一种叶菜赤霉素残留检测样品前处理方法及检测方法与流程

本发明涉及赤霉素残留，尤其涉及一种叶菜赤霉素残留检测样品前处理方法。同时本发明还涉及叶菜赤霉素残留检测方法。

背景技术：

农业生产中常用的植物生长调节剂大部分是以天然的五大植物激素为先导，经过结构改造衍生而来，是具有植物激素活性的人工合成的化学物质，具有增强抗逆性、改善品质、增加产量等作用。近年来，随着设施农业、反季节栽培等高效农业的飞速发展，我国植物生长调节剂产量增长幅度很大，每年递增量达几千吨。植物生长调节剂属于农药，具有一定的毒性，使用不当可能会引起人畜的急、慢性中毒，导致疾病的发生，甚至影响到下一代的健康。

目前对于植物生长调节剂的检测，大多采用气相色谱（GC）、高效液相色谱（HPLC）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）和高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS) 及多级质谱联用技术。由于赤霉素性质的特殊性，目前国内外所建立的赤霉素分析前处理方法主要基于传统萃取技术和SPE等净化技术。例如采用甲醇、乙腈等有机溶剂萃取结合SPE或QuEChERS前处理方法，采用PSA、C18、GCB等吸附剂净化。这些技术存在提取时间较长，净化步骤繁琐费时，成本高等不足。此外，目前采用的前处理方法多应用于茄果类和瓜果类样品中，将其应用于叶类蔬菜等基质较复杂的样品处理时，由于存在色素和成复杂，会出现检测基线不稳定、效果不稳定、重现性较差等问题。

技术实现要素：

针对菠菜、苋菜等叶菜基质成分的特殊性以及目前赤霉素检测前处理过程中存在的问题，本发明提供一种准确度较高、重现性较好、耗时短、操作简便的叶菜赤霉素残留检测样品的前处理方法。

本发明目的通过以下技术方案来实现：一种叶菜赤霉素残留检测样品的前处理方法，将叶菜组织打碎，然后加入提取试剂、无水硫酸镁和无水乙酸钠，进行涡旋提取，提取结束后离心分离，所得的上清液经微孔滤膜过滤后，即得叶菜赤霉素检测样品溶液。

所述叶菜与含有乙酸的甲醇的质量体积比为1：3~4。本发明中含有乙酸的甲醇优选含有1~2%乙酸的甲醇溶液。

所述无水硫酸镁的添加量0.05-0.2g/mL。所述无水乙酸钠的添加量0.01-0.05g/mL。

所述涡旋提取条件：涡旋提取时间1~5分钟，高速离心，离心转速5000rpm，离心5min。

本发明另一个目的是提供一种叶菜赤霉素残留检测方法。该方法采用上述前处理方法对叶菜样品进行处理，获得样品溶液，然后进行超高效液相色谱-串联质谱分析方法进行检测，最终获得叶菜中赤霉素的含量。

具体地，一种叶菜赤霉素残留检测方法，包括以下步骤：

(1) 样品的预处理：将叶菜组织打碎，然后加入提取试剂、无水硫酸镁和无水乙酸钠，进行涡旋提取，提取结束后离心分离，所得的上清液经微孔滤膜过滤后，即得叶菜赤霉素检测样品溶液；

(2) 基质标准溶液制备：按照步骤（1）所述的样品预处理方法处理不含赤霉素的叶菜样品，所得的样品溶液将赤霉素分别稀释成质量浓度为0.001 mg/L、0.005 mg/L、0.010 mg/L、0.050 mg/L、0.10 mg/L、0.50 mg/L、1.0 mg/L的标准工作溶液；

(3) 超高效液相色谱-串联质谱分析：将基质标准溶液按浓度由低到高用超高效液相色谱-串联质谱仪进行测定，以定量离子峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程；然后在相同条件下将前处理的样品液用超高效液相色谱-串联质谱仪进行测定，采用外标法计算待测赤霉素残留量的测定值。

所述步骤(3)中，超高效液相色谱-串联质谱条件如下：

色谱柱：岛津Shim-pack XR-ODSIII ,2.0mm×75mm, 1.6 μm；

流动相A：0.1%（v%）甲酸水；流动相B：乙腈；

梯度洗脱程序：0～2 min, 10%流动相B；2～5 min, 10%~95%流动相B；5～7 min, 95%流动相B；7.1 min, 10%流动相B；

流速：0.3 mL/min；

柱温：40℃；

进样量：1μL；

电喷雾ESI离子源，负离子多反应监测模式（MRM）检测；

雾化气流速：3 L/min；

加热气流速：10 L/min；

干燥气流速：10 L/min；

离子源接口温度：300℃；

脱溶剂温度：250℃；

加热块温度：400℃。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1.耗时短、步骤简单、成本低：本发明提供的叶菜中赤霉素残留检测样品前处理方法为稀释法，经过对提取溶剂种类、提取溶剂量、提取时间、提取盐各因素的优化，采用甲醇和乙酸的混合溶剂作为赤霉素残留的提取剂，采用涡旋提取代替传统的振荡提取，高速离心代替传统的抽滤，无需采用吸附剂进行净化，离心后直接过滤膜进样检测，操作简便快速，极大地简化了样品预处理步骤，节约了时间和成本提高了前处理效率。

2.准确度、精密度高：本发明提供的检测方法，考虑到液相色谱-质谱的定性定量分析中，基质效应影响仪器的灵敏度和重现性，且是影响准确定性及定量的重要因素，本发明采用同样来源的空白样品进行前处理配制成基质匹配标准溶液，以抵消基质效应对方法精密度以及结果准确度的影响。本发明提供的检测方法回收率在70.9%~88.6%之间，相对标准偏差RSD在1.5%~5.8%之间，准确度高，精密度高，重现性好，完全满足农药残留的检测要求。

3.线性好：本发明提供叶菜赤霉素残留检测的前处理方法和检测方法，在0.001 mg/L~1.0 mg/L浓度范围内线性良好，相关系数达到0.999。

4.检出限地：本发明检出限0.001 mg/kg。

附图说明

图1为菠菜中赤霉素的线性范围；

图2为苋菜中赤霉素的线性范围。

具体实施方式

实施例1

(1) 叶菜样品的前处理：用组织匀浆机将菠菜打碎，备用。称取5.00 g样品，加入20 mL甲醇（含1%乙酸）提取液、1.0 g无水硫酸镁、0.2 g无水乙酸钠，涡旋仪涡旋提取2 min；涡旋后以5000 r/min离心5 min；离心后取上层液用尼龙66微孔滤膜进行过滤，得待测样品溶液。

(2)基质标准溶液制备：按照步骤（1）所述的样品预处理方法处理不含赤霉素的叶菜样品，所得的样品溶液将赤霉素分别稀释成质量浓度为0.001 mg/L、0.005 mg/L、0.010 mg/L、0.050 mg/L、0.10 mg/L、0.50 mg/L、1.0 mg/L的基质标准工作溶液。

(3)超高效液相色谱-串联质谱分析：将基质标准溶液按浓度由低到高用超高效液相色谱-串联质谱仪进行测定，以定量离子峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程；然后在相同条件下将前处理所得待测样品溶液用超高效液相色谱-串联质谱仪进行测定，采用外标法计算待测赤霉素残留量的测定值。超高效液相色谱-串联质谱条件：

色谱条件：色谱柱：岛津Shim-pack XR-ODSIII (2.0mm×75mm, 1.6 μm)；

流动相A：0.1%（v%）甲酸水；流动相B：乙腈；

梯度洗脱程序：0～2 min, 10%流动相B；2～5 min, 10%~95%流动相B；5～7 min, 95%流动相B；7.1 min, 10%流动相B；流速：0.3 mL/min；柱温：40℃；进样量：1μL；

质谱条件：电喷雾ESI离子源，负离子多反应监测模式（MRM）检测。

雾化气流速：3 L/min；加热气流速：10 L/min；干燥气流速：10 L/min；离子源接口温度：300℃；脱溶剂温度：250℃；加热块温度：400℃，质谱参数见表1。

方法的线性关系：赤霉素在菠菜中的线性范围见图1 。由图中可知，在0.001 mg/L~1.0 mg/L范围内，赤霉素呈良好的线性关系，相关系数均达到0.999以上，以0.001 mg/L基质匹配标准溶液定量离子对应色谱信号的3倍信噪比( S/N )确定方法的检出限为0.001 mg/kg，且方法准确度高，重现性好，完全满足农药残留的检测要求。

方法的精密度和准确度：方法的精密度以相对标准偏差RSD判定，方法的准确度以添加回收率判定。按上述方法在空白菠菜、苋菜样品中准确加入0.010、0.10、0.50mg/kg浓度水平的赤霉素，每水平重复3次，计算平均回收率和相对标准偏差。结果见表2。由表2 可知，赤霉素在菠菜中添加0.010、0.10、0.50mg/kg浓度水平的平均回收率为70.4%-88.7%，相对标准偏差为1.5%-5.8%，试验结果满足回收率在70%-120%之间，相对标准偏差小于20%的农药残留分析要求。

本发明的菠菜赤霉素残留检测方法具备了较高的准确度和重现性。可用于检测菠菜中赤霉素残留，提高测定方法的准确性。

实施例2

(1) 叶菜样品的前处理：将苋菜用组织匀浆机打碎，备用。称取5.00 g样品，加入20 mL甲醇（含1%乙酸）提取液、1.0 g无水硫酸镁、0.2 g无水乙酸钠，涡旋仪涡旋提取2 min；涡旋后以5000 r/min离心5 min；离心后取上层液用尼龙66微孔滤膜进行过滤，得待测样品溶液。

(2)基质标准溶液制备：按照步骤（1）所述的样品预处理方法处理不含赤霉素的叶菜样品，所得的样品溶液将赤霉素分别稀释成质量浓度为0.001 mg/L、0.005 mg/L、0.010 mg/L、0.050 mg/L、0.10 mg/L、0.50 mg/L、1.0 mg/L的基质标准工作溶液。

(3)超高效液相色谱-串联质谱分析：将基质标准溶液按浓度由低到高用超高效液相色谱-串联质谱仪进行测定，以定量离子峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程；然后在相同条件下将前处理所得待测样品溶液用超高效液相色谱-串联质谱仪进行测定，采用外标法计算待测赤霉素残留量的测定值。超高效液相色谱-串联质谱条件：

色谱条件：色谱柱：岛津Shim-pack XR-ODSIII (2.0mm×75mm, 1.6 μm)；

流动相A：0.1%（v%）甲酸水；流动相B：乙腈；

梯度洗脱程序：0～2 min, 10%流动相B；2～5 min, 10%~95%流动相B；5～7 min, 95%流动相B；7.1 min, 10%流动相B；流速：0.3 mL/min；柱温：40℃；进样量：1μL；

质谱条件：电喷雾ESI离子源，负离子多反应监测模式（MRM）检测。

雾化气流速：3 L/min；加热气流速：10 L/min；干燥气流速：10 L/min；离子源接口温度：300℃；脱溶剂温度：250℃；加热块温度：400℃，质谱参数见表3。

方法的线性关系：赤霉素在苋菜中的线性范围见图2 。由个图中可知，在0.001 mg/L~1.0 mg/L范围内，赤霉素呈良好的线性关系，相关系数均达到0.999以上，以0.001 mg/L基质匹配标准溶液定量离子对应色谱信号的3倍信噪比( S/N )确定方法的检出限为0.001 mg/kg，且方法准确度高，重现性好，完全满足农药残留的检测要求。

方法的精密度和准确度：方法的精密度以相对标准偏差RSD判定，方法的准确度以添加回收率判定。按上述方法在空白苋菜样品中准确加入0.010、0.10、0.50mg/kg浓度水平的赤霉素，每水平重复3次，计算平均回收率和相对标准偏差。结果见表4。由表4可知，赤霉素在苋菜中添加0.010、0.10、0.50mg/kg浓度水平的平均回收率为70.9%-85.6%，相对标准偏差为1.6%-5.2%，试验结果满足回收率在70%-120%之间，相对标准偏差小于20%的农药残留分析要求。

本发明的苋菜的赤霉素残留检测方法具备了较高的准确度和重现性。可用于检测苋菜中赤霉素残留，提高测定方法的准确性。

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。本发明的上述实施例都只能认为是对本发明的说明而不是限制，凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。