明的保护范围。
[0025]本发明还提供了构建产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇的重组酿酒酵母菌的方法。
[0026]本发明所提供的构建产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇的重组酿酒酵母菌的方法，包括向上述重组酿酒酵母菌BY-OA中导入SynPgPPDS表达盒、SynPgPPTS表达盒、AtCPRl表达盒和PgDDS表达盒得到产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇的重组酿酒酵母菌；所述SynPgPPDS是`由SEQ ID N0.4的第8-1468位的核苷酸序列编码的蛋白质；所述SynPgPPTS是由SEQ ID N0.5的第8-1417位的核苷酸序列编码的蛋白质；所述AtCPRl是由SEQ ID N0.1的核苷酸序列编码的蛋白质；所述PgDDS是由SEQ ID N0.6的第825-3134位编码的蛋白质。
[0027]上述构建产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇的重组酿酒酵母菌的方法中，向所述重组酿酒酵母菌BY-OA的His3位点导入所述SynPgPPDS表达盒、所述SynPgPPTS表达盒、所述AtCPRl表达盒和所述PgDDS表达盒。
[0028]所述SynPgPPDS表达盒由所述SynPgPPDS的编码基因、启动所述SynPgPPDS的编码基因转录的启动子Ptef1、终止所述SynPgPPDS的编码基因转录的终止子Tcra组成；所述启动子Ptefi为酿酒酵母翻译延伸因子I基因(TEFl)的启动子，所述终止子Τ?α为酿酒酵母细胞色素Cl基因的(CYCl)的终止子；
[0029]所述SynPgPPTS表达盒由所述SynPgPPTS的编码基因，启动所述SynPgPPTS的编码基因转录的启动子Pfbai和终止所述SynPgPPTS的编码基因转录的终止子Ttdh2组成；所述启动子Pfbai为酿酒酵母果糖-1，6- 二磷酸醛缩酶基因(FBA1)的启动子，所述终止子Ttdh2为酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶2基因(TDH2)的终止子；
[0030]所述AtCPRl表达盒由所述AtCPRl的编码基因，启动所述AtCPRl的编码基因转录的启动子Ptdh3和终止所述AtCPRl的编码基因转录的终止子Ttpii组成；所述启动子Ptdh3为酿酒酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶3基因(TDH3)的启动子，所述终止子Ttpii为酿酒酵母磷酸丙糖异构酶基因(TPIl)的终止子；[0031]所述PgDDS表达盒由所述PgDDS的编码基因，启动所述PgDDS的编码基因转录的启动子P.和终止所述PgDDS的编码基因转录的终止子Tadhi组成；所述启动子Prcia为酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因(PGKl)的启动子，所述终止子Tadhi为酿酒酵母乙醇脱氢酶基因 I(ADHl)终止子 Tadhi。
[0032]在本发明的一个实施方式中，所述SynPgPPDS表达盒(PTEF1-SynPgPPDS-TCYC1)中，启动子Ptefi的功能序列为SEQ ID N0.8，终止子Tera的功能序列为SEQ ID N0.9，SynPgPPDS基因的编码序列为SEQ ID N0.4的第8-1468位；所述SynPgPPTS表达盒(PFBA1-SynPgPPTS-T丽)中，启动子Pfbai的功能序列为SEQ ID N0.16，终止子Ttdh2的功能序列为SEQ ID N0.13，SynPgPPTS基因的编码序列为SEQ ID N0.5的第8-1417位；所述AtCPRl表达盒(PTDH3-AtCPRl-TTm)中，启动子Ptdh3的功能序列为SEQ ID N0.10，终止子Ttpii的功能序列为SEQ ID N0.11，AtCPRl基因的编码序列为SEQ ID N0.1 ;所述PgDDS表达盒(Ppgk1-PgDDS-TADH1)的核苷酸序列如SEQ ID N0.6，其中，第63-812位为启动子Praa的功能序列，第825-3134位为PgDDS基因的编码序列，第3143-3300位终止子Tadhi的功能序列。
[0033]在本发明的一个实施方式中，向所述重组酿酒酵母菌BY-OA的His3位点导入所述SynPgPPDS表达盒、所述SynPgPPTS表达盒、所述AtCPRl表达盒和所述PgDDS表达盒通过同源重组实现的，所述SynPgPPDS表达盒、所述SynPgPPTS表达盒、所述AtCPRl表达盒和所述PgDDS表达盒通过所述His3位点上游同源片段Ml和所述His3位点下游同源片段M5导入所述重组酿酒酵母菌BY-OA的His3位点。
[0034]上述产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇的重组酿酒酵母菌具体可为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GY_1,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC N0.7725。
[0035]由上述构建产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇的重组酿酒酵母菌方法构建的产齐墩果酸，原人参二醇 和原人参三醇的重组酿酒酵母菌也属于本发明的保护范围。
[0036]上述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GY_l、或上述方法构建的产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇的重组酿酒酵母菌在生产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇中的应用，或在生产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇这三种物质中两种或一种物质中的应用也属于本发明的保护范围。
[0037]上述产齐墩果酸和β -香树脂的重组酿酒酵母菌在生产齐墩果酸和/或β -香树脂中的应用，以及上述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) BY-β A在生产β-香树脂中的应用也属于本发明的保护范围。
[0038]本发明中所述表达盒均指能够在宿主细胞(酿酒酵母细胞)中表达目的蛋白质的DNA,该DNA不但可包括启动目的基因转录的启动子，还可包括终止所述目的基因转录的终止子。
[0039]上文中，AtCPRl为拟南芥烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素Ρ450还原酶，GgbAS为β -香树脂合酶，MtOAS为齐墩果酸合酶，SynPgPPDS为原人参二醇合成酶，SynPgPPTS为原人参三醇合成酶，PgDDS为来源于人参的达玛二烯合酶。
[0040]实验证明，本发明方法构建的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GY-1能同时生产齐墩果酸(0A)，原人参二醇(PPD)和原人参三醇(PPT)等三种人参皂苷元，产量分别达21.4mg/L发酵液，17.2mg/L发酵液和15.9mg/L发酵液，占总人参皂苷元比例分别为39.3%, 31.5% 和 29.2%。本发明方法构建的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) BY-20A的β -香树脂含量达141.7mg/L发酵液(I1.8mg/g细胞干重)，齐墩果酸含量达203.4mg/L发酵液(17.0mg/g细胞干重)。本发明方法构建的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-OA的β-香树脂含量达61.4mg/L发酵液(5.lmg/g细胞干重)，齐墩果酸含量达72.0mg/L发酵液(6.0mg/g细胞干重)。本发明方法构建的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY- β A的β -香树脂含量达57.5mg/L发酵液(5.0mg/g细胞干重)。
[0041]保藏说明
[0042]1、菌种名称:酿酒酵母
[0043]拉丁名:Saccharomycescerevisiae
[0044]菌株编号:GY_1
[0045]保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0046]保藏机构简称:CGMCC
[0047]地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号
[0048]保藏日期:2013年6月18日
[0049]保藏中心登记入册编 号:CGMCC N0.7725
[0050]2、菌种名称:酿酒酵母
[0051]拉丁名:Saccharomycescerevisiae
[0052]菌株编号:BY-β A
[0053]保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0054]保藏机构简称:CGMCC
[0055]地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号
[0056]保藏日期:2013年6月18日
[0057]保藏中心登记入册编号:CGMCC N0.7726
【专利附图】
【附图说明】
[0058]图1为β -香树脂GC-MS分析。
[0059]Α、B和C的横坐标为保留时间(分钟)，D横坐标为Μ/Ζ，纵坐标为丰度。
[0060]图2为齐墩果酸LC-MS分析。
[0061]Α、B和C的横坐标为保留时间(分钟)，纵坐标为丰度。
[0062]图3为原人参二醇LC-MS分析。
[0063]Α、B和C的横坐标为保留时间(分钟)，纵坐标为丰度。
[0064]图4为原人参三醇LC-MS分析。
[0065]Α、B和C的横坐标为保留时间(分钟)，纵坐标为丰度。
[0066]图5人参阜苷兀在酿酒酵母中的含量。
[0067]PPT (原人参三醇)；0Α (齐墩果酸)；PPD (原人参二醇)。
【具体实施方式】
[0068]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0069]实施例1:质粒构建
[0070]一、基因元件的克隆分为以下三步:
[0071](I)酵母基因组DNA提取
[0072]提取酿酒酵母BY4742(Saccharomyces cerevisiae BY4742,记载在Carrie bakerbrachmann et al.，1998, YEAST, 14:115 - 132，公众可从中国科学院天津工业生物技术研究所犾得。)的基因组DNA。
[0073](2)拟南芥cDNA的获得
[0074]提取拟南芥(col-Ο生态型，记载在 Athanasios Theologis et al., 2000,Nature408 =816-820,公众可从中国科学院天津工业生物技术研究所获得)的总RNA，经反转录得到拟南芥cDNA。
[0075](3) PCR扩增及克隆基因元件
[0076]以酿酒酵母 BY4742 (Saccharomyces cerevisiae BY4742,记载在 Carrie bakerbrachmann et al.，1998, YEAST, 14:115 - 132，公众可从中国科学院天津工业生物技术研究所获得。)的基因组DNA为模板，用引物列表1中引物，扩增ERG9、ERG1 ;以拟南芥(col-0生态型，记载在Athanasios Theologis et al., 2000,Nature 408:816-820,公众可从中国科学院天津工业生物技术研究所获得)的cDNA为模板扩增AtCPRl基因。
[0077]表1引物序列
[0078]
【权利要求】
1.酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae),其菌株号为GY-1,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC N0.7725。
2.酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae),其菌株号为BY-β A,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC N0.7726。
3.构建产齐墩果酸和香树脂的重组酿酒酵母菌的方法，包括向重组酿酒酵母菌BY- β A中导入GgbAS表达盒，AtCPRl表达盒和MtOAS表达盒得到产齐墩果酸和β -香树脂的重组酿酒酵母菌BY-OA的步骤；所述GgbAS是由SEQ ID N0.2的第8-2305位的核苷酸序列编码的蛋白质；所述AtCPRl是由SEQ ID N0.1的核苷酸序列编码的蛋白质；所述MtOAS是由SEQ ID N0.3的第8-1447位的核苷酸序列编码的蛋白质；所述重组酿酒酵母菌BY-β A为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) BY-β A,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC N0.7726。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于:所述方法还包括向所述重组酿酒酵母菌BY-OA中导入所述GgbAS表达盒，所述AtCPRl表达盒和所述MtOAS表达盒得到产齐墩果酸和β -香树脂的重组酿酒酵母菌ΒΥ-20Α的步骤。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于:所述方法中，向所述重组酿酒酵母菌BY- β A的Trpl位点导入所述GgbAS表达盒，所述AtCPRl表达盒和所述MtOAS表达盒；向所述重组酿酒酵母菌BY-OA的His3位点导入所述GgbAS表达盒，所述AtCPRl表达盒和所述MtOAS表达盒。
6.根据权利要求3或4或5所述的方法，其特征在于:所述GgbAS表达盒由所述GgbAS的编码基因，启动所述GgbAS的编码基因转录的启动子Praa和终止所述GgbAS编码基因转录的终止子Tadhi组成；所 述启动子Praa为酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因的启动子，所述终止子Tadhi为酿酒酵母乙醇脱氢酶基因I的终止子； 所述AtCPRl表达盒由所述AtCPRl的编码基因，启动所述AtCPRl的编码基因转录的启动子Ptdh3和终止所述AtCPRl的编码基因转录的终止子Ttpii组成；所述启动子Ptdh3为酿酒酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶3基因的启动子，所述终止子Ttpii为酿酒酵母磷酸丙糖异构酶基因的终止子； 所述MtOAS表达盒由所述MtOAS的编码基因、启动所述MtOAS的编码基因转录的启动子Ptef1、终止所述MtOAS的编码基因转录的终止子Tctci组成；所述启动子Ptefi为酿酒酵母翻译延伸因子I基因的启动子，所述终止子Tcra为酿酒酵母细胞色素Cl基因的终止子。
7.由权利要求3-6中任一所述的方法构建的产齐墩果酸和β-香树脂的重组酿酒酵母菌。
8.构建产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇的重组酿酒酵母菌的方法，包括向权利要求3-6中任一所述的重组酿酒酵母菌BY-OA中导入SynPgPPDS表达盒、SynPgPPTS表达盒、AtCPRl表达盒和PgDDS表达盒得到产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇的重组酿酒酵母菌；所述SynPgPPDS是由SEQ ID N0.4的第8-1468位的核苷酸序列编码的蛋白质；所述SynPgPPTS是由SEQ ID N0.5的第8-1417位的核苷酸序列编码的蛋白质；所述AtCPRl是由SEQ ID N0.1的核苷酸序列编码的蛋白质；所述PgDDS是由SEQ ID N0.6的第825-3134位编码的蛋白质。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于:向所述重组酿酒酵母菌BY-OA的His3位点导入所述SynPgPPDS表达盒、所述SynPgPPTS表达盒、所述AtCPRl表达盒和所述PgDDS表达盒。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于:所述SynPgPPDS表达盒由所述SynPgPPDS的编码基因、启动所述SynPgPTOS的编码基因转录的启动子Ptef1、终止所述SynPgPPDS的编码基因转录的终止子T.组成；所述启动子Ptefi为酿酒酵母翻译延伸因子I基因的启动子，所述终止子Tctci为酿酒酵母细胞色素Cl基因的终止子； 所述SynPgPPTS表达盒由所述SynPgPPTS的编码基因，启动所述SynPgPPTS的编码基因转录的启动子Pfbai和终止所述SynPgPPTS的编码基因转录的终止子Ttdh2组成；所述启动子Pfbai为酿酒酵母果糖-1，6- 二磷酸醛缩酶基因的启动子，所述终止子Ttdh2为酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶2基因的终止子； 所述AtCPRl表达盒由所述AtCPRl的编码基因，启动所述AtCPRl的编码基因转录的启动子Ptdh3和终止所述AtCPRl的编码基因转录的终止子Ttpii组成；所述启动子Ptdh3为酿酒酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶3基因的启动子，所述终止子Ttpii为酿酒酵母磷酸丙糖异构酶基因的终止子； 所述PgDDS表达盒由所述PgDDS的编码基因，启动所述PgDDS的编码基因转录的启动子Prcn和终止所述PgDDS的编码基因转录的终止子Tadhi组成；所述启动子Praa为酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因的启动子，所述终止子Tadhi为酿酒酵母乙醇脱氢酶基因I(ADHl)的终止子。
11.根据权利要求8、9或10所述的方法，其特征在于:所述产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇的重组酿酒酵母菌为权利要求1所述的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
12.由权利要求8-10中任一所述的方法构建的产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇的重组酿酒酵母菌。
13.权利要求1所述的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、或权利要求12所述的产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇的重组酿酒酵母菌在生产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇中的应用，或在生产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇这三种物质中两种或一种物质中的应用。
14.权利要求7所述的产齐墩果酸和β-香树脂的重组酿酒酵母菌在生产齐墩果酸和/或β_香树脂中的应用。
15.权利要求2所述的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)在生产β-香树脂中的应用。
【文档编号】C12P33/00GK103484389SQ201310399947
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月5日 优先权日:2013年9月5日
【发明者】张学礼, 戴住波, 王贝贝, 刘怡, 施明雨, 王冬 申请人:中国科学院天津工业生物技术研究所