本申请要求2014年5月12日提交的美国临时申请号61/992,214的权益，其通过引用以其全部并入本文。
背景技术：
：简单地提供下面的发明背景的描述，作为理解本发明的辅助，并且不承认其描述本发明或构成本发明的现有技术。他莫昔芬是初级处理之后激素受体阳性乳腺癌患者的处理标准品。五至十年的他莫昔芬治疗降低了这些患者中的复发和死亡的风险。可是，频繁地由于药物的令人不愉快的副作用，许多患者没有完成他们的全疗程。他莫昔芬是前体药物，其被转化为全效果的高活性的吲哚昔芬(Endoxifen)。他莫昔芬至吲哚昔芬的转化是通过依赖于遗传变异——诸如在CYP2D6(2D6)中的遗传变异——的代谢途径。虽然已经促进2D6基因型分型来预测对他莫昔芬的响应和毒性，但是对个体水平的直接关联性是有争议的。需要有效的预测对他莫昔芬的响应的方法。技术实现要素：本发明提供了用于通过质谱法——包括串联质谱法——定量样品中他莫昔芬及其代谢物的方法。在一个方面，提供了用于通过质谱法确定样品中诺吲哚昔芬(norendoxifen)的量的方法，包括(a)电离所述诺吲哚昔芬以产生通过质谱法可检测的一种或多种诺吲哚昔芬离子；(b)通过质谱法检测来自步骤的诺吲哚昔芬离子(一种或多种)的量；其中检测的离子(一种或多种)的量与所述样品中诺吲哚昔芬的量相关。在一个方面，提供了用于在单一质谱法测定中确定他莫昔芬及其代谢物的量的方法，包括(a)电离所述他莫昔芬和代谢物以产生通过质谱法可检测的一种或多种离子；(b)通过质谱法检测来自步骤的离子(一种或多种)的量；其中检测的离子(一种或多种)的量与所述样品中他莫昔芬和代谢物的每种的量相关。在一些实施方式中，所述代谢物包括诺吲哚昔芬。在一些实施方式中，所述代谢物包括吲哚昔芬或N-去甲基(Desmethyl)-4-羟基他莫昔芬。在一些实施方式中，所述代谢物包括4’-羟基他莫昔芬。在一些实施方式中，所述代谢物包括4-羟基他莫昔芬。在一些实施方式中，所述代谢物包括N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬。在一些实施方式中，所述代谢物包括N-去甲基他莫昔芬。在一些实施方式中，所述代谢物包括选自诺吲哚昔芬、吲哚昔芬、4’-羟基他莫昔芬、4-羟基他莫昔芬、N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬和N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的代谢物。在一些实施方式中，所述代谢物包括诺吲哚昔芬、吲哚昔芬、4’-羟基他莫昔芬、4-羟基他莫昔芬、N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬的任意组合。在一些实施方式中，所述代谢物包括诺吲哚昔芬、吲哚昔芬、4’-羟基他莫昔芬、4-羟基他莫昔芬、N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬和N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬。在一些实施方式中，所述代谢物包括诺吲哚昔芬、吲哚昔芬、4’-羟基他莫昔芬、4-羟基他莫昔芬、N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬的任意组合。在一个方面，本文中提供的方法包括蛋白沉淀。在一些实施方式中，本文中提供的方法包括纯化。在一些实施方式中，所述纯化包括过滤。在一些实施方式中，所述纯化包括液相色谱法。在一些实施方式中，所述液相色谱法是高压液相色谱法(HPLC)。在一些实施方式中，本文中提供的方法包括检测内标的量。在一些实施方式中，所述内标是氘代的诺吲哚昔芬。在一些实施方式中，电离是通过大气压化学电离(APCI)。在一些实施方式中，所述电离是以正离子模式。在一些实施方式中，电离是通过电喷雾电离(ESI)。在一些实施方式中，所述电离是以正离子模式。在一些实施方式中，所述样品是血清样品。在一些实施方式中，质谱法是串联质谱法。在一个方面，本文中提供了用于通过确定他莫昔芬或一种或多种他莫昔芬代谢物的量来预测患者中他莫昔芬响应的方法。在一些实施方式中，高数量的一种或多种他莫昔芬或他莫昔芬代谢物指示对患者中他莫昔芬的正响应。在一些实施方式中，所述代谢物包括诺吲哚昔芬。在一些实施方式中，所述代谢物包括吲哚昔芬或N-去甲基-4-羟基他莫昔芬。在一些实施方式中，所述代谢物包括4’-羟基他莫昔芬。在一些实施方式中，所述代谢物包括4-羟基他莫昔芬。在一些实施方式中，所述代谢物包括N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬。在一些实施方式中，所述代谢物包括N-去甲基他莫昔芬。在一些实施方式中，所述代谢物包括诺吲哚昔芬、吲哚昔芬、4’-羟基他莫昔芬、4-羟基他莫昔芬、N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬和N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬。在一些实施方式中，本文中提供的方法具有通过定量限(limitofquantification)(LOQ)测量的灵敏度。在一些实施方式中，定量他莫昔芬的方法具有小于或等于5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量他莫昔芬的方法具有小于或等于4ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量他莫昔芬的方法具有小于或等于2ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量他莫昔芬的方法具有小于或等于1.5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基他莫昔芬的方法具有小于或等于5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基他莫昔芬的方法具有小于或等于4ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基他莫昔芬的方法具有小于或等于2ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基他莫昔芬的方法具有小于或等于1.5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于4ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于2ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于1.5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于1ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.4ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.2ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于4ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于2ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于1.5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于1ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.4ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.2ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于4ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于3ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于3ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于2ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于1.5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于1ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于0.5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于0.4ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于4ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于2ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于1.5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于1ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.4ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于4ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于2ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于1.5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于1.2ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于1ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于0.5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，本文中提供的方法具有通过检出限(LOD)测量的灵敏度。在一些实施方式中，检测他莫昔芬的方法具有小于或等于5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测他莫昔芬的方法具有小于或等于4ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测他莫昔芬的方法具有小于或等于2ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测他莫昔芬的方法具有小于或等于1.5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测他莫昔芬的方法具有小于或等于1ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测他莫昔芬的方法具有小于或等于0.6ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基他莫昔芬的方法具有小于或等于5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基他莫昔芬的方法具有小于或等于4ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基他莫昔芬的方法具有小于或等于2ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基他莫昔芬的方法具有小于或等于1.5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基他莫昔芬的方法具有小于或等于1ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.6ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于4ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于2ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于1.5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于1ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.4ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.2ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.1ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于4ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于2ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于1.5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于1ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.4ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.2ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.1ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于4ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于3ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于3ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于2ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于1.5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于1ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于0.5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于0.4ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于0.2ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于0.15ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于4ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于2ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于1.5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于1ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.4ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于4ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于2ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于1.5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于1.2ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于1ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于0.5ng/mL的检出限。如本文中所使用，术语“纯化(purification、purifying)”不是指从样品移除除了感兴趣的分析物(一种或多种)之外的所有材料。而是，纯化指的是相对于样品的一种或多种其他成分富集感兴趣的一种或多种分析物的量的过程。如本文中所使用，纯化不需要使分析物与所有其他成分分离。在优选实施方式中，纯化步骤或过程可以被用于移除一种或多种干扰物质，如，一种或多种将干扰方法中使用的仪器的操作的物质或可能干扰通过质谱法检测分析物离子的物质。如本文中所使用，关于定量测量——不包括离子质量的测量——的术语“大约”指的是指示的值±10％。如本文中所使用，术语“基本上所有”指的是大于50％、更优选地大于60％、更优选地大于70％、更优选地大于80％和更优选地大于90％的任意比例。如本文中所使用，术语“样品”指的是可以包含感兴趣的分析物的任何样品。如本文中所使用，术语“体液或组织”意思是可以从个体的身体分离的任意流体或组织。例如，“体液或组织”可以包括血液、血浆、血清、胆汁、唾液、尿、眼泪、汗等。如果待分析固体组织，那么其可以被加工以释放可以包含组织中存在的任意分析物的液体部分。然后可以使液体部分经历本文中描述的方法。如本文中所使用，术语“分选(sizeseparation)技术”意思是基于分子量和形状的任意一种或多种使至少一种种类与测试样品分离的任何技术(物理的或化学的)。这样的技术的实例包括但不限于过滤、色谱法和质谱法的某些方面。如本文中所使用，术语“色谱法”指的是这样的方法，其中由于化学个体围绕、越过和/或通过固定的液相或固相流动时它们的差别分配，将由液体或气体运载的化学混合物分离为成分。如本文中所使用，术语“液相色谱法”或“LC”意思是当流体均匀地浸透通过细分物质的柱或通过毛细流道时，选择性缓聚流体溶液的一种或多种成分的方法。缓聚源于当体相流体(bulkfluid)(即，流动相)相对于固定相(一种或多种)移动时，混合物在一种或多种固定相和该流体之间的分配。“液相色谱法”包括反相液相色谱法(RPLC)、高效液相色谱法(HPLC)和高湍流液相色谱法(HTLC)。如本文中所使用，术语“高效液相色谱法”或“HPLC”指的是通过在压力下迫使流动相通过固定相——通常是致密地填充柱——来增加分离程度的液相色谱法。如本文中所使用，术语“质谱法”或“MS”指的是通过它们的质量鉴定化合物的分析技术。MS指的是基于它们的m/z来过滤、检测和测量离子的方法。MS技术一般地包括(1)电离化合物以形成带电的种类(如，离子)；和(2)检测离子的分子量并计算它们的m/z。化合物可以通过任何适合的手段电离和检测。“质谱仪”一般地包括电离源和离子检测器。通常地，一种或多种感兴趣的分子被电离，并且随后离子被引入质谱仪器，在这里由于磁场和电场的组合，离子沿着空间中依赖于质量(“m”)和电荷(“z”)的路径前进。参见如，名称为“MassSpectrometryFromSurfaces”的美国专利序号6,204,500；名称为“MethodsandApparatusforTandemMassSpectrometry”的6,107,623；名称为“DNADiagnosticsBasedOnMassSpectrometry”的6,268,144；名称为“Surface-EnhancedPhotolabileAttachmentAndReleaseForDesorptionAndDetectionOfAnalytes”的6,124,137；Wright等人，ProstateCancerandProstaticDiseases2:264-76(1999)；和Merchant和Weinberger,Electrophoresis21:1164-67(2000)。如本文中所使用，术语“以正离子模式操作”指的是检测正离子的那些质谱方法。类似地，术语“以负离子模式操作”指的是检测负离子的那些质谱方法。如本文中所使用，术语“电离(ionization、ionizing)”指的是产生具有等于一个或多个电子单位的净电荷的分析物离子的方法。正离子是具有一个或多个电子单位的净正电荷的那些离子。负离子是具有一个或多个电子单位的净负电荷的那些离子。如本文中所使用，术语“电子电离”或“EI”指的是其中气态或蒸汽相的感兴趣的分析物与电子的流相互作用的方法。电子与分析物的撞击产生分析物离子，然后可以使其经历质谱法技术。如本文中所使用，术语“化学电离”或“CI”指的是其中使反应物气体(如氨)经历电子撞击，并通过反应物气体离子与分析物分子的相互作用形成分析物离子的方法。如本文中所使用，术语“快原子轰击”或“FAB”指的是其中高能原子束(通常为Xe或Ar)撞击非易挥发的样品，解吸并电离样品中包含的分子的方法。测试样品被溶解在粘性液体基质中，诸如甘油、硫代甘油、间硝基苄醇、18-冠-6冠醚、2-硝苯基辛基醚、环丁砜、二乙醇胺和三乙醇胺。对于化合物或样品的合适的基质的选择是经验方法。如本文中所使用，术语“基质辅助激光解吸电离”或“MALDI”指的是其中将非易挥发性样品暴露至激光照射的方法，其通过各种电离途径解吸并电离样品中的分析物，所述电离途径包括光致电离、质子化、脱质子化和簇衰变(clusterdecay)。对于MALDI，使样品与能量吸收基质混合，其促进分析物分子的解吸。如本文中所使用，术语“表面增强激光解吸电离”或“SELDI”指的是其中将非易挥发性样品暴露至激光照射的另一种方法，其通过各种电离途径解吸并电离样品中的分析物，所述电离途径包括光致电离、质子化、脱质子化和簇衰变。对于SELDI，样品通常被结合至优先地保留一种或多种感兴趣的分析物的表面。如在MALDI中一样，该方法也可以采用能量吸收材料来促进电离。如本文中所使用，术语“电喷雾电离”或“ESI”指的是其中使溶液沿毛细管的短长度穿过至施加高正电势或负电势的该毛细管的末端的方法。到达管的末端的溶液在溶剂蒸汽中被汽化(雾化)为溶液的非常小的液滴的射流或喷雾。该液滴的雾流动通过蒸发室，所述蒸发室被微微加热以防止凝结并蒸发溶剂。随着液滴变小，表面电荷密度增加，直到相同电荷之间的自然斥力使得离子以及中性分子被释放的时间。如本文中所使用，术语“大气压化学电离”或“APCI”指的是类似于ESI的质谱方法；然而，APCI通过在大气压下等离子体内发生的离子-分子反应产生离子。通过在喷雾毛细管和反电极之间放电保持等离子体。通常通过使用一组差别泵送的撇取器站(differentiallypumpedskimmerstages)将离子提取入质量分析仪。干燥和预加热的N2气的逆流可以被用于提高溶剂的移除。对于分析较少极性的种类，APCI中的气相电离可以比ESI更有效。如本文中所使用，术语“大气压光致电离”或“APPI”指的是质谱法的如此形式，其中分子M的光致电离的机制是光子吸附和电子喷射以形成分子M+。因为光子能量通常刚刚在电离势以上，所以分子离子较不易于离解。在许多情况中，分析样品而不需要色谱法是可能的，因此节约显著的时间和费用。在水蒸气或质子溶剂存在的情况中，分子离子可以提取H以形成MH+。如果M具有高质子亲和力，这倾向于发生。因为M+和MH+的和是恒定的，因此这不影响定量准确度。在质子溶剂中的药物化合物通常观察为MH+，而非极性化合物诸如萘或睾酮通常形成M+。Robb,D.B.,Covey,T.R.和Bruins,A.P.(2000):参见如，Robb等人，Atmosphericpressurephotoionization:Anionizationmethodforliquidchromatography-massspectrometry.Anal.Chem.72(15):3653-3659。如本文中所使用，术语“电感耦合等离子体”或“ICP”指的是其中在足够高以原子化和电离大部分元素的温度下使样品与部分电离的气体相互作用的方法。如本文中所使用，术语“场解吸”指的是其中将非易挥发性测试样品放置在电离表面并使用强电场产生分析物离子的方法。如本文中所使用，术语“解吸”指的是从表面移除分析物和/或分析物进入气态相。如本文中所使用，术语“定量限”或“LOQ”指的是测量变为定量有意义的点。在该LOQ下的分析物响应是可鉴定的、不连续的且可重现的，具有20％的精度和80％至120％的准确度。在本文中公开的方法的某些优选实施方式中，以正离子模式执行质谱法。在本文中公开的方法的某些特别优选实施方式中，使用ESI执行质谱法。在其他优选实施方式中，在样品中提供单独可检测的内标。在一个实施方式中，方法包括LC与质谱法的组合。在另一优选实施方式中，质谱法是串联质谱法(MS/MS)。上面描述的本发明的
发明内容是非限制性的，并且通过下面本发明的详细描述，以及通过权利要求，本发明的其他特征和优势将变得明显。具体实施方式描述了用于定量测量患者样品中他莫昔芬和/或其代谢物的方法。该定量测量是通过使用LC-MS/MS技术实现的。在使用LC-MS/MS之前，可以通过下面的技术或其任意部分制备样品。样品中他莫昔芬和/或其代谢物的第一纯化可以通过使用蛋白纯化、过滤或色谱法进行。可以利用任何适合的分选技术，但是在随后的实施例中，第一和第二分选技术都是通过分子量截止过滤器(molecularweightcut-offfilter)的过滤。如在随后的实施例中所讨论的，选择具有合适分子量截止的分子量截止过滤器，使得相同的过滤器可以被用于第一分选和第二分选两者也是可能的。可以单独或与其他纯化方法组合利用LC，更优选地利用HPLC，以纯化选择的分析物。该纯化与MS/MS组合，由此提供用于定量测试样品中选择的分析物的测定系统。然后，使用样品中选择的分析物的量来确定原始测试样品中他莫昔芬的量。本文中提供的定量方法具有增强的特异性并且较少经历方法学问题(诸如抗体干扰)。适合的样品可以包括任何测试样品，其可以包含感兴趣的分析物。在一些优选实施方式中，样品是生物样品；即，从任何生物来源诸如动物、细胞培养、器官培养等获得的样品。在某些优选实施方式中，从哺乳动物诸如狗、猫、马等，获得样品。特别优选的哺乳动物是灵长类动物，最优选地是人。特别优选的样品包括血液、血浆、血清、尿、唾液、眼泪、脑脊液或其他体液或组织样品。例如，这样的样品可以由患者获得；即，在用于诊断、预后或治疗疾病或病状的临床装置中展示自身的有生命的人。测试样品优选地获得自患者，例如，血清或血浆。用于质谱法的样品制备可以处理或纯化样品以获得适合于通过质谱法分析的制品。这样的纯化将通常包括色谱法，诸如液相色谱法，并且常常还可以包括在色谱法之前执行的额外的纯化过程。取决于样品的类型或色谱法的类型，可以出于该目的使用各种过程。实例包括过滤、离心、其组合等。对于色谱法，过滤是制备测试样品，尤其是生物测试样品，诸如血清或血浆的一种优选方法。通过过滤测试样品通过分子量截止过滤器以使具有高于过滤器截止的分子量的种类与具有低于过滤器截止的分子量的种类分离来进行这样的过滤。在完成(或接近完成)过滤之后保留在过滤器上的测试样品基本上不含具有低于过滤器截止的分子量的潜在干扰种类。已经描述了各种方法，包括在质谱法分析之前使用HPLC进行样品净化。参见如Taylor等人，TherapeuticDrugMonitoring22:608-12(2000)(人工沉淀血液样品，随后人工C18固相提取，注入HPLC用于在C18分析柱上进行色谱法，和MS/MS分析)；和Salm等人，Clin.Therapeutics22Supl.B:B71-B85(2000)(人工沉淀血液样品，随后人工C18固相提取，注入HPLC用于在C18分析柱上进行色谱法，和MS/MS分析)。本领域技术人员可以选择适合用于方法中的HPLC仪器和柱。色谱柱通常包括介质(即，填充材料)以促进化学部分的分离(即，分级分离)。介质可以包括微小颗粒。颗粒包括与各种化学部分相互作用的结合表面以促进化学部分的分离。一种适合的结合表面是疏水性结合表面，诸如烷基结合表面。烷基结合表面可以包括C-4、C-8或C-18结合烷基基团，优选地C-8结合基团。色谱柱包括用于接收样品的入口端口和用于排出流出液的出口端口，所述流出液包括分级分离的样品。在某些实施方式中，可以通过在如此条件下将样品施加至柱纯化分析物：其中感兴趣的分析物通过柱填充材料被可逆地保留，而一种或多种其他材料不被保留。在这些实施方式，可以采用感兴趣的分析物被柱保留的第一流动相条件，和一旦非保留的材料被清洗通过，可以随后采用第二流动相以将保留的材料从柱上移除。可选地，可以通过在如此流动相条件下将样品施加至柱来纯化分析物：其中以与一种或多种其他材料相比不同的速率洗脱感兴趣的分析物。这样的过程可以相对于样品的一种或多种其他成分富集一种或多种感兴趣的分析物的量。在一个实施方式中，将待分析的样品在入口端口处施加至柱，利用溶剂或溶剂混合物洗脱，并在出口端口处排出。可以选择不同的溶剂模型用于洗脱感兴趣的分析物。例如，可以使用梯度模式、等度模式(isocraticmode)或多型(即混合)模式来执行液相色谱法。在优选实施方式中，在具有C8固相的分析型HPLC系统上，使用HPLC级超纯水中0.2％甲酸和100％甲醇中0.2％甲酸作为流动相来执行HPLC。众多柱填充可用于样品的色谱分离，并且合适的分离方案的选择是经验方法，其依赖于样品特性、感兴趣的分析物、干扰物质的存在以及它们的特性等。市售的HPLC柱包括但不限于极性柱、离子交换(阳离子和阴离子两者)柱、疏水作用柱、苯基柱、C-2柱、C-8柱、C-18柱、和多孔聚合物上的极性涂层柱(polarcoatingonporouspolymercolumns)。在一个实施方式中，HPLC柱具有C8固相，其具有5μm(标称)的中位数粒径和的中位数粒子孔径大小。在优选实施方式中，柱尺寸为1.0mmIDx50mm长度(PhenomenexCorp.Luna5μC8(2)NewColumn50x1.0mm，Phenomenex目录号00B-4249-A0或等效物)。在色谱法期间，材料的分离通过多个变量实现，诸如洗脱剂(也称为“流动相”)的选择、梯度洗脱和梯度条件的选择、温度等。通过质谱法检测和定量在各种实施方式中，可以通过本领域技术人员已知的任何方法电离分析物。使用质谱仪执行质谱法，所述质谱仪包括离子源，用于电离分级分离的样品并产生用于进一步分析的带电的分子。在各种MS技术中使用的电离源包括但不限于电子电离、化学电离、电喷雾电离(ESI)、光子电离、大气压化学电离(APCI)、光致电离、大气压光致电离(APPI)、快原子轰击(FAB)/液体二次电离(LSIMS)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)、场电离、场解吸、热喷雾/等离子体喷雾(thermospray/plasmaspray)电离、表面增强激光解吸电离(SELDI)、电感耦合等离子体(ICP)和粒子束电离。技术人员将理解可以基于待测量的分析物、样品的类型、检测器的类型、正模式对负模式的选择等确定电离方法的选择。在优选实施方式中，通过电喷雾电离(ESI)来电离分析物，产生分析物先驱离子。在相关优选实施方式中，分析物先驱离子处于气态并且惰性碰撞气体是氩气。在样品已经被电离之后，可以分析由此产生的带正电的离子以确定m/z。用于确定m/z的适合的分析仪包括四极分析仪、离子捕获分析仪和飞行时间分析仪。可以使用若干检测模式之一来检测离子。例如，可以使用选择性离子监测模式(SIM)检测仅选择的离子，或可选地，可以使用扫描模式例如多反应监测(MRM)或选择的反应监测(SRM)检测多种离子。在优选实施方式中，使用SRM检测离子。优选地，使用四极仪器确定m/z。在“四极”或“四极离子捕获”仪器中，在振荡射频场中的离子经历与施加至电极之间的DC电势、RF信号的振幅和m/z成比例的力。可以选择电压和振幅，以便仅具有特定m/z的离子沿四极的长度行进，而所有其他离子被偏转。因此，对于注射入仪器的离子，四极仪器可以既作为“质量过滤器”又作为“质量检测器”。通过采用“串联质谱法”或“MS/MS”，可以增强MS技术的分辨率。在该技术中，可以在MS仪器中过滤由感兴趣的分子产生的先驱离子(也称作母离子)，和随后碎裂先驱离子以得到一种或多种碎片离子(也称作子离子或产物离子)，其然后在第二MS过程中分析。通过先驱离子的仔细选择，仅通过某些分析物产生的离子被送至破碎室，在那里与惰性气体的原子的碰撞产生碎片离子。因为在给定组的电离/破碎条件下先驱离子和碎片离子两者以可再现的方式产生，所以MS/MS技术可以提供非常强有力的分析工具。例如，过滤/破碎的组合可以被用于消除干扰物质，并且可以特别可用于复杂样品，诸如生物样品。另外，在技术的最近进展中，诸如基质辅助激光解吸电离耦联飞行时间分析仪(“MALDI-TOF”)允许在非常短的离子脉冲中分析毫微微摩尔水平下的分析物。组合飞行时间分析仪和串联MS的质谱仪对技术人员是已知的。另外，可以在称为“MS/MS”的方法中组合多重质谱法步骤。可以采用各种其他组合，诸如MS/MS/TOF、MALDI/MS/MS/TOF或SELDI/MS/MS/TOF质谱法。质谱仪通常给使用者提供离子扫描；即，在给定范围(如，400至1600amu)内具有具体m/z的每个离子的相对丰度。分析物测定的结果——即质谱，可以通过本领域内已知的众多方法与原始样品中分析物的量相关联。例如，假定仔细控制取样和分析参数，给定离子的相对丰度可以比对将那个相对丰度转化为原始分子的绝对量的表。可选地，分子标准品可以与样品一起运行，并基于从那些标准品产生的离子构建标准曲线。使用这样的标准曲线，可以将给定离子的相对丰度转化为原始分子的绝对量。在某些优选实施方式中，内标被用于产生标准曲线，用于计算他莫昔芬的量。产生和使用这样的标准曲线的方法在本领域内是已知的并且普通技术人员能够选择合适的内标。用于使离子的量与原始分子的量相关联的众多其他方法对本领域技术人员将是已知的。可以使用自动化机器执行方法的一个或多个步骤。在某些实施方式中，在线执行一个或多个纯化步骤，和更优选地，可以以在线方式执行所有LC纯化和质谱法步骤。在某些实施方式中，技术诸如MS/MS被用于分离先驱离子，用于进一步破碎。在这些实施方式中，碰撞活化离解(CAD)可以被用于产生碎片离子，用于进一步检测。在CAD中，先驱离子通过与惰性气体碰撞获得能量，并通过被称为“单分子分解”的方法随后破碎。充足的能量必须被沉积在先驱离子中，以致离子内的某些键可以由于增加的振动能而断裂。在可选的实施方式中，电子转移离解(ETD)可以被用于产生碎片离子。在ETD中，自由基负离子被用于将电子转移至带多电荷的肽或蛋白阳离子，导致沿肽主链的随机切割。在特别优选实施方式中，如下使用LC-MS/MS检测和/或定量分析物。使如上所述制备的富集分析物的样品经历LC。来自色谱柱的液体溶剂的流进入LC-MS/MS分析仪的加热的雾化器接口，并在接口的加热管中将溶剂/分析物混合物转化为蒸汽。包含在雾化溶剂中的分析物通过接口的电晕放电针被电离，所述接口的电晕放电针向雾化的溶剂/分析物混合物施加大电压。离子穿过仪器的孔口并进入第一四极。四极1和3(Q1和Q3)是质量过滤器，允许基于离子的m/z来选择离子(即，“先驱”离子和“碎片”离子)。四极2(Q2)是碰撞单元(cell)，在此离子被破碎。Q1选择先驱离子的具有m/z的离子。使选择的先驱离子进入碰撞室(Q2)，而具有任何其他m/z的离子与Q1的侧面碰撞并被消除。进入Q2的先驱离子可以通过与中性氩气分子碰撞利用碰撞活化离解被破碎。可选地，如果进入Q2的先驱离子是带多电荷的阳离子，那么它们可以利用电子转移离解(ETD)被破碎。使产生的碎片离子进入Q3，在此收集选择的碎片离子而消除其他离子。使用本领域已知的标准方法，普通技术人员能够鉴定可以被用于在Q3中选择的具体先驱离子的一种或多种碎片离子。特定的碎片离子是将不由具有类似分子结构的其它分子以显著的量形成的碎片离子。相反，非特定的碎片是由除期望的分析物外的分子形成的碎片离子。适合的特定碎片离子可以通过测试各种分子标准品来鉴定以确定由选择的分析物形成的碎片离子是否也由具有类似结构或特征的其他分子形成。优选地，鉴定至少一种碎片离子，其对于具有与分析物的m/z对应的m/z的离子是特定的。当离子与检测器碰撞时，它们产生电子的脉冲，其被转化为数字信号。获取的数据被中继至计算机，该计算机标绘每单位时间的离子计数。测量对应于具体离子的峰下的面积，或这样的峰的振幅，并且使面积或振幅与感兴趣的分析物的量相关联。在某些实施方式中，测量碎片离子(一种或多种)和/或先驱离子的曲线下的面积或峰的振幅以确定具有m/z的分析物的量。如上所述，基于分子内标的一种或多种离子的峰，使用校准标准曲线将给定离子的相对丰度转化为原始分析物的绝对量。然后，可以将由LC-MS/MS检测的分析物的绝对量转化为在原始测试样品中存在的分析物的绝对量。在一些实施方式中，本文中提供的方法具有通过定量限(LOQ)测量的灵敏度。在一些实施方式中，定量他莫昔芬的方法具有小于或等于5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量他莫昔芬的方法具有小于或等于4ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量他莫昔芬的方法具有小于或等于2ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量他莫昔芬的方法具有小于或等于1.5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基他莫昔芬的方法具有小于或等于5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基他莫昔芬的方法具有小于或等于4ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基他莫昔芬的方法具有小于或等于2ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基他莫昔芬的方法具有小于或等于1.5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于4ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于2ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于1.5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于1ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.4ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.2ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于4ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于2ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于1.5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于1ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.4ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.2ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于4ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于3ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于3ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于2ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于1.5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于1ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于0.5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于0.4ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于4ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于2ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于1.5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于1ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.4ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于4ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于2ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于1.5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于1.2ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于1ng/mL的定量限。在一些实施方式中，定量诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于0.5ng/mL的定量限。在一些实施方式中，本文中提供的方法具有通过检出限(LOD)测量的灵敏度。在一些实施方式中，检测他莫昔芬的方法具有小于或等于5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测他莫昔芬的方法具有小于或等于4ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测他莫昔芬的方法具有小于或等于2ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测他莫昔芬的方法具有小于或等于1.5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测他莫昔芬的方法具有小于或等于1ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测他莫昔芬的方法具有小于或等于0.6ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基他莫昔芬的方法具有小于或等于5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基他莫昔芬的方法具有小于或等于4ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基他莫昔芬的方法具有小于或等于2ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基他莫昔芬的方法具有小于或等于1.5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基他莫昔芬的方法具有小于或等于1ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.6ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于4ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于2ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于1.5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于1ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.4ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.2ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.1ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于4ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于2ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于1.5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于1ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.4ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.2ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测4-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.1ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于4ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于3ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于3ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于2ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于1.5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于1ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于0.5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于0.4ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于0.2ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)的方法具有小于或等于0.15ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于4ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于2ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于1.5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于1ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬的方法具有小于或等于0.4ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于4ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于3ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于2ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于1.5ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于1.2ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于1ng/mL的检出限。在一些实施方式中，检测诺吲哚昔芬的方法具有小于或等于0.5ng/mL的检出限。下面的实施例用来说明本发明。这些实施例决不旨在限制方法的范围。实施例实施例1：他莫昔芬及其代谢物的确定在下面的过程中，从血清提取他莫昔芬及其代谢物。将血清添加至过滤器板，然后与乙腈/IS混合，其然后形成沉淀。然后将混合物放置在正压岐管(positivepressuremanifold)上，并使有机馏分穿过至收集板。为板加盖，并然后放置在粘结系统(Cohesivesystem)上，用于注射入MS/MS上。MS以APCI-正模式。基于特有的母体-产物转变(transition)定量。色谱分离具有类似转变的那些分析物。患者准备成分特殊注释禁食/特殊饮食N/A样本收集和/或定时N/A特殊收集过程N/A其他无芳香酶抑制剂样本类型&处理试剂概括使用的校准器/标准品对于每个分析物使用12点校准。最始地，仅制造一个标准品(Std-12)，进行一系列稀释以产生剩余的标准品。标准品(#12)将被从-70℃冷冻器移出并解冻。在解冻时，标记十二个12x75mm管。向管12添加3.0mL的std-12。从该标准品开始，按照下面的表来生成标准曲线。利用每个测定生成标准曲线。将初始标准品放回-60至-90℃冷冻器。一旦已经添加这些分析物，利用生物细胞血清QS至200mL。混合，然后等分试样至15mL离心管中。标记(Std-12)，然后将管放入-60℃至-90℃冷冻器进行储存。稳定持续1年。标准品目标浓度*注意:所有浓度以ng/mL。校准曲线稀释:校准过程仪器和供应测定平台对于该测定，使用包含下面的模块的热LC/MS/MS系统：仪器供应质谱法*Z-型是监测的活性形式。预期值参考范围：他莫昔芬：12.54-233.07ng/mLN-去甲基他莫昔芬：2.59-373.96ng/mL4’-羟基他莫昔芬：0.4-6.33ng/mL4-羟基他莫昔芬：0.24-5.05ng/mLN-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)：0.93-43.19ng/mLN-去甲基-4’-羟基他莫昔芬：1.17-19.95ng/mL分析测量范围(AMR)他莫昔芬：1.47-1500ng/mLN-去甲基他莫昔芬：1.47-1500ng/mL4’-羟基他莫昔芬：0.2-200ng/mL4-羟基他莫昔芬：0.2-200ng/mLN-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)：0.39-400ng/mLN-去甲基-4’-羟基他莫昔芬：0.39-400ng/mL精度：使用低、中和高对照执行测定间(测定的范围)和测定内(1天)精度研究。所有分析物显示了在验证的范围内<12％CV。干扰物质：轻度或中度黄疸和脂血样品是可接受的。由于溶血的样品将在样品制备期间堵塞过滤器，所以它们是不可接受的。严重溶血、黄疸和脂血样品是不可接受的。临床灵敏度(LOQ)：他莫昔芬：1.47ng/mLN-去甲基他莫昔芬：1.46ng/mL4’-羟基他莫昔芬：0.2ng/mL4-羟基他莫昔芬：0.2ng/mLN-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)：0.39ng/mLN-去甲基-4’-羟基他莫昔芬：0.39ng/mL实施例2：他莫昔芬及其代谢物测定的验证该报告包含通过LC/MS/MS对他莫昔芬及其5个主相I代谢物的验证的详细概括。该测定是实验室开发的测试。方法学：从血清提取他莫昔芬及其五个主相I代谢物(N-去甲基他莫昔芬、N-去甲基-4-羟基他莫昔芬、N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬、4-羟基他莫昔芬和4’-羟基他莫昔芬)。提取物是蛋白沉淀，随后过滤。然后通过LC/MS/MS执行分析和定量。试剂盒或试剂对实验室开发的测试(LDT)的精度研究批内精度(withinrunprecision)：在一个批次内分析(10)低、中和高对照。所有QC落入可接受性标准(<20％CV)内。总精度:总精度基于在验证过程期间对所有测定的所有QC批次。可接受性基于<20％CV。所有QC落入该标准内。分析灵敏度(检出限)检出限(LOD)：通过采取低池(lowpool)(包含所有分析物)，然后顺序向下稀释(1:2)至最低可观察的水平来执行检出限(LOD)。假设线性继续至定量水平(LOQ)以下，该值以下将是最低可定量的浓度。在5天期间执行该实验。他莫昔芬＝0.59ng/mLN-去甲基他莫昔芬＝0.59ng/mL4’-羟基他莫昔芬＝0.1ng/mLN-去甲基-4’-羟基他莫昔芬＝0.5ng/mL4-羟基他莫昔芬＝0.1ng/mLN-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)＝0.15ng/mL定量限(LOQ)：对于LOQ的可接受性标准定义为CV<20％的最低浓度。为了确定LOQ，将中水平标准品向下顺序1:2稀释。他莫昔芬＝1.5ng/mLN-去甲基他莫昔芬＝1.5ng/mL4’-羟基他莫昔芬＝0.4ng/mLN-去甲基-4’-羟基他莫昔芬＝0.4ng/mL4-羟基他莫昔芬＝0.2ng/mLN-去甲基-4-羟基他莫昔芬(吲哚昔芬)＝0.4ng/mL准确度回收已知标准品：血清掺杂所有分析物至特定浓度，提取，和然后分析，一式三份。掺杂所有混合物以覆盖每个分析物的线性和治疗范围。干扰研究可接受性标准：由于潜在干扰物质造成的差异应当≤TEa/4，被认为是可接受的。溶血作用干扰：低池和高池掺杂有低、中和高浓度的溶血的RBC。提取样品，一式四份。溶血作用显示不干扰他莫昔芬或测量的代谢物。然而，由于具有自中度和高度溶血样品过滤的困难，仅有轻度溶血的样品应当被接受。脂血干扰：低池和高池掺杂有低、中和高浓度的脂血样品。提取样品，一式四份。脂血样品显示不干扰他莫昔芬或测量的代谢物。胆红素干扰：低池和高池掺杂有低、中和高浓度的胆红素。提取样品，一式四份。胆红素掺杂的样品显示不干扰他莫昔芬或测量的代谢物。实施例3：诺吲哚昔芬测定的验证该报告包含通过LC/MS/MS对诺吲哚昔芬的验证的详细概括。该测定是实验室开发的测试。使用蛋白沉淀从血清提取诺吲哚昔芬，随后过滤。然后通过LC/MS/MS执行分析和定量。试剂盒或试剂对实验室开发的测试(LDT)的精度研究批内精度：在一个批次内分析(10)低、中和高对照。所有QC落入可接受性标准(<20％CV)内。总精度:总精度基于在验证过程期间对所有测定的所有QC批次。可接受性基于<20％CV。所有QC落入该标准内。检出限(LOD)：诺吲哚昔芬＝1.2ng/mL定量限(LOQ)：诺吲哚昔芬＝1.2ng/mL准确度：回收已知标准品：血清掺杂有所有分析物至特定浓度，提取，和然后分析，一式四份。掺杂所有混合物以覆盖每个分析物的线性和治疗范围。干扰研究可接受性标准：由于潜在干扰物质造成的差异应当≤TEa/4，被认为是可接受的。溶血作用干扰：低池和高池掺杂低、中和高浓度的溶血的RBC。提取样品，一式四份。溶血作用显示不干扰诺吲哚昔芬。然而，由于具有自中度和高度溶血样品过滤的困难，仅有轻度溶血的样品应当被接受。脂血干扰：低池和高池掺杂低、中和高浓度的脂血样品。提取样品，一式四份。脂血样品显示不干扰诺吲哚昔芬。回收已知标准品：血清掺杂有所有分析物至特定浓度，提取，和然后分析，一式四份。掺杂所有混合物以覆盖每个分析物的线性和治疗范围。胆红素干扰：低池和高池掺杂低、中和高浓度的胆红素。提取样品，一式四份。胆红素掺杂的样品显示不干扰诺吲哚昔芬。实施例4：临床定量和响应研究实施例1-3的标准操作方案被用于定量患者样品中的他莫昔芬及其代谢物，并与他莫昔芬响应相关联。患者样品中的诺吲哚昔芬定量和响应对诺吲哚昔芬的第二组数据患者样品中的吲哚昔芬定量和响应。患者样品中的4-羟基他莫昔芬定量和响应。患者样品中的N-去甲基-4'-羟基定量和响应。患者样品中的4'-羟基他莫昔芬定量和响应。对4’-羟基他莫昔芬的第二组数据。患者样品中的N-去甲基他莫昔芬定量和响应。对N-去甲基他莫昔芬的第二组数据。患者样品中的他莫昔芬定量和响应。对他莫昔芬的第二组数据患者数据概括实施例5：额外的临床定量和响应研究实施例1-3的标准操作方案被用于定量患者样品中的他莫昔芬及其代谢物，并与他莫昔芬响应相关联。4’-羟基他莫昔芬N-去甲基他莫昔芬他莫昔芬患者数据概括本文中提到或引用的文章、专利、专利申请以及所有其它文献和可得到的电子信息的内容通过引用以它们的全部并入，如同每个单独的出版物被具体地和单独地指示通过引用被并入的同等程度。申请人保留将来自任何这样的文章、专利、专利申请或其它实体和电子文献的任意和全部材料和信息实体上并入该申请的权利。本文中说明性描述的方法可以在本文中没有具体公开的任意一个或多个要素、一个或多个限制不存在的情况下适当地实践。因此，例如，术语“包括(comprising)”、“包含(including)”、“含有(containing)”等应当宽泛而非限制性地理解。额外地，本文中采用的术语和表达已经被用作描述性的而非限制性的术语，并且非旨在使用这样的术语和表达而排除显示和描述的特征或其部分的等效形式，但是应当认识到，在要求保护的发明的范围内各种修改是可能的。因此，应当理解，尽管已经通过优选实施方式和任选的特征具体地公开了本发明，但是本文中公开的其中体现的本发明的修改和变化可以由本领域技术人员采用，并且这样的修改和变化被认为在本发明的范围内。本文中已经宽泛地和一般性地描述了本发明。落入一般公开内容的较窄种类和子属分组中的每个也构成方法的一部分。这包括具有从种类中移除任意主题的附带条件或否定限制的方法的一般描述，而不管是否删除的材料在本文中被具体陈述。其他实施方式在所附权利要求内。另外，当方法的特征或方面以马库什组描述时，本领域技术人员将认识到，本发明也由此以马库什组的任意个体成员或成员的子组描述。当前第1页1 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