非侵入式体液压力感测的制作方法

本申请要求2014年8月13日提交的美国临时专利申请号62/037,006和2015年1月8日提交的美国临时专利申请号62/101,143的利益，所述临时专利申请通过引用以其整体并入本文中。

技术领域

本发明涉及电化学传感领域。

背景技术：

在过去的40年中，慢性压力(stress)已经与广泛和不断增长的各种人类最致命和改变生活的疾病具有越来越多的牵连。所述疾病包括严重的病症如糖尿病，阿尔茨海默氏症，心脏病发作，抑郁症，骨质疏松症和免疫抑制，以及非致命性、但仍不幸的问题如普通感冒，背痛，甚至勃起功能障碍。实际上，科技文献显示在发达国家压力对寿命预期的影响超过遗传学和行为因素例如吸烟。

鉴于压力对全球的人类生命和健康的影响巨大，在人口大规模检测和治疗压力方面具有很大的潜力。虽然压力通常被描述为主观情绪状态，但它在医学上具有重要的生化和生理效应。这些效应可以被量化，例如一组特定的激素包括糖皮质激素和儿茶酚胺的增长水平。然而，即使在升高的情况下，这些激素在眼泪、唾液和血清中的生理浓度经常极低(分别为38.9±15.5，46.3±16.0和489.7±177.4nM)，使得精确测量是持续的技术挑战。

技术实现要素：

已经制备了使用微流体泪液捕捉系统的改进的电化学传感器，以检测与压力和/或创伤有关的生物分子，例如皮质醇。另外，可以利用其他体液例如唾液或血液。

在一个实施方式中，使用零长度交联剂N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺和10mM N-羟基磺基琥珀酰亚胺将单克隆抗体共价连接至16-巯基十六烷酸官能化的金工作电极。在磷酸盐缓冲盐水(模拟泪液)中使用简单的亚铁氰化物试剂在18.73pM的检测下限和小于10％的相对标准偏差下检测皮质醇。本文中示出的皮质醇测定法以无标记且快速响应的构造保持高的重现性和极低的检测水平，具有高于眼泪皮质醇检测所足够的灵敏度。

本文公开的实施方式的这些和其他方面将在参考以下详细的说明和附图的情况下变得更清楚。

附图说明

图1.A.具有三电极系统的设备的实施方式的基本方案，所述三电极系统包括(a)Ag/AgCl参比电极，(b)感测井，(c)样品，(d)Au工作电极，(e)GDE和(f)Pt对电极。注意所有材料是示例性的并且可以被其他适合的材料所代替。另外，示意性地描绘了与该设备呈可操作连接的可多路复用的电化学阻抗光谱术(multiplexible electrochemical impedance spectroscopy)(MEIS)系统。B.具有靶(a)皮质醇的样品被放置在金工作电极表面上的共价固定单克隆抗体(MAb)的表面上的感测井内，其中利用16-MHDA(c)和EDC/NHS将MAb(b)共价固定在金表面(d)上。样品中的皮质醇(a)靶与MAb结合。

图2.在皮质醇靶溶液中运行九种不同的MAb固定的电极的尼奎斯特(Nyquist)图，所述皮质醇靶溶液为：(a)0pg/ml，(b)1pg/ml，(c)5pg/ml，(d)10pg/ml，(e)50pg/ml，(f)100pg/ml，(g)500pg/ml，(h)1000pg/ml，(i)5000pg/ml，和(j)10000pg/ml，在具有100mM亚铁氰化钾氧化还原探针的PBS缓冲液中。

图3A描绘了从浓度梯度，相对于频率得到和绘制的(a)斜率和(b)R平方(拟合的密封性)的计算以确定检测的最佳频率。

图3B.使用了在1.184Hz下的阻抗并且在生理范围以及超出生理范围的范围上相对于PBS中的皮质醇的浓度绘图，显示传感器的动态范围(n＝3)。在最高浓度方差处观察到31.672欧姆/pg/ml的斜率，R2为0.9532，RSD为10％。

图4.A.具有三电极系统的设备的实施方式的基本方案，所述三电极系统包括(a)Ag/AgCl参比电极，(b)感测井，(c)样品，(d)Au工作电极，(e)GDE和(f)Pt对电极。注意所有材料是示例性的并且可以被其他适合的材料所代替。另外，示意性地描绘了与该设备呈可操作连接的可多路复用的电化学阻抗光谱术(MEIS)系统。B.具有靶(a)皮质醇的样品被放置在金工作电极表面上的共价固定单克隆抗体(MAb)的表面上的感测井内，其中利用16-MHDA(c)和EDC/NHS将MAb(b)共价固定在金表面(d)上。样品中的皮质醇(a)靶与MAb结合。

图5A-5I.在模拟泪液中的生物标记物的检测。用于皮质醇设备中以将测得的阻抗与皮质醇的浓度关联的校正曲线，以及显示通过本发明的设备对许多不同生物分子进行检测的图。

图6A-6F显示了血液中的生物标记物检测数据的示意图。

图7描绘了生物标记物数据的总结。

图8.皮质醇干扰物试验结果。描绘了相对于提供的标准从使用IgG抗-皮质醇抗体的ELISA测定法得到的信噪比，通常皮质醇梯度，和各分析物的在200pg/mL下的试验干扰物。

图9描绘了应用循环伏安法的压力生物标记物数据的总结。

图10描绘了应用测量电流技术的压力生物标记物数据。

图11描绘了应用SWV(方波伏安法)技术的压力生物标记物数据。

具体实施方式

虽然血液已经在历史上作为标准的诊断试验液体，但近年来由于三个主要原因，泪液作为有力的感测介质已经获得了关注。首先，泪膜包括大量的生物标记物。第二，相比从患者处获得血液来说，获得泪液相对容易，这使得泪液成为诊断试验中血液的理想替代物。最后，泪液，与唾液相似，在组成上比血液更简单，并且包括更少的可能干扰电化学感测的蛋白质。

虽然在使用泪液时具有一些缺点(例如可获得体积和靶浓度远小于血液)，但由于其更容易且更少侵入的取样和来自非靶物质的较少的背景干扰导致的更好的传感器性能的优点胜过了这些缺点，证明了泪膜是用于压力传感器的的理想诊断液体，同时仍然包括可检测水平的皮质醇。

因此，在本文公开的一个方面中，丝网印刷电极(其一个实施方式如图1A-B所示)，通过将样品带到试剂的新型微流体捕捉系统捕捉泪液样品，且被封装在传感器自身的介孔碳墨中的用于皮质醇(或在眼泪中发现的其他压力标记物)的一种或多种分子识别单元已经使用快速的、无标记且可多路复用的电化学阻抗光谱术(MEIS)得到发展，其可以用于护理/损伤的点处。分子识别单元可以包含抗体、适体、肽、合成抗体(synbody)、核酸、触手探针、蛋白质等中的一种或多种。并且，介孔碳墨已经被发现阻挡干扰物，得到更好的试验结果。

虽然压力经常被描述为主观情绪状态，但已经显示它具有重要的生化和生理效应，对人体健康具有惊人的影响。因此，通过感测生化标记物来监测压力水平在对压力管理产生惊人影响的方面具有潜力。电化学阻抗光谱术(EIS)是一种这样的感测方法，其成功地用于多种极低浓度靶的无标记检测中，所述极低浓度靶包括全细胞、蛋白生物标记物，和小分子靶。相比其他电化学方法，EIS具有的优势包括速度(每次测试90秒)、简单性(不像“夹心”测定法那样需要标记)和灵敏度(低于许多其他方法的检测限的皮摩尔-浓度靶的检测)。该无标记感测能力和极低的检测限使得EIS成为用于眼泪中皮质醇的理想的感测机制。

实施例1

将标准的三电极系统用于阻抗光谱术检测。该系统包含Ag/AgCl参比电极(CH仪器公司，奥斯汀，德克萨斯州)，金盘工作电极(GDE)(CH仪器公司，奥斯汀，德克萨斯州)，和铂对电极(CH仪器公司，奥斯汀，德克萨斯州)，抗-皮质醇抗体(Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州)共价连接到工作电极表面以检测样品溶液中的皮质醇。1000μL移液头(VWR International公司，拉德诺，宾夕法尼亚州)带有被剃刀减掉的尖端并且被紧密地安装到GDE上以形成能够盛放大约0.2ml样品液体的塑料“井”。该系统的示意图显示在图1中。

除非另外指明，将pH为7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(EMD Biosciences公司，拉霍亚，加利福尼亚州)用于制备所有溶液。为了将抗-皮质醇抗体固定到金盘电极(GDE)的表面上，将GDE首先在3μm氧化铝磨粒(CH仪器公司，奥斯汀，德克萨斯州)上进行120次8字形湿磨，并且用蒸馏水洗涤。接着利用1μm以及接下来的0.05μm的磨粒(CH仪器公司，奥斯汀，德克萨斯州)重复120次8字形打磨，之后将GDE在蒸馏水中超声20分钟。接着，将100μL的1mM 16-巯基十六烷酸(16-MHDA)(Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州)的试剂级乙醇溶液放入感测井内并且在室温下用石蜡膜密封1小时。接下来，将GDE的表面和侧面和感测井仔细地利用蒸馏水洗涤。对照EIS检测在16-MHDA-官能化的GDE上实施，使用在PBS缓冲液中的100mM亚铁氰化钾(Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州)的“氧化还原探针”以确保足够并且相似量的MHDA被固定到每个GDE上。这通过分析每个单个的GDE的阻抗响应以获得彼此的相似性来确定。

接着，将100μL包含40mM N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺(EDC)(Pierce Biotechnology公司)和10mM N-羟基磺基琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)(VWR international公司)的PBS溶液放入感测井内。在室温下温育1个小时后，将电极用PBS缓冲液洗涤。接着，将抗皮质醇IgG(Aldrich公司)在PBS缓冲液中的10μg/ml溶液的100μL液滴放在电极上并且在室温下放置1小时，接着用PBS缓冲液冲洗。最后，将100μL的1mM乙醇胺(Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州)的蒸馏水溶液加入感测井内并且在室温下温育30分钟以阻挡16-MHDA和EDC/NHS的所有未反应的羧基基团。接着将电极用PBS缓冲液仔细地洗涤并且在4℃下存放于PBS中直至使用。

电化学阻抗测量使用CHI660C电化学工作站(CH仪器公司，休斯顿，德克萨斯州)实施。在氧化还原探针溶液中制备浓度从0到10,000pg/mL(0至27.59nM)的皮质醇(Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州)样品并存放于4℃下直至使用。接着将每个皮质醇浓度在每个抗体固定电极上检测。

对于每个检测，将100μL的皮质醇和氧化还原探针溶液放置在抗体固定GDE的感测井内。施加到样品的AC电压具有5mV的振幅，式电位(DC偏移)为150mV，通过在具有氧化还原探针的裸(固定前)电极上运行CV来确定。在从1到100,000Hz的频率范围内于90秒扫描内施加AC电压，并且对于该样品在各频率下记录阻抗大小和相位。对于每个样品于尼奎斯特图中计算和绘制实部(real)和虚部(imaginary)阻抗。在每次检测后，在加入下一个样品前将GDE和感测井用PBS彻底洗涤。

对于每个电极在每个AC频率下测试，将在每个皮质醇浓度下的阻抗大小与log(浓度)关联，并计算斜率和R²。将阻抗斜率和R²值相对于频率分别绘制，从而寻找导致高斜率和R²的最佳平衡的频率。在该“最佳”频率下检测的阻抗值接着被用于产生最终的浓度梯度，从而使得能够从阻抗估测得到皮质醇浓度。

裸、固定了抗体、并结合了生物标记物(皮质醇)的电极的AC扫描产生了尼奎斯特图。结合到一个代表性电极上的9种不同浓度的皮质醇的尼奎斯特图显示于图2中。随着样品皮质醇浓度的增加，更多的皮质醇结合到电极表面上的抗体，由此在所有频率下阻抗大小增加，并将尼奎斯特图从原点进一步拉远。

如所期望的，当离体的和因此结合到抗体的生物标记物浓度增加时，通过系统检测到的阻抗(和因此得到的信号)也会增加。

阻抗对靶浓度的关联图的斜率和R²作为AC电压频率的函数而变化。一个代表性电极显示于图3a中。较大的斜率是期望的，因为它与较大的信号大小对应(在不同皮质醇浓度之间的阻抗值的较大差别)，其更容易在低的相对误差下检测。较大的R²是期望的，因为它表示在所述检测中提供的皮质醇浓度的估计值具有更高的准确度。在图3a中可以看到R²对于低于100Hz的频率范围来说是相当高的，但是斜率在非常低的频率处尤其是最好的(最大)，并且斜率随着频率增加迅速降低。对于所有被测电极来说，对于最大斜率的最佳频率被发现是1.18Hz。因此，这是评估的最佳频率，在此频率下皮质醇-抗体相互作用通过EIS被最有效地检测。

在该频率(1.18Hz)下，汇编了多个传感器的阻抗数据，并相对于响应浓度绘图，以生成阻抗梯度，如图3b所示。该梯度显示了该方法在检测泪液中极低浓度的皮质醇方面的无可挑剔的准确度。从检测下限(LLD)的标准分析定义，即3.3*斜率除以标准偏差，在每个样品90秒检测时间下确定了6.79pg/mL(18.73pM)的LLD。这以高准确度清楚地鉴定了所测眼泪的皮质醇水平，并且在每个浓度下传感器间的差异＜10％。

18.73pM的LLD比泪液中约40nM的典型皮质醇浓度范围低三个整数量级，这乍一看对于泪液感测应用似乎是非常高的灵敏度水平。但实际上，这种超灵敏检测正是使该皮质醇测定法可从实验室转变为物理真实世界传感器装置所需要的。可重现和可靠的传感器需要不仅在电化学测定法而且在物理装置实现中的小的差异。眼泪样品大小不太可能超过10微升体积，因为没有很多泪液可以被收集，并且一些体积将不可避免地由于粘附到将样品从眼表面带到感测电极所需的采样系统或其他流体装置的壁而损失。

结果是，确保在电化学感测区域(官能化的电极)中的一致的可重现体积的液体在没有增加体积-通过已知系数(其可以接着被考虑以计算原始样品浓度)稀释靶浓度的情况下是极度困难的。另外，眼泪不包括高浓度的氧化还原中介物，例如亚铁氰化物，其在电化学工作中是需要的。因此，对于实际的传感器装置来说以下是困难的：避免用另外的试剂稀释40nM左右的皮质醇，以便将总液体体积增加到确保每次均能够达到官能化的电极区域的一致体积的可工作量，并且提供用于传感器电化学的足够的中介物浓度。为此，商业上可行的泪液皮质醇传感器必须提供不在1-100nM范围内，而是在低于10nM范围(例如当具有不正常低的皮质醇水平的样品被设备在处理过程中甚至进一步稀释)内的可重复测量。

这正是本文提出的基于EIS的测定法所允许的。具有低于0.02nM的LLD，具有40nM皮质醇的10μL眼泪样品可以被稀释100x，并且仍然良好地处在基于EIS的皮质醇传感器的线性范围内。此处所示的皮质醇测定法因此更能够满足辨别眼泪中低皮质醇浓度的技术挑战。

在该工作中，非常低浓度的皮质醇的检测通过使用简单的且无标记的基于EIS的生物传感器被证明具有重现性和高灵敏度。复制的传感器组件在1.184Hz处具有最佳结合，具有重现性，具有在10％相对标准偏差下的最高变异性。匹配程度被检测为0.9532，具有31.672欧姆/pg/mL的响应率和18.73pM的检测下限。该工作表明对皮质醇水平的微小变化可以准确和快速的测量，即使少到如通常在人类泪液里发现的那些一样，也是在技术上可行的；即使在考虑为了重现性性能，可能需要进一步稀释已经低浓度的靶的物理传感器设计的实用性之后，其也是可行的。

在本文公开的另一个方面中，丝网印刷电极(其一个实施方式如图4所示)，通过将样品带到试剂的新型微流体捕捉系统捕捉体液样品，且被封装在传感器自身的介孔碳墨中的用于皮质醇(或在液体中发现的其他压力标记物)的一种或多种分子识别单元已经使用快速的、无标记且可多路复用的电化学阻抗光谱术(MEIS)得到发展，其可以用于护理/损伤的点处。虽然在该实施方式中使用了泪液，但血液也可以被使用，如图6中所示。

分子识别单元可以包含抗体、适体、肽、合成抗体、核酸、触手探针、蛋白质等中的一种或多种。并且，介孔碳墨已经被发现阻挡干扰物，得到更好的试验结果。

实施例2

虽然以下实施例是用于皮质醇的检测，但类似的方案被用于检测其他目标生物分子。泪液或血液被用于该实施例，但是也可以使用其他体液。

将标准的三电极系统用于阻抗光谱术检测。该系统包含Ag/AgCl参比电极(CH仪器公司，奥斯汀，德克萨斯州)，金盘工作电极(GDE)(CH仪器公司，奥斯汀，德克萨斯州)，和铂对电极(CH仪器，奥斯汀，德克萨斯州)，抗-皮质醇抗体(Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州)共价连接到工作电极表面以检测样品溶液中的皮质醇。1000μL移液头(VWR International公司，拉德诺，宾夕法尼亚州)带有被剃刀减掉的尖端并且被紧密地安装到GDE上以形成能够盛放大约0.2ml样品液体的塑料“井”。该系统的示意图显示在图4中。

除非另外指明，将pH为7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(EMD Biosciences公司，拉霍亚，加利福尼亚州)用于制备所有溶液。为了将抗-皮质醇抗体固定到金盘电极(GDE)的表面上，将GDE首先在3μm氧化铝磨粒(CH仪器公司，奥斯汀，德克萨斯州)上进行120次8字形湿磨，并且用蒸馏水洗涤。接着利用1μm以及接下来的0.05μm的磨粒(CH仪器公司，奥斯汀，德克萨斯州)重复120次8字形打磨，之后将GDE在蒸馏水中超声20分钟。接着，将100μL的1mM 16-巯基十六烷酸(16-MHDA)(Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州)的试剂级乙醇溶液放入感测井内并且在室温下用石蜡膜密封1小时。接下来，将GDE的表面和侧面和感测井仔细地利用蒸馏水洗涤。对照EIS检测在16-MHDA-官能化的GDE上实施，使用在PBS缓冲液中的100mM亚铁氰化钾(Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州)的“氧化还原探针”以确保足够且相似量的MHDA被固定到每个GDE上。这通过分析每个单个的GDE的阻抗响应以获得彼此的相似性来确定。

接着，将100μL包含40mM N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺(EDC)(Pierce Biotechnology公司)和10mM N-羟基磺基琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)(VWR international公司)的PBS溶液放入感测井内。在室温下温育1个小时后，将电极用PBS缓冲液洗涤。接着，将抗皮质醇IgG(Aldrich公司)在PBS缓冲液中的10μg/ml溶液的100μL液滴放在电极上并且在室温下放置1小时，接着用PBS缓冲液冲洗。最后，将100μL的1mM乙醇胺(Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州)的蒸馏水溶液加入感测井内并且在室温下温育30分钟以阻挡16-MHDA和EDC/NHS的所有未反应的羧基基团。接着将电极用PBS缓冲液仔细地洗涤并且在4℃下存放于PBS中直至使用。

电化学阻抗测量使用CHI660C电化学工作站(CH仪器公司，休斯顿，德克萨斯州)实施。在氧化还原探针溶液中制备浓度从0到10,000pg/mL(0至27.59nM)的皮质醇(Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州)样品并存放于4℃下直至使用。接着将每个皮质醇浓度在每个抗体固定电极上检测。

对于每个检测，将100μL的皮质醇和氧化还原探针溶液放置在抗体固定GDE的感测井内。施加到样品的AC电压具有5mV的振幅，式电位(DC偏移)为150mV，通过在具有氧化还原探针的裸(固定前)电极上运行CV来确定。在从1到100,000Hz的频率范围内于90秒扫描内施加AC电压，并且对于该样品在各频率下记录阻抗大小和相位。对于每个样品于尼奎斯特图中计算和绘制实部和虚部阻抗。在每次检测后，在加入下一个样品前将GDE和感测井用PBS彻底洗涤。

对于每个电极在每个AC频率下测试，将在每个皮质醇浓度下的阻抗大小与log(浓度)关联，并计算斜率和R²。将阻抗斜率和R²值相对于频率分别绘制，从而寻找导致高斜率和R²的最佳平衡的频率。在该“最佳”频率下检测的阻抗值接着被用于产生最终的浓度梯度，从而使得能够从阻抗估测得到皮质醇浓度。

如所期望的，当离体的和因此结合到抗体的生物标记物浓度增加时，通过系统检测到的阻抗(和因此的信号)也会增加。参见图5A-5I到图8。

在该工作中，非常低浓度的皮质醇的检测通过使用简单的和无标记的基于EIS的生物传感器被证明具有重现性和高灵敏度。复制的传感器组件在1.184Hz处具有最佳结合，具有重现性，具有在10％相对标准偏差下的最高变异性。匹配程度被检测为0.9532，具有31.672欧姆/pg/mL的响应率和18.73pM的检测下限。该工作表明即使为了重现性性能，考虑到可能需要进一步稀释已经低浓度的靶的物理传感器设计的实用性之后，准确和快速地测量皮质醇水平的微小变化，甚至是通常在人泪液中发现的那些，在技术上也是可行的。

并且，如图7总结的，许多目标生物分子可以被检测，例如皮质醇、葡萄糖、乳酸、乳铁蛋白、IgE、儿茶酚胺、S-100β、神经元特异性烯醇酶、胶质纤维蛋白和肿瘤坏死因子-α。

转到图9-11，描述了压力生物标记物数据的总结。循环伏安法(CV)是检测在电压超过能斯特方程预测的电压的条件下在电化学电池中产生的电流的电化学技术。CV通过使工作电极的电压循环实施，并且检测得到的电流。图9显示了A EP，B NE，C DA和D Cort的CV叠加(参见图中的结构)。DA、EP、Cort和NE的浓度分别是0.04M，0.04M，0.04M和0.1M。信号的最小叠加通过E表示，其中F表示信号峰的大叠加。

图10描绘了来自测量电流技术的压力生物标记物数据。在化学和生物化学中的电流分析法是基于电流或电流的变化来检测溶液中的离子。(嵌入)DA的Amp-it，其中在CV的氧化峰值处施加的电压为0.52V，在AMP-it期间在A 2秒，B 12秒，C 20秒时。外面的图是校正曲线，其中绘制了电流对DA浓度，在AMP-it期间的时间(a)、(b)和(c)处。该校准曲线在不同时间A，B和C的对数拟合分别具有0.9566、0.9547和0.9540的R²。

图11描绘了SWV(方波伏安法)技术在30Hz处用于确定EP浓度对氧化峰(0.23V)处的电流。SWV技术在20Hz处被用于确定DA浓度对氧化峰(0.22V)处的电流。SWV技术在20Hz处被用于确定NE浓度对氧化峰(0.23V)处的电流。SWV技术在15Hz处被用于确定Cort的浓度对氧化峰(0.18V)处的电流。

以上所述的实施方式不是意在限制性的。