三维表面增强拉曼纸芯片的制备及应用的制作方法

本发明涉及易携带、操作简单、花费低、检测速度快、灵敏度高及选择性好的过氧化氢分析检测技术领域，更具体的说是一种三维表面增强拉曼细胞内过氧化氢生物传感器的制备。

背景技术：

活性氧物种是不完全的分子氧化还原反应的产物。在这些活性氧物种中，过氧化氢是由不稳定的活性氧超氧离子发生歧化反应形成的。因作为胞内第二信使，主要调节DNA损坏，蛋白质合成及细胞凋谢等生物活动，而成为生物学中主要的研究对象之一。由于它传播到其他细胞隔室有长的周期，因此成为氧化应激损伤的主要贡献者之一。然而，至今，众所周知，过氧化氢作为普遍存在的胞内第二信使可以激活信号桥促使细胞的增殖，分化和迁移，对细胞起到调节保护作用。因为这个原因，检测细胞内过氧化氢有效的方法的发展对于阐述其调控的信号转导通路和寻找治疗疾病的新策略是至关重要的。

与传统的分析检测仪器相比，表面增强拉曼检测技术具有高灵敏度、高选择性、检测速度快、所需试样量少、无损检测等优势。因此，近年来被广泛应用于环境、化学检测，生物医学诊断等领域。伴随着纳米科技和激光技术的进步，表面增强拉曼检测技术具有好的发展前景。贵金属纳米粒子增强拉曼的效果远好于其他金属，而银纳米粒子的增强拉曼的效果最好。然而，其基底的活性和重现性极大地限制了其广泛的应用。

微流控纸芯片是一个以纸为基底的技术平台，具有微型化、试剂用量少、成本低、便携、快速高效以及易于与其他装置集成等优势。制备方法不需要大型设备，所得到的纸芯片重现性好，灵敏度高。并且可以简单快速的大批量制备具有表面增强拉曼活性的纸芯片。微流控纸芯片和表面增强拉曼两种技术有着不同的优势，而将这两种技术相结合可以使其广泛应用于各个领域。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种检测速度快、灵敏度高、选择性好、易携带、操作简单及花费低的三维表面增强拉曼纸芯片，以实现细胞内过氧化氢的快速、高灵敏检测。

为了解决上述技术问题，本发明是通过一种长有花状银的纸芯片及比率型三维金属增强荧光方法来实现的，其特征是包括以下步骤：

（1）设计如附图1所示三维表面增强拉曼纸芯片的疏水蜡批量打印图案；

（2）利用蜡打印技术将步骤（1）中设计的纸芯片打印上疏水图案，随后将得到的纸芯片取出，在110~150 ºC下加热1-2 min，直到蜡融化并浸透整个纸，形成疏水墙；

（3）在步骤（2）中得到的纸芯片上生长花状银；

（4）将巯基化的DNA及石墨烯量子点固定在步骤（3）所得到的纸芯片上；

（5）将适配体链及癌细胞固定在步骤（4）所得到的纸芯片上，随后用牛血清白蛋白封锁活性位点；

（6）在步骤（5）所得的纸芯片前处理区滴加储备液；

（7）表面增强拉曼的检测。

本发明所述在步骤（2）中得到的纸芯片上生长花状银的步骤为：

准备20 mL最终浓度为0.25 mM硝酸银及0.25 mM柠檬酸钠混合溶液，在剧烈搅拌下，将0.6 mL 10 mM 硼氢化钠一次加入到上述溶液中，30 s后停止搅拌，制得4 nm银种子；取10 µL的银种子滴加到纸芯片的工作区域，在室温下平衡10 min，随后同时加入10 µL 0.1 M硝酸银及 10 µL 0.2 M抗坏血酸，在室温下生长10 min；最后，用水彻底清洗，并在真空干燥箱中干燥。

本发明所述的将巯基化的DNA及石墨烯量子点固定在步骤（3）所得到的纸芯片上的步骤为：

利用巯基与银之间的相互作用力，将巯基化的DNA连接在三维花状银上，然后，将20.0 μg·mL^-1的石墨烯量子点加入到上述修饰有DNA链的花状银的纸芯片上，在室温下反应一个小时，石墨烯量子点与DNA之间是通过π-π键连接在银纳米粒子纸芯片上。

本发明所述在步骤（5）前处理区滴加的储备液为10 µL癌细胞的相应刺激物血管内皮细胞生长因子佛波酯。

本发明所述表面增强拉曼过氧化氢的测定步骤，将纸芯片放入拉曼设备中，测定不同浓度的过氧化氢的拉曼光谱，绘制拉曼光谱与过氧化氢浓度关系曲线，实现细胞内过氧化氢的精确测定。

本发明的有益效果：

（1）表面增强拉曼技术与微流控纸芯片结合不仅具有检测速度快、灵敏度高、选择性好等优势，而且具有成本低、便携等优点。

（2）利用银与过氧化氢的刻蚀作用，实现了细胞内过氧化氢的定量检测。

附图说明

图1：纸芯片的疏水蜡批量打印图案；

图2：纸芯片的尺寸及各区域功能。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面通过实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

三维表面增强拉曼纸芯片的制备及其在HL-60细胞内过氧化氢的应用：

（1）设计三维表面增强拉曼纸芯片的疏水蜡批量打印图案；

（2）利用蜡打印技术将步骤（1）中设计的纸芯片打印上疏水图案，随后将得到的纸芯片取出，在110~150 ºC下加热1-2 min，直到蜡融化并浸透整个纸，形成疏水墙；

（3）在步骤（2）中得到的纸芯片上生长花状银：准备20 mL最终浓度为0.25 mM硝酸银及0.25 mM柠檬酸钠混合溶液，在剧烈搅拌下，将0.6 mL 10 mM 硼氢化钠一次加入到上述溶液中，30 s后停止搅拌，制得4 nm银种子；取10 µL的银种子滴加到纸芯片的工作区域，在室温下平衡10 min，随后同时加入10 µL 0.1 M硝酸银及 10 µL 0.2 M抗坏血酸，在室温下生长10 min；最后，用水彻底清洗，并在真空干燥箱中干燥；

（4）将巯基化的DNA及石墨烯量子点固定在步骤（3）所得到的纸芯片上，即利用巯基与银之间的相互作用力，将巯基化的DNA连接在三维花状银上，然后，将20.0 μg·mL^-1的石墨烯量子点加入到上述修饰有DNA链的花状银的纸芯片上，在室温下反应一个小时，石墨烯量子点与DNA之间是通过π-π键连接在银纳米粒子纸芯片上；

（5）将适配体链及HL-60细胞固定在步骤（4）所得到的纸芯片上，随后用牛血清白蛋白封锁活性位点；

（6）在步骤（5）前处理区滴加的储备液为10 µL癌细胞的相应刺激物血管内皮细胞生长因子佛波酯；

（7）表面增强拉曼过氧化氢的测定步骤，将纸芯片放入拉曼设备中，测定不同浓度的过氧化氢的拉曼光谱，绘制拉曼光谱与过氧化氢浓度关系曲线，实现细胞内过氧化氢的精确测定。

SEQUENCE LISTING

<110> 济南大学

<120> 三维表面增强拉曼纸芯片的制备及应用

<130> 2016

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

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<210> 2

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<212> DNA

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