本发明涉及一种鸭坦布苏病毒病血凝抑制试验抗原及其制备方法，涉及生物工程及免疫学领域。
背景技术：
鸭坦布苏病毒病为2010年发生的一种新发或突发传染病，主要临床特征为产蛋鸭产蛋量突然下降和商品肉鸭死淘率显著增加，自然感染和人工感染病例的主要大体病变为卵泡变形、充血、出血及脾脏体积变化(感染早期脾脏肿大，后期脾脏缩小)和颜色变黑。主要的组织学病变为淋巴细胞和网状细胞活化增生，疫情流行初期，根据主要的病理变化，将该病暂命名为“鸭出血性卵巢炎”。随后经过病毒分离鉴定和DNA序列同源性分析结果表明，引起上述鸭疫情的病毒为一种虫媒病毒，属于黄病毒科黄病毒属、Ntaya病毒群，与Tembusu病毒亲缘关系最近(Caoetal.,2011；Suetal.,2011；Yanetal.,2011)。2011年中国畜牧兽医学会首届水禽疫病防控研讨会将该病名称统一为“鸭坦布苏病毒病”，但到目前为止，尚未有国家层面关于该病命名的统一规定或者提法。值得一提的是，现有文献资料表明，鸭黄病毒病可能最早于1995年出现就在河北省石家庄、邯郸等地。温立斌等首次从腹泻和腿麻痹的病鸭肝脏、脾脏中分离到一株病毒，该病毒呈球形，大小约30nm，有囊膜的单链RNA病毒，鉴定结论为分离的病毒似乎属于黄病毒科病毒，并将该病初步命名为“鸭病毒性脑炎”。Tembusu病毒首次于1968-1970年在Sarawak地区的蚊子体内分离到，曾一度认为家禽可能是病毒的自然宿主(Plattetal.,1975)。Tembusu病毒分别于1982和1992年在泰国北部日本脑炎流行地区蚊子体内分离到(Leakeetal.,1986；Pandeyetal.,1999)。2000年，研究人员报道了一种新的名为Sitiawan的黄病毒感染鸡后能够引起鸡生长发育受阻(Konoetal.,2000)，Sitiawan病毒与Tembusu病毒核酸的同源性为92％。中国从鸭体内分离到的Tembusu病毒与Bagaza病毒的核酸高度同源(Tangetal.,2012；Yunetal.,2012)。在控制疫情所采取的手段和措施中，疫情监测、血清学诊断、疫苗免疫效果评价和实验动物筛选等工作尤为重要。到目前为止，检测鸭坦布苏病毒抗体的方法有血清中和试验(SerumNeutralizationTest，SNT)、血凝抑制试验(HemagglutinationInhibition，HI)和酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，ELISA)等，其中HI试验具有敏感、特异、简便、成本低、检测发病鸭群阳性率较高和可用于早期诊断的优势，是抗体检测的首选方法。HI试验用于流行病学调查、临床诊断和疫苗免疫效力评价等，对控制鸭坦布苏病毒病疫情起关键作用。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有抗体检测技术中没有血凝抑制试验抗原和方法的不足，提供一种鸭坦布苏病毒病血凝抑制试验抗原及制备方法，使其提供一种准确、灵敏、特异、经济和操作简单的抗体检测试剂和方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种由鸭坦布苏病毒制备的血凝抑制试验抗原。进一步的，鸭出血性卵巢炎病毒HB株，保藏号为CCTCCV201122，于2011年7月1日保藏在中国典型培养物保藏中。使用所述抗原制备的药品、试剂及试剂盒。所述抗原的制备方法，所述制备方法包括以下制备步骤：1)将鸭胚接种鸭坦布苏病毒后制备鸭胚基础毒种，鸭胚传代不超过3代；2)将鸭胚基础毒种接种乳鼠取鼠脑制备HB株毒种，鼠脑传代不超过3代；3)将HB株病毒接种2～4日龄乳鼠或C6/36细胞获得病毒液；4)灭活；5)加入保护剂。进一步的，步骤1)的具体操作方法为：取接种鸭坦布苏病毒后死亡鸭胚的尿囊液和胚体，捣碎，稀释，冻融，离心，取上清夜，测定半数致死量ELD50，并进行无菌检验，将病毒含量不低于106.0ELD50/0.1ml且无菌检验合格的毒种作为鸭胚基础毒种。进一步的，步骤2)的具体操作方法为：利用鸭胚基础毒种，以100ELD50/0.1ml的剂量经脑接种2～4日龄乳鼠，收获精神沉郁和震颤临床症状明显的鼠脑，研磨，稀释，冻融，离心，取上清夜，测定半数致死量ELD50，并进行无菌检验，将半数致死量不低于106.0ELD50/0.1ml，且无菌检验合格的毒种作为基础HB株毒种。进一步的，步骤3)HB株病毒接种2～4日龄乳鼠，取出精神沉郁、震颤等临床症状明显的鼠脑组织，去除非特异血凝抑制物获得病毒液，所述病毒液病毒含量不低于106.0ELD50/0.1ml。进一步的，去除非特异血凝抑制剂物的方法为：脑组织融化后加入终浓度为8.5％的无菌蔗糖，匀浆，在搅动状态下，将匀浆物逐滴加入丙酮中，离心去除上清液，收集沉淀冷冻干燥，加入无菌生理盐水溶解冷冻干燥后的沉淀，5000～10000g离心30～60分钟，收集上清液。进一步的，步骤3)中HB株病毒接种C6/36细胞系，当细胞出现75％CPE时收集上清液浓缩获得病毒液，所述病毒液病毒含量不低于106.0TCID50/0.1ml。进一步的，步骤4)的具体操作为：向上述病毒液中加入甲醛溶液，灭活2～3天，所述甲醛溶液浓度为37～40％，加入甲醛浓度为0.02％～0.2％；步骤5)的具体操作为：加入明胶冻干保护剂或者甘油，制备成冻干固态抗原或者液态稳定抗原。本发明的有益效果是：本发明从感染鸭坦布苏病毒的病鸭中分离鸭坦布苏病毒(HB株)，将分离病毒脑内或腹腔接种乳鼠(或C6/36细胞)培养，收获感染脑组织(或细胞液)，其中经鼠脑培养的病毒经蔗糖－丙酮处理，甲醛灭活后加适宜保护剂制成。用于鸭坦布苏病毒病抗体的检测。该抗原具有以下特点：稳定性:2～8℃存放24个月，HA效价仍不低于1:128。特异性:抗原对鸭坦布苏病毒阳性血清应为阳性反应(HI效价≥1:10)，对鸭坦布苏病毒阴性血清、鸭瘟病毒阳性血清、鸭肝炎病毒阳性血清、新城疫、禽流感病毒H5、H9亚型阳性血清均应为阴性反应(HI效价﹤1:10)。敏感性:可检测出疫苗免疫2～3周和病毒感染4～5天后鸭和鹅血清中的HI抗体。本发明的创新点：国内外尚未见有鸭坦布苏病毒病血凝抑制试验抗原的研究报道，通过我们多年和系统研究结果表明，研制的抗原稳定、特异和敏感，弥补了该体外诊断试剂的空白。本发明的技术关键点：(1)明确的基础毒种和生产毒种的代次；(2)去除病毒血凝抑制物质使病毒能够凝集红血球的工艺；(3)灭活具有感染活性病毒的工艺；(4)抗原的保存状态(液态或者冻干)。具体实施方式实施例1制备抗原用原材料：1)敏感(选择2～4日龄封闭群或近交系)乳鼠，经脑内途径、按照25μl/只(约含100ELD50)的剂量接种鸭坦布苏病毒，观察至144小时，乳鼠出现精神沉郁和震颤等临床症状，乳鼠发病率和死亡率应大于90％。2)鸭坦布苏病毒，属于黄病毒科成员，包含特定基因序列，其在GenBank登录号为JF523187，分离毒株基因序列分析结果显示，毒株与坦布苏病毒同源性最高。病毒粒子大小30～50nm，球形，有囊膜和纤突，可以凝集0.25～0.6％鹅和鸽红血球。病毒可以在封闭群或近交系鼠脑、鸡胚、鸭胚、鸭胚成纤维细胞、C6/36(白蚊伊蚊细胞)、BHK21(乳仓鼠肾细胞)和Vero(非洲绿猴肾细胞)细胞上生长。该病毒主要感染鸭、鹅和鸡等，不同日龄鸭、鹅和鸡均可以感染，但鸭和鹅感染后发病，临床症状更为明显。病毒主要侵害生殖系统、神经系统、免疫系统、呼吸系统、消化系统和泌尿系统等器官或组织，主要病变为出血性卵巢炎、坏死性睾丸炎、坏死性脾炎、间质性肝炎、间质性肺炎、间质性肾炎和非化脓性脑炎。由于病毒导致鸭脾脏损伤，淋巴细胞如CD4和CD8等坏死和流失，数量下降，造成免疫抑制，易导致其他病原微生物继发感染，死淘率增加。同时，病毒损害性成熟鸭的生殖系统，发病产蛋鸭主要表现采食量和产蛋量急剧下降，卵泡变形和出血，输卵管萎缩，公鸭睾丸和输精管萎缩。后期感染的鸭和鹅死淘率增加，产蛋率、受精率和孵化率低下。该病毒具有以下特性:鸭坦布苏病毒是ssRNA病毒，有囊膜，表面有纤突。病毒颗粒大体呈球状，直径30～50nm。鸭坦布苏病毒对外界环境的抵抗力较弱。病毒对乙醚、氯仿敏感。大多数去污剂能将它迅速灭活。在37℃条件下，用0.1％福尔马林熏蒸6h便可灭活。病毒在4℃中存放几周，在-20℃中存放几个月，其感染力不受影响。鸭出性卵巢炎病毒不能凝集成年鸡、鸭和火鸡的红细胞，可以凝集0.25～0.5％的鹅和鸽红血球。该病毒可在2～4日龄鼠脑、9～13日龄鸭胚尿囊腔、胚绒毛尿囊膜，9～10日龄鸡胚尿囊腔和胚绒毛尿囊膜、6日龄鸡胚卵黄囊和7～8日龄鸭胚卵黄囊中培养，也可在鸭胚成纤维细胞、C6/36、BHK21细胞和Vero细胞上培养。一种由鸭坦布苏病毒制备的血凝抑制试验抗原的制备方法，包括以下步骤：1)将鸭胚接种鸭坦布苏病毒后制备鸭胚基础毒种，鸭胚传代不超过3代：取接种鸭坦布苏病毒后死亡鸭胚的尿囊液和胚体，捣碎，按照W/V＝1:10的比例稀释，冻融1～2次(释放出病毒)，5000g离心30分钟，取上清液，分装，1.0ml/支。测定鸡胚半数致死量(ELD50)，并按照中国兽药典进行无菌检验。将病毒含量不低于106.0ELD50/0.1ml，且无菌检验合格的毒种作为基础毒种，鸭胚传代不超过3代(F1～F3代)。2)将鸭胚基础毒种接种乳鼠取鼠脑制备HB株毒种，鼠脑传代不超过3代：利用鸭胚基础毒种，以100ELD50/0.1ml的剂量经脑接种2～4日龄乳鼠，收获精神沉郁和震颤等临床症状明显的鼠脑。研磨后按照W/V＝1:10的比例稀释，冻融1次，5000g离心30分钟，取上清夜，分装，1.0ml/支。测定鸡胚半数致死量(ELD50)，并按照中国兽药典进行无菌检验。将鸡胚半数致死量不低于106.0ELD50/0.1ml，且无菌检验合格的毒种作为基础毒种，鼠脑传代不超过3代(F1～F3代)。3)将HB株病毒接种2～4日龄乳鼠获得病毒液：将病毒接种2～4日龄乳鼠，增殖的病毒含量应不低于106.0ELD50/0.1ml。非特异血凝抑制物(脂类物质)的去除：脑组织融化后，按照一定的W/V比例加入终浓度为无菌8.5％的蔗糖，匀浆。在搅动状态下，将匀浆物逐滴加入丙酮，抽提2次(离心去除上清液，收集沉淀冷冻干燥，加入无菌生理盐水溶解冷冻干燥后的沉淀)，5000～10000g离心30～60分钟，上清液即为不含非特异血凝抑制物的病毒液。4)灭活：向上述病毒液中加入甲醛溶液，灭活2～3天。所述甲醛溶液浓度为37～40％，加入甲醛浓度为0.02％～0.2％。5)加入保护剂：按照一定比例加入明胶冻干保护剂或者甘油，制备成冻干固态抗原或者液态稳定抗原。抗原的质量标准：无菌检验:按现行《中国兽药典》进行，应无菌生长。HA效价:按附注1进行，对0.33％鹅红细胞(附注3)的HA效价应不低于1:128。特异性检验:抗原对鸭坦布苏病毒阳性血清应为阳性反应(HI效价≥1:10)，对鸭坦布苏病毒阴性血清、鸭瘟病毒阳性血清、鸭肝炎病毒阳性血清、新城疫、禽流感病毒H5、H9亚型阳性血清均应为阴性反应(HI效价﹤1:10)。作用与用途:用于鸭坦布苏病毒抗体的检测。贮藏:2～8℃保存，有效期为24个月。规格:1ml/瓶。实施例2制备抗原用原材料：1)C6/36细胞(100TCID50/0.1ml的剂量接种长成单层的细胞，观察至120小时，细胞出现典型的CPE病变)。2)鸭坦布苏病毒，属于黄病毒科成员，包含特定基因序列，其在GenBank登录号为JF523187，分离毒株基因序列分析结果显示，毒株与坦布苏病毒同源性最高。病毒粒子大小30～50nm，球形，有囊膜和纤突，可以凝集0.25～0.5％鹅和鸽红血球。病毒可以在封闭群或近交系鼠脑、鸡胚、鸭胚、鸭胚成纤维细胞、C6/36(白蚊伊蚊细胞)、BHK21(乳仓鼠肾细胞)和Vero(非洲绿猴肾细胞)细胞上生长。该病毒主要感染鸭、鹅和鸡等，不同日龄鸭、鹅和鸡均可以感染，但鸭和鹅感染后发病，临床症状更为明显。病毒主要侵害生殖系统、神经系统、免疫系统、呼吸系统、消化系统和泌尿系统等器官或组织，主要病变为出血性卵巢炎、坏死性睾丸炎、坏死性脾炎、间质性肝炎、间质性肺炎、间质性肾炎和非化脓性脑炎。由于病毒导致鸭脾脏损伤，淋巴细胞如CD4和CD8等坏死和流失，数量下降，造成免疫抑制，易导致其他病原微生物继发感染，死淘率增加。同时，病毒损害性成熟鸭的生殖系统，发病产蛋鸭主要表现采食量和产蛋量急剧下降，卵泡变形和出血，输卵管萎缩，公鸭睾丸和输精管萎缩。后期感染的鸭和鹅死淘率增加，产蛋率、受精率和孵化率低下。该病毒具有以下特性:鸭坦布苏病毒是ssRNA病毒，有囊膜，表面有纤突。病毒颗粒大体呈球状，直径30～50nm。鸭坦布苏病毒对外界环境的抵抗力较弱。病毒对乙醚、氯仿敏感。大多数去污剂能将它迅速灭活。在37℃条件下，用0.1％福尔马林熏蒸6h便可灭活。病毒在4℃中存放几周，在-20℃中存放几个月，其感染力不受影响。鸭出性卵巢炎病毒不能凝集成年鸡、鸭和火鸡的红细胞，可以凝集0.25～0.5％的鹅和鸽红血球。该病毒可在2～4日龄鼠脑、9～13日龄鸭胚尿囊腔、胚绒毛尿囊膜，9～10日龄鸡胚尿囊腔和胚绒毛尿囊膜、6日龄鸡胚卵黄囊和7～8日龄鸭胚卵黄囊中培养，也可在鸭胚成纤维细胞、C6/36、BHK21细胞和Vero细胞上培养。一种由鸭坦布苏病毒制备的血凝抑制试验抗原的制备方法，包括以下步骤：1)将鸭胚接种鸭坦布苏病毒后制备鸭胚基础毒种，鸭胚传代不超过3代：取接种鸭坦布苏病毒后死亡鸭胚的尿囊液和胚体，捣碎，按照W/V＝1:10的比例稀释，冻融1～2次(释放出病毒)，5000g离心30分钟，取上清液，分装，1.0ml/支。测定鸡胚半数致死量(ELD50)，并按照中国兽药典进行无菌检验。将病毒含量不低于106.0ELD50/0.1ml，且无菌检验合格的毒种作为基础毒种，鸭胚传代不超过3代(F1～F3代)。2)将鸭胚基础毒种接种乳鼠取鼠脑制备HB株毒种，鼠脑传代不超过3代：利用鸭胚基础毒种，以100ELD50/0.1ml的剂量经脑接种2～4日龄乳鼠，收获精神沉郁和震颤等临床症状明显的鼠脑。研磨后按照W/V＝1:10的比例稀释，冻融1次，5000g离心30分钟，取上清夜，分装，1.0ml/支。测定鸡胚半数致死量(ELD50)，并按照中国兽药典进行无菌检验。将鸡胚半数致死量不低于106.0ELD50/0.1ml，且无菌检验合格的毒种作为基础毒种，鼠脑传代不超过3代(F1～F3代)。3)HB株病毒接种C6/36细胞系，当细胞出现75％CPE时收集上清液浓缩获得病毒液，所述病毒液病毒含量不低于106.0TCID50/0.1ml。。4)灭活：向上述病毒液中加入甲醛溶液，灭活2～3天。所述甲醛溶液浓度为37～40％，加入甲醛浓度为0.02％～0.2％。5)加入保护剂：按照一定比例加入明胶冻干保护剂或者甘油，制备成冻干固态抗原或者液态稳定抗原。抗原的质量标准：无菌检验:按现行《中国兽药典》进行，应无菌生长。HA效价:按附注1进行，对0.33％鹅红细胞(附注3)的HA效价应不低于1:128。特异性检验:抗原对鸭坦布苏病毒阳性血清应为阳性反应(HI效价≥1:10)，对鸭坦布苏病毒阴性血清、鸭瘟病毒阳性血清、鸭肝炎病毒阳性血清、新城疫、禽流感病毒H5、H9亚型阳性血清均应为阴性反应(HI效价﹤1:10)。作用与用途:用于鸭坦布苏病毒抗体的检测。贮藏:2～8℃保存，有效期为24个月。规格:1ml/瓶。实施例3在实施例1的基础上进一步具有优化，所用材料试剂与实施例1相同。鸭坦布苏病毒HB株(F1代)作为毒种，以25μl/只(含100ELD50)的剂量脑内接种2～4日龄KM品种乳鼠。及时取出精神沉郁、震颤等临床症状明显的鼠，置-20℃以下保存。将乳鼠取出，用碘酊消毒脑部，在无菌条件下除去脑部皮肤和脑壳，取出脑组织，置灭菌容器中。按照W/V＝1:4的比例加入终浓度为8.5％无菌的蔗糖溶液，匀浆。在搅动状态下，将匀浆物逐滴加入匀浆量10～30倍体积的冷丙酮中。500g离心5min，弃去上清液，将沉淀物用玻璃棒挤压磨碎，用与上述相同量的冷丙酮悬浮，冰浴1小时，期间用无菌玻璃棒将沉淀物挤压磨碎。500g离心5min，弃去上清液。将含有少量丙酮的沉淀物收集到无菌试管内，500g离心5min，弃去上清液，将沉淀物分装在干燥管内，-70℃冷冻1小时，真空冷冻干燥2～3小时。按照原匀浆量V/V＝1/1的比例，加入无菌生理盐水，溶解干燥的沉淀物12～24小时。8000g离心1小时，取上清液加入终浓度为0.05％的甲醛进行灭活。取6日龄SPF鸡胚10枚，经卵黄囊接种上清液，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育。24小时照胚，在24小时内死亡的鸡胚判为非特异性死亡，鸡胚非特异性死亡应不超过2枚。24小时后，每日照胚2次，观察至168小时，鸡胚全部存活，判为灭活完全。24～168小时死亡胚及时取出，收获胚体，盲传1代，如无鸡胚死亡，判为灭活完全。按体积比为3:1的比例在检验合格上清液中加入灭菌甘油，混匀后即为液态稳定抗原。稳定性:抗原2～8℃存放24个月，HA效价仍不低于1:128，HA试验的操作术式见附注1。特异性:抗原对鸭坦布苏病毒阳性血清应为阳性反应(HI效价≥1:10)，对鸭坦布苏病毒阴性血清、鸭瘟病毒阳性血清、鸭肝炎病毒阳性血清、新城疫、禽流感病毒H5、H9亚型阳性血清均应为阴性反应(HI效价﹤1:10)。HI试验的操作术式见附注2。敏感性:可检测出疫苗免疫2～3周和野毒感染4～5天后鸭、鹅血清中的HI抗体。实施例4在实施例1的基础上进一步具有优化，所用材料试剂与实施例1相同。鸭坦布苏病毒HB株(F1代)作为毒种，以25μl/只(约含100ELD50)的剂量脑内接种2～4日龄ICR品种乳鼠。及时取出精神沉郁、震颤等临床症状明显的鼠，置-20℃以下保存。将乳鼠取出，用碘酊消毒脑部，在无菌条件下除去脑部皮肤和脑壳，取出脑组织，置灭菌容器中。按照W/V＝1:4的比例加入终浓度为8.5％无菌的蔗糖溶液，匀浆。在搅动状态下，将匀浆物逐滴加入匀浆量10～30倍体积的冷丙酮中。500g离心5min，弃去上清液，将沉淀物用无菌剪子剪碎，用与上述相同量的冷丙酮悬浮，冰浴1小时，期间用无菌玻璃棒将沉淀物挤压磨碎。500g离心5min，弃去上清液。将含有少量丙酮的沉淀物收集到无菌试管内，500g离心5min，弃去上清液，将沉淀物分装在干燥管内，-70℃冷冻1小时，真空冷冻干燥2～3小时。按照原匀浆量V/V＝1/1的比例，加入无菌生理盐水，溶解干燥的沉淀物12～24小时。8000g离心1小时，取上清液加入终浓度为0.05％的甲醛进行灭活。取6日龄SPF鸡胚10枚，经卵黄囊接种上清液，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育。24小时照胚，在24小时内死亡的鸡胚判为非特异性死亡，鸡胚非特异性死亡应不超过2枚。24小时后，每日照胚2次，观察至168小时，鸡胚全部存活，判为灭活完全。24～168小时死亡胚及时取出，收获胚体，盲传1代，如无鸡胚死亡，判为灭活完全。按体积比为4:1的比例在检验合格上清液中加入明胶保护剂，冻干，即为冻干抗原。稳定性:抗原2～8℃存放24个月，HA效价仍不低于1:128，HA试验的操作术式见附注1。特异性:抗原对鸭坦布苏病毒阳性血清应为阳性反应(HI效价≥1:10)，对鸭坦布苏病毒阴性血清、鸭瘟病毒阳性血清、鸭肝炎病毒阳性血清、新城疫、禽流感病毒H5、H9亚型阳性血清均应为阴性反应(HI效价﹤1:10)。HI试验的操作术式见附注2。敏感性:可检测出疫苗免疫2～3周和野毒感染4～5天后鸭、鹅血清中的HI抗体。实施例5在实施例1的基础上进一步具有优化，所用材料试剂与实施例1相同。鸭坦布苏病毒HB株(F2代)作为毒种，以25μl/只(约含100ELD50)的剂量脑内接种2～4日龄NIH品种乳鼠。及时取出精神沉郁、震颤等临床症状明显的鼠，置-20℃以下保存。将乳鼠取出，用碘酊消毒脑部，在无菌条件下除去脑部皮肤和脑壳，取出脑组织，置灭菌容器中。按照W/V＝1:4的比例加入终浓度为无菌8.5％的蔗糖，匀浆。在搅动状态下，将匀浆物逐滴加入匀浆量10～30倍体积的冷丙酮中。500g离心5min，弃去上清液，将沉淀物用无菌剪子剪碎，用与上述相同量的冷丙酮悬浮，冰浴1小时，期间用无菌玻璃棒将沉淀物挤压磨碎。500g离心5min，弃去上清液。将含有少量丙酮的沉淀物收集到无菌试管内，500g离心5min，弃去上清液，将沉淀物分装在干燥管内，-70℃冷冻1小时，真空冷冻干燥2～3小时。按照原匀浆量V/V＝1/1的比例，加入无菌生理盐水，溶解干燥的沉淀物12～24小时。8000g离心1小时，取上清液加入终浓度为0.02％的甲醛进行灭活。取6日龄SPF鸡胚10枚，经卵黄囊接种上清液，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育。24小时照胚，在24小时内死亡的鸡胚判为非特异性死亡，鸡胚非特异性死亡应不超过2枚。24小时后，每日照胚2次，观察至168小时，鸡胚全部存活，判为灭活完全。24～168小时有死胚及时取出，收获胚体，盲传1代，如无鸡胚死亡，判为灭活完全。按体积比为3:1的比例在检验合格上清液中加入灭菌甘油，混匀后即为液态稳定抗原。稳定性:抗原2～8℃存放24个月，HA效价仍不低于1:128，HA试验的操作术式见附注1。特异性:抗原对鸭坦布苏病毒阳性血清应为阳性反应(HI效价≥1:10)，对鸭坦布苏病毒阴性血清、鸭瘟病毒阳性血清、鸭肝炎病毒阳性血清、新城疫、禽流感病毒H5、H9亚型阳性血清均应为阴性反应(HI效价﹤1:10)。HI试验的操作术式见附注2。敏感性:可检测出疫苗免疫2周和野毒感染4～5天后鸭、鹅血清中的HI抗体。实施例6在实施例1的基础上进一步具有优化，所用材料试剂与实施例1相同。鸭坦布苏病毒HB株(F2代)作为毒种，以每只25μl/只(含100ELD50)的剂量脑内接种2～4日龄CFW品种乳鼠。及时取出精神沉郁、震颤等临床症状明显的鼠，置-20℃以下保存。将乳鼠取出，用碘酊消毒脑部，在无菌条件下除去脑部皮肤和脑壳，取出脑组织，置灭菌容器中。按照W/V＝1:4的比例加入终浓度为8.5％无菌的蔗糖溶液，匀浆。在搅动状态下，将匀浆物逐滴加入匀浆量10～30倍体积的冷丙酮中。500g离心5min，弃去上清液，将沉淀物用无菌剪子剪碎，用与上述相同量的冷丙酮悬浮，冰浴1小时，期间用无菌玻璃棒将沉淀物挤压磨碎。500g离心5min，弃去上清液。将含有少量丙酮的沉淀物收集到无菌试管内，500g离心5min，弃去上清液，将沉淀物分装在干燥管内，-70℃冷冻1小时，真空冷冻干燥2～3小时。按照原匀浆量V/V＝1/1的比例，加入无菌生理盐水，溶解干燥的沉淀物12～24小时。8000g离心1小时，取上清液加入终浓度为0.02％的甲醛进行灭活。取6日龄SPF鸡胚10枚，经卵黄囊接种上清液，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育。24小时照胚，在24小时内死亡的鸡胚判为非特异性死亡，鸡胚非特异性死亡应不超过2枚。24小时后，每日照胚2次，观察至168小时，鸡胚全部存活，判为灭活完全。24～168小时有死胚及时取出，收获胚体，盲传1代，如无鸡胚死亡，判为灭活完全。按体积比为4:1的比例在检验合格上清液中加入明胶保护剂，冻干，即为冻干抗原。稳定性:抗原2～8℃存放24个月，HA效价仍不低于1:128，HA试验的操作术式见附注1。特异性:抗原对鸭坦布苏病毒阳性血清应为阳性反应(HI效价≥1:10)，对鸭坦布苏病毒阴性血清、鸭瘟病毒阳性血清、鸭肝炎病毒阳性血清、新城疫、禽流感病毒H5、H9亚型阳性血清均应为阴性反应(HI效价﹤1:10)。HI试验的操作术式见附注2。敏感性:可检测出疫苗免疫2～3周和野毒感染4～5天后鸭、鹅血清中的HI抗体。实施例7在实施例1的基础上进一步具有优化，所用材料试剂与实施例1相同。鸭坦布苏病毒HB株(F3代)作为毒种，以每只25μl/只(含100ELD50)的剂量脑内接种2～4日龄C3H/He品种乳鼠。及时取出精神沉郁、震颤等临床症状明显的鼠，置-20℃以下保存。将乳鼠取出，用碘酊消毒脑部，在无菌条件下除去脑部皮肤和脑壳，取出脑组织，置灭菌容器中。按照W/V＝1:4的比例加入终浓度为8.5％无菌的蔗糖溶液，匀浆。在搅动状态下，将匀浆物逐滴加入匀浆量10～30倍体积的冷丙酮中。500g离心5min，弃去上清液，将沉淀物用无菌剪子剪碎，用与上述相同量的冷丙酮悬浮，冰浴1小时，期间用无菌玻璃棒将沉淀物挤压磨碎。500g离心5min，弃去上清液。将含有少量丙酮的沉淀物收集到无菌试管内，500g离心5min，弃去上清液，将沉淀物分装在干燥管内，-70℃冷冻1小时，真空冷冻干燥2～3小时。按照原匀浆量V/V＝1/1的比例，加入无菌生理盐水，溶解干燥的沉淀物12～24小时。8000g离心1小时，取上清液加入终浓度为0.03％的甲醛进行灭活。取6日龄SPF鸡胚10枚，经卵黄囊接种上清液，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育。24小时照胚，在24小时内死亡的鸡胚判为非特异性死亡，鸡胚非特异性死亡应不超过2枚。24小时后，每日照胚2次，观察至168小时，鸡胚全部存活，判为灭活完全。24～168小时有死胚及时取出，收获胚体，盲传1代，如无鸡胚死亡，判为灭活完全。按体积比为3:1的比例在检验合格上清液中加入灭菌甘油，混匀后即为液态稳定抗原。稳定性:抗原2～8℃存放24个月，HA效价仍不低于1:128，HA试验的操作术式见附注1。特异性:抗原对鸭坦布苏病毒阳性血清应为阳性反应(HI效价≥1:10)，对鸭坦布苏病毒阴性血清、鸭瘟病毒阳性血清、鸭肝炎病毒阳性血清、新城疫、禽流感病毒H5、H9亚型阳性血清均应为阴性反应(HI效价﹤1:10)。HI试验的操作术式见附注2。敏感性:可检测出疫苗免疫2周和野毒感染4～5天后鸭、鹅血清中的HI抗体。实施例8在实施例1的基础上进一步具有优化，所用材料试剂与实施例1相同。鸭坦布苏病毒HB株(F3代)作为毒种，以每只25μl/只(含100ELD50)的剂量脑内接种2～4日龄BALB/c品种乳鼠。及时取出精神沉郁、震颤等临床症状明显的鼠，置-20℃以下保存。将乳鼠取出，用碘酊消毒脑部，在无菌条件下除去脑部皮肤和脑壳，取出脑组织，置灭菌容器中。按照W/V＝1:4的比例加入终浓度为8.5％无菌的蔗糖溶液，匀浆。在搅动状态下，将匀浆物逐滴加入匀浆量10～30倍体积的冷丙酮中。500g离心5min，弃去上清液，将沉淀物用无菌剪子剪碎，用与上述相同量的冷丙酮悬浮，冰浴1小时，期间用无菌玻璃棒将沉淀物挤压磨碎。500g离心5min，弃去上清液。将含有少量丙酮的沉淀物收集到无菌试管内，500g离心5min，弃去上清液，将沉淀物分装在干燥管内，-70℃冷冻1小时，真空冷冻干燥2～3小时。按照原匀浆量V/V＝1/1的比例，加入无菌生理盐水，溶解干燥的沉淀物12～24小时。8000g离心1小时，取上清液加入终浓度为0.03％的甲醛进行灭活。取6日龄SPF鸡胚10枚，经卵黄囊接种上清液，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育。24小时照胚，在24小时内死亡的鸡胚判为非特异性死亡，鸡胚非特异性死亡应不超过2枚。24小时后，每日照胚2次，观察至168小时，鸡胚全部存活，判为灭活完全。24～168小时有死胚及时取出，收获胚体，盲传1代，如无鸡胚死亡，判为灭活完全。按体积比为3:1的比例在检验合格上清液中加入灭菌明胶保护剂，冻干，即为冻干抗原。稳定性:抗原2～8℃存放24个月，HA效价仍不低于1:128，HA试验的操作术式见附注1。特异性:抗原对鸭坦布苏病毒阳性血清应为阳性反应(HI效价≥1:10)，对鸭坦布苏病毒阴性血清、鸭瘟病毒阳性血清、鸭肝炎病毒阳性血清、新城疫、禽流感病毒H5、H9亚型阳性血清均应为阴性反应(HI效价﹤1:10)。HI试验的操作术式见附注2。敏感性:可检测出疫苗免疫2～3周和野毒感染4～5天后鸭、鹅血清中的HI抗体。实施例9在实施例2的基础上进一步具有优化，所用材料试剂与实施例2相同。鸭坦布苏病毒HB株作为毒种，1000倍稀释后接种C6/36细胞单层，50ml细胞培养瓶中接种0.3ml，加维持液7ml，接种后继续在28℃静置培养。每日2次观察细胞病变(CytopathicEffect，CPE)，当细胞出现50％的CPE时，收获细胞和上清夜。将上清液以3000转/分的转速离心30分钟，吸取上清夜于透析袋中，用分子量10000的聚乙二醇(PEG)浓缩5～10倍。在浓缩液中加入终浓度为0.05％的甲醛进行灭活。取6日龄SPF鸡胚10枚，经卵黄囊接种上清液，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育。24小时照胚，在24小时内死亡的鸡胚判为非特异性死亡，鸡胚非特异性死亡应不超过2枚。24小时后，每日照胚2次，观察至168小时，鸡胚全部存活，判为灭活完全。24～168小时有死胚及时取出，收获胚体，盲传1代，如无鸡胚死亡，判为灭活完全。按体积比为3:1的比例在检验合格上清液中加入灭菌甘油，混匀后即为液态稳定抗原。稳定性:抗原2～8℃存放24个月，HA效价仍不低于1:128，HA试验的操作术式见附注1。特异性:抗原对鸭坦布苏病毒阳性血清应为阳性反应(HI效价≥1:10)，对鸭坦布苏病毒阴性血清、鸭瘟病毒阳性血清、鸭肝炎病毒阳性血清、新城疫、禽流感病毒H5、H9亚型阳性血清均应为阴性反应(HI效价﹤1:10)。HI试验的操作术式见附注2。敏感性:可检测出疫苗免疫2～3周和野毒感染5～6天后鸭、鹅血清中的HI抗体。实施例10在实施例2的基础上进一步具有优化，所用材料试剂与实施例2相同。鸭坦布苏病毒HB株作为毒种，1000倍稀释后接种C6/36细胞单层，100ml细胞培养瓶中接种0.3ml，加维持液10ml，接种后继续在33℃静置培养。每日2次观察细胞病变(CytopathicEffect，CPE)，当细胞出现50％的CPE时，收获细胞和上清夜。将上清液以3000转/分的转速离心30分钟，吸取上清夜于透析袋中，用分子量10000的聚乙二醇(PEG)浓缩5～10倍。在浓缩液中加入终浓度为0.05％的甲醛进行灭活。取6日龄SPF鸡胚10枚，经卵黄囊接种上清液，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育。24小时照胚，在24小时内死亡的鸡胚判为非特异性死亡，鸡胚非特异性死亡应不超过2枚。24小时后，每日照胚2次，观察至168小时，鸡胚全部存活，判为灭活完全。24～168小时有死胚及时取出，收获胚体，盲传1代，如无鸡胚死亡，判为灭活完全。按体积比为3:1的比例在检验合格上清液中加入灭菌明胶保护剂，冻干，即为冻干抗原。稳定性:抗原2～8℃存放24个月，HA效价仍不低于1:128，HA试验的操作术式见附注1。特异性:抗原对鸭坦布苏病毒阳性血清应为阳性反应(HI效价≥1:10)，对鸭坦布苏病毒阴性血清、鸭瘟病毒阳性血清、鸭肝炎病毒阳性血清、新城疫、禽流感病毒H5、H9亚型阳性血清均应为阴性反应(HI效价﹤1:10)。HI试验的操作术式见附注2。敏感性:可检测出疫苗免疫2～3周和野毒感染5～6天后鸭、鹅血清中的HI抗体。附注1.HA效价测定操作术式采用96孔U型微量板进行试验，反应总体积为μl。按表1用抗原专用稀释液将抗原2倍系列稀释，然后加入0.33％的鹅红血球(制备方法见附注3)，轻轻混匀后放入湿盒中置37℃60分钟，观察凝集反应。表1HA效价测定操作术式结果判定方法：将血凝板倾斜45°角20～30秒。100％的红细胞被病毒所凝集(不流淌)判为“++++”，以出现“+++～++++”的最高稀释度作为判定终点。2.HI效价测定操作术式2.14个HA单位工作抗原液的制备:根据凝集试验的测定结果，用灭菌的抗原专用稀释液配制4个工作单位的抗原。血凝效价除以8为抗原的预稀释倍数。举例如下：抗原的HA效价为128，稀释倍数为128/8＝16，16倍稀释，即1ml的抗原液加入到15ml的抗原专用稀释液里进行稀释。抗原配制完成应重新进行标定。2.2HI试验的操作方法:应用96孔U型微量板进行试验，血凝试验的反应总体积为100μl，利用抗原专用稀释液将待测样品(待检血清前处理方法见附注4)做连续倍比稀释后，加入4个HA单位抗原，放入湿盒中，2～8℃过夜，再加入0.33％的鹅红血球，轻轻混匀后放入湿盒中置37℃60分钟，观察凝集反应，试验设阴、阳性血清对照及红细胞对照，具体操作方法见表2。表2HI试验操作术式结果判定方法：以阳性对照血清出现明显的血凝抑制现象开始判定，当对照阴、阳性血清的HI效价与已知效价相差不超过1个滴度，1个单位抗原出现+++～++++凝聚，试验结果成立。将血凝板倾斜45°角，以出现4个单位工作抗原的血凝活性完全或者大部分被抑制的血清最高稀释度作为判定终点。待检血清的HI抗体效价≥1:20判为阳性。3.0.33％鹅红细胞悬液的制备采集2～4只12～24月龄鸭坦布苏病毒病抗体阴性鹅的血液，与等量阿氏液混合，然后用0.01M，pH7.2～7.6PBS洗涤3次，以1500rpm离心15分钟，将沉积的红细胞用VAD配制成0.33％红细胞(V/V)悬液，置4～8℃备用。4.血清处理操作方法4.1将上述处理的待检血清56～60℃灭活30分钟。4.2血清100μl+400μl25％白陶土。4.3剧烈震荡血清/白陶土混合物，每5min震荡一次，共20±5min。4.41000g离心，20min。4.5加入100μl10％鹅红细胞。4.6每隔5min轻轻摇动上层清液，使红细胞保持悬浮状态。4.71500rpm离心20±5min。红细胞会沉积于白陶土上层。4.8将上清液移入新管中，此液体视为1:10稀释的待检血清。5.25％白陶土混悬液(KaolinSuspension)的配制白陶土25gPBS100ml6.抗原专用稀释液1.5M氯化钠溶液：NaCl87.7g，加蒸馏水至溶解，总量1000ml；0.5M硼酸溶液：H3BO330.92g，加蒸馏水并加温至溶解，冷却后调整总量至700ml；1N氢氧化钠溶液：NaOH40.0g，蒸馏水至溶解，总量1000ml；pH9.0硼酸氯化钠溶液：1.5M氯化钠溶液80ml，0.5M硼酸溶液100ml，1N氢氧化钠溶液24ml，加蒸馏水至1000ml；4％牛血清白蛋白溶液：牛血清白蛋白V4.0g，pH9.0硼酸氯化钠溶液90ml，用1N氢氧化钠溶液和pH9.0硼酸氯化钠溶液校正pH至9.0，最终容量为100ml；抗原稀释液：0.1％牛血清白蛋白硼酸氯化钠溶液(BABS)：4％牛血清白蛋白溶液2.5ml，pH9.0硼酸氯化钠溶液97.5ml。7.VAD1.5M氯化钠溶液：NaCl87.7g，加蒸馏水至溶解，总量1000ml；0.5M磷酸氢二钠溶液：Na2HPO4·12H2O17.66g，加蒸馏水至溶解，总量100ml；1.0M磷酸二氢钠溶液：NaH2PO4·2H2O156g，加蒸馏水至溶解，总量1000ml；取1.5M氯化钠溶液100ml，0.5M磷酸氢二钠溶液62ml，1.0M磷酸二氢钠溶液160ml,加蒸馏水至1000ml，配制成VAD溶液。该溶液与等量pH9.0BABS混合后pH值为6.2。