一种甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性检测方法，包括如下步骤：(1)α-丁酮酸对照品溶液的制备；(2)供试品溶液的制备；(3)酶解反应；(4)α-丁酮酸含量的测定；本发明是以药物质量分析的标准，增加α-丁酮酸作为对照物质，通过方法学的验证，得到一种精密度很好的MGL酶活的检测方法，采用该方法可以在半自动或全自动的紫外分光光度计上使用，而且灵敏度高，特异性强，操作简单，因而可以得到切实的推广使用。
【专利说明】-种甲硫氨酸Y-裂解酶酶活性的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药【技术领域】，具体涉及一种甲硫氨酸裂解酶酶活性检测方 法。
【背景技术】
[0002] 甲硫氨酸Y-裂解酶（MethionineY-lyase;E4. 4. 1. 11)简称MGL，是一种磷酸批 哆醛（PLP)依赖酶，属于蛋白家族。它能催化L-甲硫氨酸的消除反应生成甲硫醇、 氨和a-丁酮酸。此外，MGL还能催化L-半胱氨酸及其衍生物的a，消除反应及@取 代反应。MGL是生物体内甲硫氨酸代谢调控的关键酶，在含硫氨基酸的代谢中发挥着重要的 作用。肿瘤细胞对甲硫氨酸的需求非常旺盛，缺乏该氨基酸的情况下多种肿瘤细胞生长停 止，而正常的细胞在甲硫氨酸缺乏下仍然正常。有学者在体外细胞培养试验及动物体内试 验证明MGL对肺癌、结肠癌、肾癌、等甲硫氨酸依赖性肿瘤具有抗肿瘤作用，并通过I期临 床试验，证明其具有用于临床的安全性和可靠性。与传统化疗方法相比，MGL作为新型抗肿 瘤药物具有肿瘤特异性高，毒副作用小等特点，显示出巨大的临床应用潜力。作为一种极具 潜力开发成抗肿瘤药物的酶类，其最重要的酶活力指标的准确测定变得十分重要。
[0003] 目前，国内外检测MGL酶活力的方法主要有两种：一是采用检测生成物氨的方法 测定酶活，即在MGL作用于底物后产生氨，依据a-酮戊二酸+NH/+NADH-谷氨酸+NAD+反 应中NADH的消耗速率与NH3生成浓度呈正比的原理，利用自动生化监测分析仪直接测定反 应液中氨的含量，计算出酶活；二是采用检测生成物a- 丁酮酸的方法测定酶活，即在MGL 作用于底物产生a- 丁酮酸，a- 丁酮酸与3-甲基-2-苯并噻唑酮腙（MBTH)反应，测定生 成物的吸光值，用分光光度法计算a- 丁酮酸的量，从而计算酶活。
[0004] 直接检测氨的方法测定MGL酶活力，方便省时，但由于本底氨浓度的原因，使测定 精度受到影响。试验发现在MGL酶液、底物溶液、水中均含氨，其中以酶液中氨含量相对较 高，故测出的酶活力往往偏高。通过检测a-丁酮酸的生成量来计算酶活的方法，虽较好 地解决了本底氨对酶活性测试的干扰，使得测量值比较准确，是目前文献里最通用的MGL 酶活测定方法。但是酶活方法本身的影响因素多且复杂，如果仅依据现有文献报道的方法 进行酶活测定来进行质量研究，由于没有对照品的参照，显然不能满足药品质量分析中对 精密度要求高的方法学要求。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术中缺乏对照品、检测方法中精密度低的缺陷，提 供了一种甲硫氨酸裂解酶酶活性检测方法；本发明增加a-丁酮酸作为对照物质，通过 方法学的验证，得到了一种精密度高的甲硫氨酸裂解酶酶活性检测方法。
[0006] 一种甲硫氨酸Y-裂解酶酶活性的检测方法，包括如下步骤：
[0007] SI:a_ 丁酮酸对照品溶液的制备
[0008] 称取a- 丁酮酸，用水配制成〇. 000025?0. 00025mol/L的溶液，作为对照品溶 液；
[0009]S2 :甲硫氨酸Y_裂解酶酶供试品溶液的制备
[0010] 称取供试品，加酶稀释液、二硫苏糖醇溶液、乙二胺四乙酸溶液、磷酸吡哆醛溶液， 配制成供试品溶液；
[0011] S3:酶解反应
[0012] 取至少两支离心管，其中一支离心管编号为N0 ;向其余各离心管中加入等量的底 物溶液和磷酸吡哆醛溶液，并于37°C预热；然后向离心管N0中加入体积为VI的三氯乙酸 溶液，同时向其它离心管中各加入体积为V2的供试品溶液，然后将这些离心管置于37°C水 浴中反应；反应结束后立即向离心管N0中加入体积为V2的供试品溶液，同时向其它离心管 中各加入体积为VI的三氯乙酸溶液，摇匀；将离心管N0作为空白反应液，其余离心管作为 酶解反应液；
[0013] 其中，所述底物溶液为由KH2P04-K2HP04缓冲液和L-甲硫氨酸组成的混合溶液；
[0014]S4:a-丁酮酸含量的测定
[0015]S41:量取步骤S3所得的空白反应液体积为V3置于离心管中，然后加入总体积为 V4的乙酸钠溶液和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物溶液，摇匀，备用；
[0016]S42:量取步骤S3所得的酶解反应液体积为V3置于离心管中，然后加入总体积为 V4的乙酸钠溶液和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物溶液，摇匀，备用；
[0017]S43:量取体积为V3的水置于离心管中，然后加入总体积为V4的乙酸钠溶液和 3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物溶液，摇匀，作为空白对照液，备用；
[0018] 将上述各离心管放置于50°C水浴中进行反应，然后冷却降温，采用紫外-可见分 光光度法，在315?325nm波长处，分别测定空白反应液、酶解反应液、a- 丁酮酸对照品溶 液的吸光度AO、At、As，并根据如下公式计算反应液中酶的效价：
【权利要求】
1. 一种甲硫氨酸Y-裂解酶酶活性的检测方法，其特征在于，包括如下步骤： 51. a - 丁酮酸对照品溶液的制备 称取a - 丁酮酸，用水配制成〇. 000025?0. 00025mol/L的溶液，作为对照品溶液； 52 :供试品溶液的制备 称取供试品，加酶稀释液、二硫苏糖醇溶液、乙二胺四乙酸溶液、磷酸吡哆醛溶液，配制 成供试品溶液； 53 :酶解反应 取至少两支离心管，其中一支离心管编号为NO ;向其余各离心管中加入等量的底物溶 液和磷酸吡哆醛溶液，并于37°C预热；然后向离心管NO中加入体积为Vl的三氯乙酸溶液， 同时向其它离心管中各加入体积为V2的供试品溶液，然后将这些离心管置于37°C水浴中 反应；反应结束后立即向离心管NO中加入体积为V2的供试品溶液，同时向其它离心管中各 加入体积为Vl的三氯乙酸溶液，摇匀；将离心管NO作为空白反应液，其余离心管作为酶解 反应液； 其中，所述底物溶液为由KH2PO4-K2HPO4缓冲液和L-甲硫氨酸组成的混合溶液； 54. a - 丁酮酸含量的测定 541 :量取步骤S3所得的空白反应液体积为V3置于离心管中，然后加入总体积为V4的 乙酸钠溶液和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物溶液，摇匀，备用； 542 :量取步骤S3所得的酶解反应液体积为V3置于离心管中，然后加入总体积为V4的 乙酸钠溶液和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物溶液，摇匀，备用； 543 :量取体积为V3的水置于离心管中，然后加入总体积为V4的乙酸钠溶液和3-甲 基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物溶液，摇匀，作为空白对照液，备用； 将上述各离心管放置于50°C水浴中进行反应，然后冷却降温，采用紫外-可见分光光 度法，在315?325nm波长处，分别测定空白反应液、酶解反应液、a - 丁酮酸对照品溶液的 吸光度AO、At、As，并根据如下公式计算反应液中酶的效价：
其中，M为反应常数，M = 2. 3C，C为a - 丁酮酸对照品溶液的浓度； F为实际称样量制备的酶液浓度与计算称样量制备的酶液浓度的比值； 取样量为MGL酶的实际称样量。
2. 根据权利要求1所述的甲硫氨酸Y-裂解酶酶活性的检测方法，其特征在于，步骤 S2中的所述供试品为甲硫氨酸Y-裂解酶或甲硫氨酸Y-裂解酶冻干粉制剂。
3. 根据权利要求1所述的甲硫氨酸Y-裂解酶酶活性的检测方法，其特征在于，步骤 S2中的所述供试品溶液中酶的配置浓度为0. 0575?0. 575U/ml。
4. 根据权利要求3所述的甲硫氨酸Y-裂解酶酶活性的检测方法，其特征在于，步骤 S2中的所述供试品溶液中酶的配置浓度为0. 3U/ml，所述M的值为0. 345。
5. 根据权利要求1或2所述的甲硫氨酸Y-裂解酶酶活性的检测方法，其特征在于，步 骤S2中的酶稀释液为pH = 8. 0、浓度为lOOmmol/L的KH2PO4-K2HPO4缓冲液。
6. 根据权利要求1或2所述的甲硫氨酸Y-裂解酶酶活性的检测方法，其特征在于，步 骤S2中的二硫苏糖醇溶液的质量体积分数为0. 01% :乙二胺四乙酸溶液的浓度为lmmol/ L ;所述磷酸吡哆醛溶液的浓度为0. 01mmol/L。
7. 根据权利要求1或2所述的甲硫氨酸Y-裂解酶酶活性的检测方法，其特征在于，步 骤S3中的KH2PO4-K2HPO4缓冲液为pH = 8. 0、浓度为lOOmmol/L的溶液，所述L-甲硫氨酸 的浓度为25mmol/L ;所述磷酸吡哆醛的浓度为0. Olmmol/L ;所述三氯乙酸溶液的质量体积 分数为50%。
8. 根据权利要求1或2所述的甲硫氨酸Y-裂解酶酶活性的检测方法，其特征在于，步 骤S4中的乙酸钠溶液为pH = 5. 0、浓度为lmol/L的溶液；所述3-甲基-2-苯并噻唑啉酮 腙盐酸盐水合物溶液的质量体积分数为0. 1%。
【文档编号】G01N21/31GK104330370SQ201410579602
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月24日 优先权日:2014年10月24日
【发明者】黎洪, 王海兵, 胡海艳, 黄魁英, 谢鹏, 夏枫耿, 高建胜, 司徒少金, 陈禧翎 申请人:广州白云山明兴制药有限公司, 广州市微生物研究所