利用多酚类化合物在材料表面实现血小板图案化的方法与流程

本发明涉及生物材料表面修饰技术和表面微型图案制备技术，特别涉及在材料表面调控血小板粘附行为的技术。

背景技术：

血小板是由骨髓中巨核细胞产生的具有生物活性的小块细胞质，在生理情况下血小板发挥黏附、聚集等功能保证正常止血过程顺利进行，同时血小板粘附还与病理性血栓形成、肿瘤转移、炎症及免疫反应等相关。因此在临床上常需要对功能正常或异常血小板的粘附性能进行检测，然而在体外的研究中，血小板的粘附行为受到诸多因素的影响，如空间几何构型的限制，血小板与基底的相互作用以及血小板之间的相互作用等。因而目前临床对血小板粘附的检测还无法有效的评估。构建图案化的表面可以在限定的空间范围内有效控制血小板的粘附，从而对血小板的粘附激活机理进行研究以及对病变的血小板和抗血小板药物进行有效的检测。如文献Anal.Chem.2013,85,6497-6504中，Ana Lopez-Alonso等人利用构建的血小板图案化表面实现了血小板粘附功能的检测，并对抗血小板药物进行了有效评估。

目前，在材料表面实现血小板图案化的方法主要依赖于化学图案的构建和微纳加工技术(如微接触印刷术、光刻术等)。其中最常见的策略是首先在目标材料表面修饰一层惰性的亲水表面(如聚乙烯醇、两亲性高分子等)用于排斥血小板粘附，然后在惰性表面引入生物活性蛋白(如纤维蛋白原、纤粘蛋白等)来引导血小板的粘附。如文献Langmuir 2011,27,8316–8322中，Lindsey E.Corum等人利用聚乙烯醇和纤维蛋白原，并结合微接触印刷术在材料表面成功实现了血小板图案化调控。虽然这些方法能够成功制备血小板图案化表面，但是需要复杂多步的化学修饰以及蛋白分子的偶联，从而限制了其在临床上的应用和拓展。因此，构建快速、有效、低廉的血小板图案化方法具有十分重要的意义。

多酚类化合物是指植物中一组化学物质统称，因含有多个酚基团而得名，存在于许多普通水果和蔬菜中，来源广泛，成本低廉，而且多酚类化合物最近报道能与多种金属离子通过螯合作用在材料表面快速成膜。如文献Science2013,341,154–157和文献Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,5546-5551中，Frank Caruso等人使用多种金属离子做为螯合交联剂，将多酚类化合物单宁酸和表没食子儿茶素没食子酸酯成功修饰在材料表面。

目前尚未见到将多酚类材料转移至目标材料表面而调控血小板粘附行为的类似报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种利用多酚类化合物在材料表面实现血小板图案化的方法，整个制备过程中无需引入亲水分子和生物活性蛋白，方法简单快速且成本低廉。

本发明实现以上目的采用的技术方案为：

一种利用多酚类化合物在材料表面实现血小板图案化的方法，包含以下步骤：

A)分别配置多酚化合物溶液和金属离子溶液，然后将两种溶液混合，得到多酚-金属离子的混合溶液；

B)将多酚-金属离子溶液滴加到带有微型图案的印章表面，得到多酚材料的图案印章；

C)将含有多酚材料的图案印章与目标材料表面相贴合，使多酚材料转移至目标材料表面，揭掉印章，获得图案化的多酚材料表面；

D)将图案化的多酚材料表面与富血小板血浆相接触，血小板选择性粘附在没有多酚材料覆盖的区域，实现对血小板粘附的图案化调控。

进一步地，在上述技术方案中，在步骤A)中所述的多酚化合物溶液中多酚化合物浓度为1～40mg/mL。

进一步地，在上述技术方案中，在步骤A)中所述的多酚-金属离子的混合溶液中多酚化合物和提供所述金属离子的金属盐的浓度比为1:1-4:1。其中所述浓度比是指质量浓度比，浓度单位为mg/mL。

进一步地，步骤A)中所述的多酚化合物为单宁酸、表儿茶素没食子酸酯或表没食子儿茶素没食子酸酯中的一种；所述的金属离子为铁离子(Fe³⁺)、铝离子(Al³⁺)、铜离子(Cu²⁺)、锰离子(Mn²⁺)、锌离子(Zn²⁺)、钴离子(Co²⁺)、镍离子(Ni²⁺)、镉离子(Cd²⁺)、钒离子(V³⁺)、铬(Cr³⁺)、锆离子(Zr⁴⁺)、钼离子(Mo²⁺)、铑离子(Rh³⁺)、钌离子(Ru³⁺)、铈离子(Ce³⁺)、铕离子(Eu³⁺)、钆离子(Gd³⁺)或铽离子(Tb³⁺)中的一种，优选为铁离子(Fe³⁺)、铝离子(Al³⁺)、铜离子(Cu²⁺)、锌离子(Zn²⁺)、钴离子(Co²⁺)、锆离子(Zr⁴⁺)中的一种，更优选为铁离子(Fe³⁺)、铝离子(Al³⁺)、铜离子(Cu²⁺)、锆离子(Zr⁴⁺)中的一种。在本发明中，所述金属离子溶液是将提供该金属离子的金属盐溶解于溶剂中制备得到，对于所述提供所述该金属离子的金属盐以及溶剂不做特别限定，本领域技术人员可以采用可以提供本发明所述金属离子的盐类，溶解于能够溶解该金属盐的溶剂中，制备得到含有适量金属离子的金属离子溶液，所述金属盐的阴离子的种类不影响本发明的技术效果。所述能够溶解金属盐的溶剂可优选为去离子水、无水乙醇。

进一步地，步骤B)中所述的印章的材料为金属或非金属，其中金属可以为金、银、铜等，非金属可以为高分子塑胶、氧化钛等。

进一步地，步骤C)中所述的目标材料为硅片、玻璃片或石英片。

在本发明中，所述的多酚化合物溶液是将多酚化合物溶解于能够完全溶解该多酚化合物的溶剂中制备得到。所述溶剂可优选去离子水、无水乙醇。

在本发明中，将多酚-金属离子溶液滴加到带有微型图案的印章表面，其中，对于多酚-金属离子溶液的滴加量不做特别限定，本领域技术人员可以按常规选择适量的滴加量，优选采用1mL/mm²印章表面的量来滴加，修饰时间1～10min，以达到在节省成本的前提下完成多酚化合物对印章表面的修饰。

在本发明中，对所述的印章表面的微型图案不做特别限定，可以采用常规的矩形条阵或者点阵。

本发明的有益效果：

本发明利用多酚类化合物与金属离子的螯合溶液制备得到具有图案分布的多酚类材料表面，被多酚材料覆盖的区域具有抗血小板粘附的功能，而未被多酚材料覆盖的区域则含有血小板粘附的特性。因而当图案化的多酚材料表面与血小板接触之后，血小板选择性的粘附在未被多酚材料覆盖的区域，从而实现对血小板的图案化调控。本发明与现有实现血小板图案化的方法相比，无需引入亲水高分子和生物活性蛋白，且具有成本低廉、操作简单快速的特点。所制备的血小板图案化表面有望用于血小板粘附检测、抗血小板药物治疗和评估等领域。

附图说明

图1为本发明方法中制备多酚材料的微型图案印章(a)和实现血小板图案化表面(b)的示意图；

图2为硅橡胶印章的扫描电镜照片，比例尺为20微米；

图3为硅片表面上单宁酸微型图案的扫描电镜照片(A)以及表面的能谱分析(B、C)结果，其中区域1为覆盖单宁酸材料的区域；区域2为未覆盖单宁酸材料的区域，比例尺为20微米；

图4为硅片表面上单宁酸微型图案的原子力显微镜照片(A)以及对目标区域的高度分析(B)；

图5为利用单宁酸微型图案表面与富血小板血浆接触后的扫描电镜照片，比例尺为20微米；

图6为抗血小板药物(欣维宁)处理之后的血小板在单宁酸微型图案表面的粘附情况，其中插图是粘附血小板的荧光染色图像，比例尺为20微米。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。

实施例1

1)以50％的乙醇水溶液为溶剂，分别配置浓度为3.2mg/mL的单宁酸溶液和0.8mg/mL的三氯化铁溶液，然后将两种溶液等体积混合，得到单宁酸-铁离子溶液(图1a)；

2)将单宁酸-铁离子溶液滴加到具有微型图案(条带间隔为20微米)的硅橡胶印章表面(图2)，利用旋涂仪对印章表面进行修饰(图1a)，旋涂仪的参数控制在2000rpm/min，单宁酸-铁离子溶液的总滴液量为1mL/mm²，修饰时间为3min；

3)将修饰有单宁酸材料的印章表面与目标材料硅片表面相贴合，使单宁酸材料转移至硅片表面，10分钟后揭掉印章，获得具有单宁酸微型图案的硅片表面；

4)将具有单宁酸微型图案的硅片与富血小板血浆相接触，从而获得血小板图案化的表面。

图3为在步骤(3)中得到的具有单宁酸微型图案的硅片表面扫描电镜照片(A)以及其表面的能谱分析(B、C)结果，其中区域1为覆盖单宁酸材料的区域；区域2为未覆盖单宁酸材料的区域。图4为硅片表面上单宁酸微型图案的原子力显微镜照片(A)以及对目标区域的高度分析(B)，由图3和图4中可见，单宁酸微型图案成功转移到硅片表面，图案高度约为80nm。

图5为在步骤(4)中，利用单宁酸微型图案表面与富血小板血浆接触后得到的硅片表面的扫描电镜照片，血小板选择性粘附在无单宁酸材料覆盖的区域。

实施例2

1)以50％的乙醇水溶液为溶剂，分别配置浓度为0.8mg/mL的表儿茶素没食子酸酯溶液和0.8mg/mL的三氯化铁溶液，然后将两种溶液等体积混合，得到表儿茶素没食子酸酯-铁离子溶液；

2)将表儿茶素没食子酸酯-铁离子溶液滴加到具有微型图案(条带间隔为20微米)的硅橡胶印章表面，利用旋涂仪对印章表面进行修饰，旋涂仪的参数控制在2000rpm/min，表儿茶素没食子酸酯-铁离子溶液的总滴液量为1mL/mm²，修饰时间为3min；

3)将修饰有表儿茶素没食子酸酯材料的印章表面与目标材料硅片表面相贴合，使表儿茶素没食子酸酯材料转移至硅片表面，10分钟后揭掉印章，获得具有表儿茶素没食子酸酯微型图案的硅片表面；

4)将具有表儿茶素没食子酸酯微型图案的硅片与富血小板血浆相接触，血小板选择性粘附在无表儿茶素没食子酸酯材料覆盖的区域，从而获得血小板图案化的表面。

实施例3

1)以50％的乙醇水溶液为溶剂，分别配置浓度为3.2mg/mL的表没食子儿茶素没食子酸酯溶液和0.8mg/mL的三氯化铁溶液，然后将两种溶液等体积混合，得到表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子溶液；

2)将表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子溶液滴加到具有微型图案(条带间隔为20微米)的硅橡胶印章表面，利用旋涂仪对印章表面进行修饰，旋涂仪的参数控制在2000rpm/min，表没食子儿茶素没食子酸酯-铁离子溶液的总滴液量为1mL/mm²，修饰时间为3min；

3)将修饰有表没食子儿茶素没食子酸酯材料的印章表面与目标材料硅片表面相贴合，使表没食子儿茶素没食子酸酯材料转移至硅片表面，10分钟后揭掉印章，获得具有表没食子儿茶素没食子酸酯微型图案的硅片表面；

4)将具有表没食子儿茶素没食子酸酯微型图案的硅片与富血小板血浆相接触，从而获得血小板图案化的表面。

实施例4

1)以50％的乙醇水溶液为溶剂，分别配置浓度为3.2mg/mL的单宁酸溶液和0.8mg/mL的氯化铜溶液，然后将两种溶液等体积混合，得到单宁酸-铜离子溶液；

2)将单宁酸-铜离子溶液滴加到具有微型图案(条带间隔为20微米)的硅橡胶印章表面，利用旋涂仪对印章表面进行修饰，旋涂仪的参数控制在2000rpm/min，单宁酸-铜离子溶液的总滴液量为1mL/mm²，修饰时间为3min；

3)将修饰有单宁酸材料的印章表面与目标材料硅片表面相贴合，使单宁酸材料转移至硅片表面，10分钟后揭掉印章，获得具有单宁酸微型图案的硅片表面；

4)将具有单宁酸微型图案的硅片与富血小板血浆相接触，从而获得血小板图案化的表面。

实施例5

现利用制备的单宁酸微型图案的表面来检测抗血小板药物(欣维宁)的效果。

1)以50％的乙醇水溶液为溶剂，分别配置浓度为3.2mg/mL的单宁酸溶液和0.8mg/mL的三氯化铁溶液，然后将两种溶液等体积混合，得到单宁酸-铁离子溶液；

2)将单宁酸-铁离子溶液滴加到具有微型图案(条带间隔为20微米)的硅橡胶印章表面，利用旋涂仪对印章表面进行修饰，旋涂仪的参数控制在2000rpm/min，单宁酸-铁离子溶液的总滴液量为1mL/mm²，修饰时间为3min；

3)将修饰有单宁酸材料的印章表面与目标材料硅片表面相贴合，使单宁酸材料转移至硅片表面，10分钟后揭掉印章，获得具有单宁酸微型图案的硅片表面；

4)配置不同浓度(0、5、20和50μg/ml)的欣维宁药物水溶液，将其分别滴加到富血小板血浆中，敷育30分钟。然后将药物处理后的血小板与具有单宁酸微型图案的表面相接触，待血小板粘附完成后，利用罗丹明标记的鬼笔环肽对粘附在表面的血小板进行荧光染色(图6)。利用ImageJ软件分析荧光图像，得到血小板粘附区域的荧光强度和无血小板粘附区域的荧光强度的比值(Fluorescence intensity ratio，FIR)，定义无药物处理血小板时，FIR的值为100％。由图6可见，当药物浓度为5μg/ml时，FIR值下降到76％，说明有24％的血小板受到了药物刺激而不能粘附在表面；当药物浓度提高到20μg/ml时，FIR值进一步下降到30％，表明此时约有70％的血小板受到了药物刺激；当药物浓度等于50μg/ml时，FIR值为9％，证明药物对91％的血小板起到了效果。由此可见，可以利用血小板图案化的表面对抗血小板药物进行定性定量的评估和检测。