一种水样中四环素类抗生素的检测方法与流程

本发明涉及一种抗生素的测定方法，特别是涉及一种水样中四环素类抗生素的检测方法。
背景技术：
：四环素类抗生素(Tetracyclineantibiotics，TCs)是由放线菌产生的一类广谱抗生素，包括四环素、土霉素、金霉素等，被广泛用于人类的疾病的治疗以及畜禽养殖业。由于四环素类抗生素的大量使用，且其在生物活体中的不完全代谢而被排泄至水环境中，故水环境中四环素类抗生素的量逐步积累，可能激发微生物的选择性遗传变异而导致出现抗生素耐药病原体，对环境微生物种群造成危害，并进而对水体系统产生不可逆转的破坏。现有技术中，用于检测四环素类抗生素的方法有荧光分析法、毛细管电泳法、免疫分析法、薄层色谱法、液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法等。例如高效液相色谱-质谱联用法具有分离和检测特点，被越来越多的用于四环素类抗生素残留的检测。现有公开的检测方法，对于水体中痕量或超痕量的四环素类抗生素的检测显得无能为力。现有关于四环素类残留的研究，偏重于分析检测。由于的特点，建立有效快速的分离富集技术对抗生素残留污染监控十分重要。因此，有希望开发一种能够检测水体中痕量或超痕量的四环素类抗生素的方法。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种能够检测水体中痕量或超痕量的四环素类抗生素的方法。本发明提供如下技术方案：一种水样中四环素类抗生素的检测方法，所述方法包括如下步骤：(1)样品的预处理：往水样中加入磁性材料，进行磁固相萃取；萃取结束后过滤水样得到磁性材料；往磁性材料中加入pH＝9～11的洗脱剂进行超声洗脱，形成洗脱液；将洗脱液进行滤膜过滤，得到滤液；(2)检测方法：使滤液通过高效液相色谱和串联质谱以测定滤液中的四环类抗生素；所述液相色谱的条件为：色谱柱：ZORBAXEclipsePlusC18[(3.0～5.0mm)×(100～250mm)，1.8μm]，流动相：乙腈和1％体积浓度的乙酸水溶液，柱温：25～35℃，流速：0.3～0.5mL/min，进样量：5～10μL，所述质谱条件为：干燥气温度：280～320℃，干燥气流速：1～5l/min，雾化气压力：40～45psi，毛细管电压：3000～4000V，喷嘴电压：100～2000V；所述四环素类抗生素包括选自差向四环素(ETC)、土霉素(OTC)、四环素(TC)、去甲金霉素(DMC)、金霉素(CTC)和脱水四环素(ATC)中的一种、两种或三种以上的组合。本发明提供的水样中四环素类抗生素的检测方法，在样品检测前需要先对样品进行预处理。预处理方法包括：往水样中加入磁性材料，进行磁固相萃取；萃取结束后过滤水样得到磁性材料；往磁性材料中加入pH＝9～11的洗脱剂进行超声洗脱，形成洗脱液；将洗脱液进行滤膜过滤，得到滤液。优选的是，磁性材料的用量为1～25mg磁性材料/100mL水样，洗脱剂选自pH＝9～11的氨水溶液，萃取温度为10～60℃，萃取时间为1～60min，滤膜为≤0.45μm的滤膜。本发明提供的水样中四环素类抗生素的检测方法，在样品预处理好后，通过高效液相色谱和串联质谱以测定滤液中的四环类抗生素的含量。所述液相色谱的测试条件为：色谱柱：ZORBAXEclipsePlusC18[(3.0～5.0mm)×(100～250mm)，1.8μm]，流动相：乙腈和1％体积浓度的乙酸水溶液，柱温：25～35℃，流速：0.3～0.5mL/min，进样量：5～10μL，梯度洗脱。优选的是，色谱柱：ZORBAXEclipsePlusC18(3.0mm×100mm，1.8μm)，流动相：乙腈和1％(v/v)乙酸水溶液，柱温：35℃，流速：0.3mL/min，进样体积：10μL。上述梯度洗脱，优选的是，按照下表1进行：表1所述质谱的测试条件为：干燥气温度：280～320℃，干燥气流速：1～5l/min，雾化气压力：40～45psi，毛细管电压：3000～4000V，喷嘴电压：100～2000V。优选的是，干燥气温度：300℃，干燥气流速：5l/min，雾化气压力：45psi，毛细管电压：3500V，喷嘴电压：1000V。优选的是，所述质谱的测试条件中，干燥气、雾化气和鞘气均为高纯氮气，数据采集模式：多反应检测(MRM)。本发明提供的水样中四环素类抗生素的检测方法，所述四环素类抗生素的含量按照外标法方法计算。附图说明图1为样品1中四环素类抗生素的MRM谱图，其中：1为差向四环素(ETC)，2为土霉素(OTC)。图2为样品2中四环素类抗生素的MRM谱图，其中：1为差向四环素(ETC)，2为土霉素(OTC)，3为四环素(TC)，4为脱水四环素(ATC)。图3为样品3中四环素类抗生素的MRM谱图，其中：1为土霉素(OTC)，2为脱水四环素(ATC)。图4为样品4中四环素类抗生素的MRM谱图，其中：1为差向四环素(ETC)，2为四环素(TC)。图5为样品5中四环素类抗生素的MRM谱图，其中：1为土霉素(OTC)，2为去甲金霉素(DMC)，3为金霉素(CTC)。具体实施方式下面结合具体实施例来对本发明进行进一步说明，但并不将本发明局限于这些具体实施方式。本领域技术人员应该认识到，本发明涵盖了权利要求书范围内所可能包括的所有备选方案、改进方案和等效方案。实施例1、标准溶液的配制六种1000mg·L-1四环素类抗生素的标准储备溶液：分别称取差向四环素(ETC)，土霉素(OTC)，四环素(TC)，去甲金霉素(DMC)，金霉素(CTC)，脱水四环素(ATC)各10mg(精确至0.0001g)于10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解至刻度，摇匀。各标准储备溶液均在避光、-4℃的冰箱中保存，备用。1000μg·L-1六种四环素类抗生素混合标准储备溶液：将1000mg·L-1的差向四环素(ETC)、土霉素(OTC)、四环素(TC)、去甲金霉素(DMC)、金霉素(CTC)、脱水四环素(ATC)标准储备溶液分别用甲醇逐级稀释至10mg·L-1，得到差向四环素(ETC)、土霉素(OTC)、四环素(TC)、去甲金霉素(DMC)、金霉素(CTC)和脱水四环素(ATC)标准储备溶液。各取1mL于10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解至刻度，摇匀，在避光、-4℃的冰箱中保存，备用。实施例2、样品预处理100mL水样经0.45μm滤膜除去悬浮物，并加入约1.5mg磁性材料，在40℃恒温水浴中加热搅拌15min进行磁固相萃取，使用磁铁收集萃取完全后的磁性材料，弃去萃取后的水样。然后用10mL氨水(pH＝11)超声10min进行洗脱，并在磁铁作用下收集洗脱溶液，经0.45μm滤膜过滤后，得到滤液待用。实施例3、方法的线性相关性和灵敏度按照实施例1所述的方法，准确量取适量的六种四环素混合标准溶液(1000μg·L-1)，用甲醇稀释，获得质量浓度分别为1、5、10、20、50和100μg·L-1的系列标准溶液，实验表明，六种四环素在1～100μg·L-1的质量浓度范围内定量离子的峰面积(y)与质量浓度(x)的线性关系良好，相关系数r2≥0.995，检出限(LOD，S/N＝3)和定量限(LOQ，S/N＝10)范围分别是2.44～25.21ng·L-1和8.14～84.03ng·L-1。(见表2)表2六种四环素的线性回归方程、相关系数、检出限和定量限四环素类抗生素线性回归方程相关系数(r2)检出限/(ng/L)定量限/(ng/L)差向四环素y＝26781.9x+25238.90.99759.2030.67土霉素y＝26322.5x+53807.50.99843.4911.64四环素y＝31525.8x+12857.20.99934.7815.92去甲金霉素y＝11614.6x-372.30.999125.2184.03金霉素y＝8760.0x+2799.70.999320.9869.93脱水四环素y＝25278.8x+30483.60.99672.448.14实施例4、方法的回收率和精密度在已知浓度为10μg·L-1的水样中添加标准溶液的方法进行加标回收率的测定。加入不同体积的六种四环素混标(100μg·L-1)，配制成30、50和70μg·L-1的水样进行3个水平浓度实际样品加标实验，每个样品进行6次平行实验。按样品预处理方法处理后进行HPLC-MS/MS测定，计算回收率。分别在样品处理当日不同时间点和不同处理天数进样分析(n＝6)，计算日内和日间精密度。六种四环素的加标回收率均大于80％，日内精密度和日间精密度分别小于2.5％和7.1％。方法的回收率和精密度结果见表3。从回收率数据可知，本申请提供的样品预处理方法具有较高的回收率，能够满足测试要求。表3六种四环素的回收率和精密度实施例5、高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)检测条件(1)液相色谱的测试条件为：色谱柱：ZORBAXEclipsePlusC18(3.0mm×100mm，1.8μm)；流动相：A为乙腈，B为1％(v/v)乙酸水溶液，梯度洗脱；柱温：35℃；流速：0.3mL/min；进样体积：10μL；梯度洗脱按照下表进行：表4(2)质谱的测试条件为：干燥气温度：300℃；干燥气流速：5l/min；雾化气压力：45psi；鞘气温度：250℃；鞘气流速：10l/min；毛细管电压：3500V；喷嘴电压：1000V；干燥气、雾化气和鞘气均为高纯氮气；数据采集模式：多反应检测(MRM)。实施例6、实际样品的测定按照实施例5所述高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)检测条件，对杭州市某河段中得到样品1～5中进行测试分析，确定其中四环素抗生素的残留浓度。实验数据见表5。测试谱图见附图1～5。表5废水样品中6种四环素的测定(n＝3)注：ND是未检出。由表5和附图1-5可知，本发明提供的方法能够准确测出水样中四环素类抗生素的含量，操作简便、快速、绿色环保、结果可靠、检出限低、重现性好。当前第1页1 2 3