技术领域本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种E3G和LH胶体金检测试剂盒及其制备方法和用途。
背景技术：
促黄体生成素(LH，luteinizinghormone)由腺垂体嗜碱粒细胞分泌。在女性促黄体生成素(LH)协同促卵泡激素(FSH，follicle-stimulatinghormone)共同作用维持卵巢的月经周期，导致排卵与黄体形成。LH的产生受下丘脑促性腺释放激素的控制，同时受卵巢的正、负反馈调控。在月经周期LH的释放高峰与卵巢排卵有着密切关系，LH高峰一经出现，预示24-36小时卵巢排卵，因此可以在月经周期中监测血清LH峰值，以确定最佳受孕时间。对于月经周期中的女性，LH值参考范围如下：卵泡期1.9-12.5IU/L；排卵期8.7-76.3IU/L；黄体期0.5-16.9IU/L；绝经期15.9-54IU/L；妊娠期0-1.5IU/L。虽然对LH峰值的监测可以一定程度上预测排卵时间，但由于现有的产品基本都单采用LH作为监测排卵的指标，其预测育龄期妇女排卵的时间只有2天时间左右，对于想要孩子的人员有比较大的概率会错过最佳的怀孕时间。
技术实现要素：
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种E3G和LH胶体金检测试剂盒及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种E3G和LH胶体金检测试剂盒，包括底板，所述底板上从加样端开始依次设有样品垫、胶体金垫、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，其中，所述胶体金垫上包被有胶体金标记的抗E3G单克隆抗体和胶体金标记的抗LH单克隆抗体1，所述免疫硝酸纤维素膜上设有检测线(T线)和控制线(C线)，检测线上包被有抗LH单克隆抗体2，控制线上包被有E3G-BSA抗原。所述胶体金标记的抗E3G单克隆抗体为抗E3G单克隆抗体－胶体金结合物，所述胶体金标记的抗LH单克隆抗体1为抗LH单克隆抗体1－胶体金结合物，所述胶体金垫上面包被有抗E3G单克隆抗体－胶体金结合物和抗LH单克隆抗体1-胶体金结合物的复合物。优选的，胶体金标记的抗E3G单克隆抗体和胶体金标记的抗LH单克隆抗体1中，胶体金为粒径30-50nm的颗粒，更优选为球形颗粒。所述抗LH单克隆抗体1和抗LH单克隆抗体2可以是相同的抗LH单克隆抗体，也可以是不同的抗LH单克隆抗体。优选的，所述抗LH单克隆抗体1为抗β-LH单克隆抗体，所述抗LH单克隆抗体2为抗α-LH单克隆抗体。优选的，所述检测线上还包被有海藻糖和Tween-20。所述E3G和LH胶体金检测试剂盒使用时，作为受试物的尿液中的LH抗原和试剂盒上事先包被的胶体金标记的抗LH单克隆抗体1结合成结合物，该结合物随着膜的毛细管作用向上迁移到达检测区，与检测线上的抗LH单克隆抗体2起反应，出现一条红色条带；而尿液中的E3G抗原和测试笔上的事先包被的胶体金标记的抗E3G单克隆抗体结合成结合物，而未能结合掉的抗E3G单克隆抗体-胶体金结合物随着膜的毛细管作用向上迁移到达检测区，与控制线上的E3G-BSA抗原起反应，会出现一条红色条带。因此检测线(T线)颜色越深，则表示尿液中LH含量越高，而控制线(C线)颜色越深，则表示尿液中E3G含量越低。本发明第二方面提供所述E3G和LH胶体金检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：1)将胶体金标记抗LH单克隆抗体1，封闭后离心浓缩后即得到胶体金标记的抗LH单克隆抗体1；将胶体金标记抗E3G单克隆抗体，封闭后离心浓缩后即得到胶体金标记的抗E3G单克隆抗体；将制备所得的胶体金标记的抗LH单克隆抗体1和胶体金标记的抗E3G单克隆抗体稀释后混合。优选的，所述步骤1中，所述胶体金采用还原法制备。更优选的，所述步骤1中，还原法具体为柠檬酸三钠还原法，所述柠檬酸三钠还原法可包括如下步骤：将氯金酸溶液加热到沸腾，然后加入柠檬酸三钠或柠檬酸三钠溶液，继续煮沸20分钟，然后冷却并定容。所述柠檬酸三钠还原法为现有的胶体金生产的常规方法，本领域技术人员可根据需要调整氯金酸和柠檬酸三钠的比例，以获得不同粒径大小的胶体金。更优选的，所述步骤1中，还原法制备获得的胶体金溶液OD>2.9OD(光程1cm，533nm处)，pH范围为3.5～4.5。本领域技术人员可根据抗LH单克隆抗体1和抗LH单克隆抗体2的种类，选择合适的条件将胶体金标记抗体。优选的，所述步骤1中，抗LH单克隆抗体1为抗β-LH单克隆抗体，将胶体金标记抗β-LH单克隆抗体的具体方法为：将抗β-LH单克隆抗体以0.9-1.1mg/ml抗体对应150OD(533nm)胶体金(具体如当胶体金溶液的吸光度为150OD时，以0.9-1.1mg/ml的终浓度加入抗β-LH单克隆抗体，当胶体金溶液的吸光度为300OD时，以1.8-2.2mg/ml的终浓度加入抗β-LH单克隆抗体)的比例在pH＝6.95-7.05的条件下，将胶体金标记抗β-LH单克隆抗体，30分钟后，在pH＝7.35-7.45的条件下以BSA进行封闭，离心浓缩后即得到胶体金标记的抗β-LH单克隆抗体。优选的，所述步骤1中，将胶体金标记抗E3G单克隆抗体的具体方法为：将抗E3G单克隆抗体以0.9-1.1mg/ml抗体对应150OD胶体金的比例在pH＝7.95-8.05的条件下，将胶体金标记抗E3G单克隆抗体，30分钟后，在pH＝7.35-7.45的条件下以BSA进行封闭，离心浓缩后即得到胶体金标记的抗E3G单克隆抗体。优选的，所述抗LH单克隆抗体1和抗E3G单克隆抗体标记前还进行透析。本领域技术人员可根据单克隆抗体的种类选择合适的透析方法对抗体进行透析，在本发明一实施例中，透析的具体条件为：将抗体置于0.9-1.1mM磷酸氢二钠溶液中透析16h以上。优选的，所述步骤1中，两种抗体混合时，使用胶体金膜稀释液进行稀释。在本发明一实施例中，将胶体金标记的抗LH单克隆抗体1(抗β-LH单克隆抗体)溶于胶体金膜稀释液，所得稀释液的OD＝3.8-4.2，将胶体金标记的抗E3G单克隆抗体溶于胶体金膜稀释液，所得稀释液的OD＝2.8-3.2，再将两者的稀释液按照1:0.95-1.05的比例混合(体积比)。本领域技术人员可选择合适的胶体金膜稀释液对胶体金标记的抗体进行稀释，在本发明一实施例中，所述胶体金膜稀释液为1.1％NaCl，3.75％BSA，20％蔗糖，1.25％Tween-20和50mM硼酸缓冲液，pH9.0。2)将玻璃纤维在步骤1所得混合液中充分浸泡后，取出并挤去多余液体，平铺、干燥后得胶体金垫，备用。3)使用抗LH单克隆抗体2溶液和E3G-OVA抗原溶液分别在硝酸纤维素膜上喷点检测线和控制线，并将制备完成的硝酸纤维素膜干燥后得免疫硝酸纤维素膜，备用。优选的，所述步骤3中，所述抗LH单克隆抗体2溶液为抗α-LH单克隆抗体溶液，溶液浓度为0.9-1.1mg/ml，喷点量为0.9-1.1ul/cm，喷点的溶液中还含5wt％的海藻糖和1wt％的Tween-20。所述溶液在喷点前优选地还进行过滤，在本发明一实施方式中，具体为0.22μm过滤。优选的，所述步骤3中，所述E3G-OVA抗原溶液的溶液浓度为1.8-2.2mg/ml，喷点量为0.9-1.1ul/cm。所述溶液在喷点前优选地还进行过滤，在本发明一实施方式中，具体为0.22μm过滤。4)将未处理的滤样纸于样品垫处理液中充分浸泡，取出并挤干多余液体后干燥，获得样品垫，备用。优选的，所述步骤4中，样品垫处理液可选用本领域各种适用的胶体金试剂盒样品垫处理液，在本发明一实施例中，所述样品垫处理液为含1％TWEEN-20(体积百分比)的50mM硼酸缓冲液，pH＝9.0。5)将吸水纸、步骤2制备的胶体金垫、步骤3制备的免疫硝酸纤维素膜、步骤4制备的样品垫粘贴在底板上，切裁、封装制得检测试剂盒。本发明第三方面提供一种检测人体排卵期的方法，将所述E3G和LH胶体金检测试剂盒的加样端浸入尿液中3-7秒，取出后平放5-10分钟，判定结果。本产品是连续监测体内激素水平，根据体内LH和E3G的升高来判定是否排卵。判定E3G数值时，如果低于门限值(颜色越浅表示E3G浓度越高)，则认定即将处于排卵期，在本发明一实施例中，低于基准值15％以上即认为低于门限值；在判定LH数值时，如果超过门限值(颜色越深LH浓度越高)，则认定为处于排卵高峰期，在本发明一实施例中，超过基准值15％以上即认为超过门限值。此两种情况，均表示该段时间段为适孕期。在本发明一实施例中，从月经开始第七天进行检测，判定结果时，将测试棒(含试纸条)，插入测试笔进行判读，测试笔光路检测模块采用RGB颜色传感器，分别读取T线和C线的颜色，转换为R，G，B颜色频率信号输出，测试笔采集模块采集频率信号并转化为数字值，然后将第七天的测定值与机器设定的门限值进行比较，如第七天测定值高于门限值，则将此测定值定为基准值，否则仍以机器设定的门限值作为基准值，此后每天的检测与此基准值进行比较，并进行结果判断。在判定E3G数值时，如果低于基准值15％以上(颜色越浅表示E3G浓度越高)，则认定即将处于排卵期；在判定LH数值值，如果超过判定基准值15％以上(颜色越深LH浓度越高)，则认定为处于排卵高峰期。此两种情况，均表示该段时间段为适孕期。本发明提供的E3G和LH胶体金检测试剂盒将E3G(雌三醇)和LH(促排卵生成素)2个激素指标结合起来，采用胶体金快速层析检测法，根据LH含量和E3G的含量高低，可以判断人体是否处于最佳的怀孕时间，从而达到怀孕的目的。具体来说，所述E3G和LH胶体金检测试剂盒可以将预计排卵的时间扩大到4天，能更好的指示最佳怀孕时间，从而提高怀孕成功率。同时在检测线的溶液中加入海藻糖和Tween-20，可以使检测线条的颜色保持均一，提高试剂的灵敏度和美观。附图说明图1显示为本发明的结构示意图。图2显示为本发明实施例4检测结果示意图。元件标号说明1样品垫2胶体金垫3检测线(T线)4控制线(C线)5免疫硝酸纤维素膜(NC膜)6吸水纸具体实施方式以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。实施例中所使用的各原料信息如下：抗α-LH单克隆抗体和抗β-LH抗体单克隆抗体：购自美国Arista公司，蛋白浓度≥10mg/ml。抗E3G单克隆抗体：自制(详见实施例1)，为亲和纯化，纯度>90％，蛋白浓度≥2mg/ml。E3G-OVA抗原：自制(详见实施例2)，蛋白浓度≥4mg/ml。硝酸纤维膜(NC膜)：购自美国Sartorius公司，长度标准：100±2m，宽度标准：2.54±0.05cm，跑水时间标准：107～133秒。玻璃纤维(GlassFiberConjugatePad)：购自美国Millipore公司，长度标准：31±0.2cm，宽度标准：8.0±0.5mm。样品垫和吸水滤纸：购自上海捷宁生物技术有限公司，吸水纸宽11±0.5mm、长31±0.2cm，样品垫宽22±0.5mm、长31±0.2cm。PVC底板：购自上海捷宁生物技术有限公司，长度标准：31±0.2cm，宽度标准：60.4～61.4mm。HAuCl4购自Sigma或Amersco公司柠檬酸三钠、E3G抗原、卵清蛋白OVA：购自Sigma公司。其他未给出的原料均为市售原料，浓度不低于化学纯，且应符合现行《中国药典》或《中国生物制品主要原辅材料质控标准》要求。实施例1抗E3G单克隆抗体的制备及鉴定：1.将E3G抗原分别免疫6只小鼠，ELISA方法检测血清滴度，直到滴度>100,000。2.步骤1所得的免疫小鼠脾细胞和SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合，并采用ELISA竞争法筛选稳定细胞株5-10株。3.挑选到亲和常数最高的一株细胞株并优化竞争ELISA法来达到最佳的灵敏度，特异性、线性范围，重复性。4.挑选、传代并低温储存2个杂交瘤细胞株。5.在小鼠腹腔内接种步骤4所得的杂交瘤细胞株，取得小鼠腹水后，用蛋白G柱亲和纯化小鼠腹水，获得所需要的抗E3G单克隆抗体。实施例2E3G-OVA抗原的制备：1.用0.2M的PBS作为溶剂配制5mg/ml的卵清蛋白溶液。2.用DMF(二甲基亚枫)作为溶剂配制10mg/ml的E3G(雌三醇)溶液。3.用DMF作为溶剂配制20mg/ml的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶液。4.用DMF作为溶剂配制18mg/ml的EDC(碳二亚胺)溶液。5.将上述配置所得的E3G溶液、EDC溶液和NHS溶液以6:2:1的比例混合2小时。6.后将上述混合液缓慢加入到4.5倍体积的OVA溶液中，室温过夜。7.将制备好的E3G-OVA溶液用分子筛纯化柱纯化得到E3G-OVA抗原。实施例3试剂盒的制备：1.胶体金的制备：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金：将0.03％(质量百分比)氯金酸溶液加热到沸腾，后加入3％(质量百分比)的柠檬酸三钠溶液(1升氯金酸溶液中加入12.202ml的3％的柠檬酸三钠溶液)，继续煮沸20分钟，后冷却并定容。胶体金颗粒大小在40nm左右。制得的胶体金溶液OD应>2.9，pH范围为3.5～4.5。2.胶体金垫的制备：a)抗β-LH单克隆抗体和抗E3G单克隆抗体的透析：将抗β-LH单克隆抗体和抗E3G单克隆抗体置于1mM磷酸氢二钠溶液中透析过夜。b)抗β-LH单克隆抗体和抗E3G单克隆抗体金探针的制备：将抗β-LH单克隆抗体以1mg/mL抗体对应150OD胶体金的比例在pH7.0的条件下，将胶体金标记步骤a所得的抗β-LH单克隆抗体，30分钟后，在pH7.4的条件下以BSA进行封闭，离心浓缩后即得到抗LH抗体金探针；将抗E3G单克隆抗体以1mg/mL抗体对应150OD胶体金的比例在pH8.0的条件下，将胶体金标记步骤a所得的抗E3G单克隆抗体，30分钟后，在pH7.4的条件下以BSA进行封闭，离心浓缩后即得到抗E3G抗体金探针。c)这两种金探针以胶体金膜稀释液(1.1％NaCl，3.75％BSA，20％蔗糖，1.25％Tween-20和50mM硼酸缓冲液，pH9.0)分别稀释至OD4.0(抗LH抗体金探针)和OD3.0(抗E3G抗体金探针)后，再按比例1:1混合备用。d)胶体金垫的制备、干燥：将玻璃纤维在胶体金膜溶液中充分浸泡后，取出并挤去多余液体，平铺于专用网架上；于相对湿度≤20％的环境中室温干燥过夜得胶体金垫，备用。3.免疫硝酸纤维膜(NC膜)的制备a)检测线(T线)喷膜抗体溶液的配制：以pH7.4并含5wt％海藻糖和1wt％Tween-20的10mMPBS溶液将抗α-LH抗体稀释至1mg/ml，0.22μm过滤。b)控制线(C线)喷膜抗体溶液的配制：以pH7.4的10mMPBS溶液将E3G-OVA稀释至2.0mg/ml，0.22μm过滤。c)免疫硝酸纤维膜(NC膜)的制备、干燥：分别以检测线喷膜抗体溶液和控制线喷膜抗体溶液在硝酸纤维素膜上喷点检测线和控制线(1.0±0.1ul/cm)，并将制备完成的硝酸纤维素膜于相对湿度≤20％的环境中室温干燥过夜，备用。4.样品垫的处理：将未处理的滤样纸于滤样纸处理液(50mM硼酸缓冲液pH9.0及1％TWEEN-20)中充分浸泡，取出并挤干多余液体后平铺于专用网架上，于相对湿度≤20％的环境中干燥过夜，备用。5.粘膜大卡的制备：粘膜时车间工作环境相对湿度要求低于30％。取60mm×300mm胶板(底衬)一块，在中心位置上粘贴包被后的免疫硝酸纤维膜(NC膜)，NC膜的检测线位置朝下；在NC膜检测线的一侧下部贴一条胶体金垫，保证两者有1～2mm的重叠；在胶体金垫下侧粘贴一条处理过的样品垫，其与胶体金垫必须有部分重叠；在PVC胶板未贴样品垫的一端粘贴吸水纸一张，与NC膜部分重叠；在NC膜上粘贴透明的防溅胶带；将粘贴后的大卡装入塑料袋，在相对湿度低于20％的低湿储存间保存(试剂盒的基本结构如图1所示)。6.试纸条的切割、装配及包装切割、装配时的车间工作环境相对湿度要求低于30％。将大卡用切割机切割成6mm宽度的试纸条，将6mm试纸条按测试笔装配步骤按序装入塑料件装配成测试笔，将测试笔用铝箔包装密封，并按试剂盒组分要求包装成试剂盒。实施例4排卵时间预测实验：1.样本标准：收集18～45周岁女性从月经开始的第七天开始至下一次月经开始时每天的晨尿样本，共114名适龄女性。2.分组：共114组样本，分别用本产品(使用实施例3所得试剂条进行检测)和对比产品(英国Unipath的排卵期激素检测条(乳胶法))进行比较，以确定两者的符合率。3.检测方法：每天收集受试者尿液，用实施例3制备所得试剂盒(排卵胶体金法免疫层析测试笔)和对照试剂同时进行检测，将加样端浸入尿液中5秒，取出后平放，5分钟后用读数仪进行检测，判定结果，具体结果如表1所示。表14.结果：在对97名正常周期的样本进行检测时发现，出现LH和E3G升高状态的受试者天数(503天)占整个周期(503+1806+97×6＝2891天)的17.4％，那么对于一个长为28天的正常周期，该试剂所能提示的具有较高几率怀孕的天数为28×17.4％＝4.87天，除去2天的LH可孕状态，额外提出2.87天较易怀孕的日子。试剂盒灵敏度和线条颜色均一性实验：检测方法：取实施例3制得的胶体金检测试剂盒，将试剂盒放置在水平台面上，取没有采用新检测线配方的试条作为对照(即检测线喷膜抗体溶液的配制时未加入海藻糖和Tween-20)，同时检测含25mIU/ml的LH和10ng/ml的E3G标准品，用加样吸管吸取样品，然后滴4滴(约150ul)样品到试剂盒的加样孔中。观察结果：在滴加样品后5分钟判读结果。检测结果如图2所示(左边：调整配方前试剂条的检测结果图；右边：调整配方后试剂条的检测结果图)。在同样的标准品浓度下，采用新配方的试剂条检测时，线条颜色明显深，检测线条的前后沿颜色基本一致，观察美观，因此，在读数时，采用新配方的试剂条线条检测灵敏度提高。综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。