专利名称：利用血清特异性蛋白质组指纹图谱诊断急性心肌梗死的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，一种利用血清特异性蛋白质组指纹图谱诊断急性心肌梗死的方法。
背景技术：
随着人类基因组大部分测序工作的完成，基因框架图已经绘就，但是，基因的功能不仅由其本身的序列决定，它给予生命的信息之多，变异之广，使患病机制成为一个极其复杂的问题，而基因功能的最终执行者是蛋白质，因此，研究蛋白质的结构和性质是揭示基因和病症链条中的最关键一环。
以往有关蛋白质的研究多采用色谱分离纯化，二维电泳，光谱，质谱定量定性等分析化学的研究技术。运用这些手段进行研究所必需的技术条件要求高，仪器昂贵，步骤繁琐，耗时冗长，不适合大规模临床筛选和检测。蛋白芯片的诞生为今天蛋白质的研究提供了一条快速发展的高速通道，它在识别特定蛋白质的表达物，进行蛋白质水平的药物筛选，揭示蛋白酶的作用，测定血清中小分子物质的含量的识别等方面，均已证实较现有技术更为迅速准确。
蛋白芯片在癌症相关蛋白的研究领域内进展最快，国外学者将前列腺癌、卵巢癌患者与非癌对照者的血清或排泄物的样本通过蛋白芯片仪进行了研究；Petricoin III EF等用C16疏水性蛋白芯片分析了66例健康妇女、50例卵巢癌患者，图谱采用534、989、2，111、2，251、2，465质荷比(M/Z)蛋白峰综合分析，灵敏度100％、特异性95％、预测准确率94％，同样的标本用CA125阳性预测值只有35％，且主要反映在年轻人组中，而CA125在良性盆腔疾病中的假阳性率亦很高。Bao-Ling Adam应用SELDI蛋白芯片系统在金属表面芯片上确定了4.475kD，5.074kD，5.382kD，7.024kD，7.82kD，8.141kD，9.149kD，9.507kD，9.656kD等九个蛋白质用于检测前列腺癌，其灵敏度为83％，特异性为97％；而用PSA的灵敏度高于90％，但其特异性仅仅为25％。
目前，用于临床和正在探索的急性心肌梗死诊断方法有1.心电图心电图诊断急性心肌梗死的阳性率至多80％，其余的20％必须依靠生化标志物确诊。
2.心肌酶谱天门冬氨酸转氨酶(AST)AST在AMI发生后6～12h升高，24～48h达峰值，持续到第5天或一周降低。由于AST不具备组织特异性，血清单纯AST升高不能诊断心肌损伤。AST诊断AMI敏感性77.7％，特异性仅53.3％。敏感性不高，特异性较差，当今学术界已不主张AST用于急性心肌梗死诊断。乳酸脱氢酶(LD)及其同工酶①限制LD应用，不作为常规检查项目，对病人作个案处理，主要用于排除急性心肌梗死诊断；②在胸痛发作24h后测定LD同工酶，作为CK-MB补充；③LD出现较迟，如果CK-MB或cTn已有阳性结果，AMI诊断明确，就没有必要再检测LD和LD同工酶。肌酸激酶(CK)及其同工酶优点①快速、经济、有效，能准确诊断急性心肌梗死，是当今应用最广的心肌损伤标志物。②其浓度和急性心肌梗死面积有一定的相关，可大致判断梗死范围。③能测定心肌再梗死。□能用于判断再灌注。其缺点是①特异性较差，特别难以和骨骼肌疾病、损伤鉴别。②在急性心肌梗死发作6h以前和36h以后敏感度较低，只有CK-MB亚型可用于急性心肌梗死早期诊断。③对心肌微小损伤不敏感。
3.典型的持续的胸痛史由于血清具有取材方便，创伤小，并可连续检测的优点，因此从血清中发现并检测急性心肌梗死生物标志物将把急性心肌梗死的早期诊断提高到一个新的水平，从而最终改善急性心肌梗死患者预后。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用血清特异性蛋白质组指纹图谱诊断急性心肌梗死的方法，能够在发病初期是被诊断，大大提高急性心肌梗死患者的预后。由于血清具有取材方便，无创伤性，并可连续检测的优点，因此从血清中发现并检测急性心肌梗死早期生物标志物，将把急性心肌梗死的早期诊断提高到一个新的水平，从而最终改善急性心肌梗死的预后。
为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案所述的利用血清特异性蛋白质组指纹图谱诊断急性心肌梗死的方法，首先制取蛋白质组指纹图谱，取一定量心电图和心肌酶谱及病史确诊的急性心肌梗死患者、不稳定型心绞痛患者及正常对照人员外周血，4℃冷藏析出血清后，离心吸取血清，分装，-80℃备用；检测时按一定浓度稀释；用美国赛弗吉公司的金属芯片；置入美国赛弗吉公司飞行质谱仪，分析样品血清蛋白质组波谱；对比分析急性心肌梗死患者、不稳定型心绞痛患者及健康人员血清蛋白质组波谱，获得急性心肌梗死患者血清中特异的蛋白质波峰；将发现的血清中特异的蛋白质波峰进行组合后形成蛋白质指纹图谱，采用此指纹图谱双盲法进行临床筛选试验，确定该指纹图谱的阳性预测值、阴性预测值、灵敏度、特异度。
本发明利用血清特异性蛋白质组指纹图谱诊断急性心肌梗死，经试验结果证明，具有如下社会及经济效益本专利将为急性心肌梗死的早期发现、早期诊断提供准确、高效的检测方法。
本专利是本医疗单位在该领域的重要突破，可推广到医院做临床检测或对社区高危人群的定期监测，从而为急性心肌梗死高危人群的健康提供有利保障。
本发明大大降低医疗费用的开支，促进医疗保险制度的改革。我们粗略估算一张蛋白芯片60美元，加上前处理费20美元，可作8个样品，每个样品10美元，每检测一人80元人民币，比传统诊断方法(心电图、心肌酶谱及有无明显胸痛史等方法综合诊断才可确诊)要便宜得多，且后者难以做出早期诊断。
操作简便，成本低，可重复性好，患者痛苦小，可大幅度提高早期结直肠患者的检出率，使结直肠患者的生存期进一步延长，甚至治愈。便于对高危人群进行大规模的检测。
图面说明
图1是利用血清特异性蛋白质组指纹图谱测定的病人与正常人在质荷比为8149Da处的蛋白质含量的差别示意图如图1中所示三组8149Da蛋白质含量差异正常人质荷比为8939Da蛋白质含量明显高于不稳定型心绞痛患者和急性心肌梗死患者，而不稳定型心绞痛患者又比急性心肌梗死患者要高。经方差分析，三组蛋白质含量差异有显著性(P≤0.01)(如图3、表1)。
图2是分组示意及各节点所含样本的组成表1三组在质荷比为8149Da处蛋白质的相对含量组别 例数 蛋白质的相对含量(％)急性心肌梗死患者组 99 1.82±0.62正常人组 45 10.28±3.04不急定型心绞痛患者组 21 5.66±2.99注三组蛋白质相对含量两两比较P≤0.01。
表2用Biomarker Wizard软件分析的结果。表中M/Z为质荷比，MEAN代表均值，SD为标准差，A代表急性心梗，U代表慢性心梗，Control代表正常人。
M/Z p Mean-A SD-A Mean-U SD-UMean- SD-control control2032.1536.96E-05-0.06888 0.89498 1.7631091.8904651.0955841.7835232727.9120.6721460.7401721.042996 0.7389391.1832471.3560722.2050533162.173 1E-100.4429830.657128 2.3323771.2634921.2514091.7517113278.3510.003269 0.658231.025894 1.8792122.4195615.5779967.7870553299.8891.41E-060.5061110.477801 1.2900690.4817121.6028942.3906043435.5770.1058740.9670680.806616 1.4765781.1021191.0794511.4726313778.710.026144 -0.00280.871473 0.540105 0.11750.9371511.2775173960.6565.13E-070.3877650.787288 2.7550082.8499352.7995944.0412663978.5550.0001410.7871311.084589 4.4459725.086565 4.358415.6456474069.472 00.3999280.423519 2.1025552.0767333.7194011.5332564286.8657.51E-060.4132270.653117 8.93857111.975679.11714312.168934307.550.9549330.3963130.320043 2.1441742.893783 2.653973.9767644350.1576.04E-070.105619 0.35544 1.5782192.0678681.1502451.5015794443.447 0.188590.8963460.744744 4.3421986.4932711.9029473.0098924472.566 6.8E-09 2.834613.4546093.071762.6271266.6516523.4511514649.6378.77E-062.089348 1.45066 3.3748340.5047951.6366790.8727724826.501 02.9882082.447514 0.8977670.7790880.1963780.3103045341.1520.0043225.4145135.231692 5.4497873.3352172.2048142.1091355909.944 0 16.275511.47385 17.6733114.963773.4320593.0664335928.911 02.447913 1.69965 5.6281115.9885520.7369110.7280296440.425 0.000742.5398183.135405 0.6266760.2760760.7295980.7087516636.6760.4908934.5637475.692105 3.808367 4.19122.2126072.2644557773.986 0 7.999113.070298 15.301822.24570812.856674.9886337834.893 2E-101.2243520.502353 2.4307570.502516 1.691950.9021257928.856 01.2940750.898312 3.5593060.5051832.1032590.7729037974.906 01.2983571.101824 3.2510130.5740352.3174360.6598768130.444 01.3031441.143661 9.433544 10.964622.320617.9166758149.85 01.8174010.621524 5.6585462.99113410.282923.0411618193.728 00.6114850.384816 2.5511692.5066834.7458092.8127228311.775 00.3430310.436634 1.9350041.5767894.4631232.0389498344.41 00.2942990.262069 1.7450172.2214814.6304062.2169718443.649 00.5845480.499413 1.1040330.689893 1.824330.9109988930.443 09.5544719.028158 10.021035.95513727.4396411.212238998.735 01.7697631.485501 2.5193161.2415026.1302012.6548049134.207 01.8286161.498003 2.4465461.0797447.0312033.3110539191.512 0 0.841170.464585 2.7163132.1884113.5694571.3163899292.3180.0005057.5786495.168482 10.25679 3.504275.5326512.47405711731.315.28E-071.3392430.761362 0.9260280.4031620.6448530.302607具体实施例
利用血清特异性蛋白质组指纹图谱诊断急性心肌梗死，首先制取蛋白质组指纹图谱，取一定量心电图和心肌酶谱及病史确诊的急性心肌梗死患者、不稳定型心绞痛患者及正常对照人员外周血，4℃冷藏析出血清后，离心吸取血清，分装，-80℃备用。检测时按一定浓度稀释；采用金属芯片；置入美国赛弗吉公司飞行质谱仪，分析样品血清蛋白质组波谱；对比分析急性心肌梗死患者、不稳定型心绞痛患者及健康人员血清蛋白质组波谱，获得急性心肌梗死患者血清中特异的蛋白质波峰；将发现的血清中特异的蛋白质波峰进行组合后形成蛋白质指纹图谱，采用此指纹图谱双盲法进行临床筛选试验，确定该指纹图谱的阳性预测值、阴性预测值、灵敏度、特异度。
利用血清特异性蛋白质组指纹图谱早期诊断急性心肌梗死，其操作步骤如下1)、血清的制备融解冰冻血清并4℃，20000g离心10min；每个样品取20ml血清，分别置于1.5ml离心管中；每管加40μl U9缓冲液(含9mol/L尿素，2％CHAPS，50mmol/L Tris-HCl pH9.0)；4℃振荡20min，使蛋白变性；取20μl变性后的样品，每管加入240μl U1缓冲液(U9缓冲液9倍稀释而成)，4℃振荡30min。
2)、芯片的制备芯片的预平衡芯片每孔加100mmol/L硫酸铜50μl，室温下200rpm振荡5min，倒除硫酸铜；用去离子水冲洗5次后甩干，每孔中加入100mmol/L醋酸钠(pH4.0)50μl，室温下200rpm振荡5min；芯片每孔加入结合/洗脱缓冲液(含100mmol/L磷酸钠，500mmol/L氯化钠pH7.0)150μl，置于振荡器上，室温孵育5min后除去缓冲液，重复1次。
加样每孔加入50μl稀释好的样品，置于振荡器上，4℃孵育60min。
洗脱用150μl结合/洗脱缓冲液冲洗3次，每次振荡5min，最后1次用1mmol/L HEPES pH7.0快速冲洗加EAM在EAM(SPA)中加入75μl乙氰，75μl 1％TFA，充分振荡5min确保SPA全部溶解，离心1min；每孔分2次加SPA(1μl/次)，2次之间允许各孔风干。
3)、血清蛋白质组波谱分析设定参数分别对三组所得质谱图进行分析，共测三组有差异的蛋白质峰为38个，其中病人组与正常人组及良性病组在33处蛋白质含量存在统计学显著性。
4)、急性心肌梗死患者特异性蛋白质峰的获得99例急性心肌梗死患者与45例正常人和21例不稳定型心绞痛患者血清中蛋白质的组成，结果发现8149.84Da，4649.63Da，3778.71Da三个蛋白质组成的生物标志物可将急性心肌梗死患者与正常人及不稳定型心绞痛患者准确的分组。用这个生物标志物分析数据共产生4个终节点其中终节点1只包含急性心肌梗死患者，共99例，满足M8149.84≤3.042M代表相应蛋白质相对含量，为终节点1；终节点2只包含正常人，其41例，满足M4649.63≤2.603为终节点；终节点3只包含正常人，共4例，满足M3778.71≤0.263为终节点3；终节点4只包含变异型心绞痛，其21例，满足M3778.71≥0.263为终节点4。错误分率为0％5)、阳性预测值、阴性预测值、灵敏度、特异度的确定用BioMarker Pattern软件统计学分析三组，结果显示用这3个蛋白质组成的生物标志物进行检测，发现99/99例结急性心肌梗死患者与45/45例正常人及21/21例不稳定型心绞痛患者被正确分组，准确率为100％(165/165)。99例急性心肌梗死患者用本方法诊断为急性心肌梗死患者，45例正常人用本方法诊断为正常人，不稳定型心绞痛患者均被本方法诊断为不稳定型心绞痛患者。灵敏度和特异性分别为100％(99/99)，100％(66/66)。
6)、急性心肌梗死病程不同时期患者血清蛋白质的比较蛋白组学分析我们同时研究了急性心肌梗死病程不同时期患者血清蛋白质的变化，结直肠癌患者特异性蛋白质峰的获得分析急性心肌梗死病程不同时期患者血清中蛋白质的组成，结果发现6637.82Da，4470.70Da，8930.44Da，4826.50Da，6440.42Da五个蛋白质组成的生物标志物可将急性心肌梗死病程不同时期患者准确的分组。用这个生物标志物分析数据共产生8个终节点(图2)其中终节点1只包含急性心肌梗死患者入院后9小时血清标本，共25例，满足M6637.82≤1.633和M4470.70≤1.877(M代表相应蛋白质相对含量，下同)为终节点1；终节点2只包含急性心肌梗死患者刚入院血清标本，其45例，满足M6637.82≤1.633和M4470.70≥1.877为终节点2；终节点3只包含急性心肌梗死患者入院后48小时血清标本，共10例，满足M4470.70≤0.701为终节点3；终节点4只包含急性心肌梗死患者入院后12小时血清，其24例，满足M4470.70≥0.701为终节点4；终节点5只包含心肌梗死患者入院后6小时血清标本，共2例，满足M6440.42≤1.761为终节点5；终节点6只包含心肌梗死患者入院后3小时血清标本，共12例，满足M6440.42≥1.761为终节点6；终节点7只包含心肌梗死患者入院后6小时后血清标本，共20例，满足M4826.50≥5.114为终节点7；终节点8只包含心肌梗死患者入院后24小时后的血清标本，共16例，满足M6637.82≥14.956为终节点8。错误分率为0％。
7)、实验的重复性从我们的试验结果看，SELDI-TOF-MS方法[4，5，6]的重复性很好，实验结果可靠，两样品孔测定的结果满足。y＝0.9865x+0.098；R2＝0.9583。
权利要求
1.一种用利用血清特异性蛋白质组指纹图谱诊断急性心肌梗死的方法，其特征在于所述的指纹图谱诊断急性心肌梗死的方法，首先制取蛋白组模板，取一定量心电图和心肌酶谱诊断为急性心肌梗死、不稳定型心绞痛患者及正常对照人员外周血，4℃冷藏析出血清后，离心吸取血清，分装，-80℃备用；检测时按一定浓度稀释；用美国赛弗吉公司的金属芯片，置入美国赛弗吉公司飞行质谱仪，分析样品血清蛋白质组波谱；对比分析急性心肌梗死、不稳定型心绞痛患者及健康人员血清蛋白质组波谱，获得急性心肌梗死患者血清中特异的蛋白质波峰；将发现的血清中特异的蛋白质波峰进行组合后形成蛋白质模板，采用此模板双盲法进行临床筛选试验，确定该指纹图谱的阳性预测值、阴性预测值、灵敏度、特异度。
2.实施如权利要求1所述的用血清特异性蛋白质组指纹图谱早期诊断诊断急性心肌梗死的方法，其特征在于所述诊断急性心肌梗死，其操作步骤如下1)、血清的制备融解冰冻血清并4℃，20000g离心10min；每个样品取20ml血清，分别置于1.5ml离心管中；每管加40μl U9缓冲液(含9mol/L尿素，2％CHAPS，50mmol/L Tris-HCl pH9.0)；4℃振荡20min，使蛋白变性；取20μl变性后的样品，每管加入240μl U1缓冲液(U9缓冲液9倍稀释而成)，4℃振荡30min。2)、芯片的制备芯片的预平衡芯片每孔加100mmol/L硫酸铜50μl，室温下200rpm振荡5min，倒除硫酸铜；用去离子水冲洗5次后甩干，每孔中加入100mmol/L醋酸钠(pH4.0)50μl，室温下200rpm振荡5min；芯片每孔加入结合/洗脱缓冲液(含100mmol/L磷酸钠，500mmol/L氯化钠pH7.0)150μl，置于振荡器上，室温孵育5min后除去缓冲液，重复1次。加样每孔加入50μl稀释好的样品，置于振荡器上，4℃孵育60min。洗脱用150μl结合/洗脱缓冲液冲洗3次，每次振荡5min，最后1次用1mmol/L HEPES pH7.0快速冲洗加EAM在EAM(SPA)中加入75μl乙氰，75μl1％TFA，充分振荡5min确保SPA全部溶解，离心1min；每孔分2次加SPA(1μl/次)，2次之间允许各孔风干。3)、血清蛋白质组波谱分析设定参数分别对三组所得质谱图进行分析，共测三组有差异的蛋白质峰为38个，其中病人组与正常人组及良性病组在33处蛋白质含量存在统计学显著性。4)、急性心肌梗死患者特异性蛋白质峰的获得99例急性心肌梗死患者与45例正常人和21例不稳定型心绞痛患者血清中蛋白质的组成，结果发现8149.84Da，4649.63Da，3778.71Da三个蛋白质组成的生物标志物可将急性心肌梗死患者与正常人及不稳定型心绞痛患者准确的分组。用这个生物标志物分析数据共产生4个终节点其中终节点1只包含急性心肌梗死患者，共99例，满足M8149.84≤3.042M代表相应蛋白质相对含量，为终节点1；终节点2只包含正常人，其41例，满足M4649.63≤2.603为终节点；终节点3只包含正常人，共4例，满足M3778.71≤0.263为终节点3；终节点4只包含变异型心绞痛，其21例，满足M3778.71≥0.263为终节点4，错误分率为0％5)、阳性预测值、阴性预测值、灵敏度、特异度的确定用BioMarker Pattern软件统计学分析三组，结果显示用这3个蛋白质组成的生物标志物进行检测，发现99/99例结急性心肌梗死患者与45/45例正常人及21/21例不稳定型心绞痛患者被正确分组，准确率为100％；99例急性心肌梗死患者用本方法诊断为急性心肌梗死患者，45例正常人用本方法诊断为正常人，不稳定型心绞痛患者均被本方法诊断为不稳定型心绞痛患者；灵敏度和特异性分别为100％，100％。6)、急性心肌梗死病程不同时期患者血清蛋白质的比较蛋白组学分析。研究了急性心肌梗死病程不同时期患者血清蛋白质的变化，结直肠癌患者特异性蛋白质峰的获得分析急性心肌梗死病程不同时期患者血清中蛋白质的组成，结果发现6637.82Da，4470.70Da，8930.44Da，4826.50Da，6440.42Da五个蛋白质组成的生物标志物可将急性心肌梗死病程不同时期患者准确的分组。用这个生物标志物分析数据共产生8个终节点其中终节点1只包含急性心肌梗死患者入院后9小时血清标本，共25例，满足M6637.82≤1.633和M4470.70≤1.877M代表相应蛋白质相对含量，为终节点1；终节点2只包含急性心肌梗死患者刚入院血清标本，其45例，满足M6637.82≤1.633和M4470.70≥1.877为终节点2；终节点3只包含急性心肌梗死患者入院后48小时血清标本，共10例，满足M4470.70≤0.701为终节点3；终节点4只包含急性心肌梗死患者入院后12小时血清，其24例，满足M4470.70≥0.701为终节点4；终节点5只包含心肌梗死患者入院后6小时血清标本，共2例，满足M6440.42≤1.761为终节点5；终节点6只包含心肌梗死患者入院后3小时血清标本，共12例，满足M6440.42≥1.761为终节点6；终节点7只包含心肌梗死患者入院后6小时后血清标本，共20例，满足M4826.50≥5.114为终节点7；终节点8只包含心肌梗死患者入院后24小时后的血清标本，共16例，满足M6637.82≥14.956为终节点8，错误分率为0％。7)、实验的重复性从我们的试验结果看，SELDI-TOF-MS方法[4，5，6]的重复性很好，实验结果可靠，两样品孔测定的结果满足。y＝0.9865x+0.098；R2＝0.9583。
全文摘要
一种用血清特异性蛋白质组指纹图谱诊断急性心肌梗死的方法，首先制取蛋白组模板，取一定量心电图和心肌酶谱诊断为急性心肌梗死、不稳定型心绞痛患者及正常对照人员外周血，4℃冷藏析出血清后，离心吸取血清，分装，－80℃备用；检测时按一定浓度稀释；用美国赛弗吉公司的金属芯片，置入美国赛弗吉公司飞行质谱仪，分析样品血清蛋白质组波谱；对比分析急性心肌梗死、不稳定型心绞痛患者及健康人员血清蛋白质组波谱，获得急性心肌梗死患者血清中特异的蛋白质波峰；将发现的血清中特异的蛋白质波峰进行组合后形成蛋白质模板，采用此模板双盲法进行临床筛选试验，确定该指纹图谱的阳性预测值、阴性预测值、灵敏度、特异度。
文档编号G01N30/88GK1588047SQ20041006044
公开日2005年3月2日 申请日期2004年7月30日 优先权日2004年7月30日
发明者高春芳, 赵光, 宋国英 申请人:高春芳