一种基于金‑石墨烯纳米组装体对Mucin‑1手性信号超灵敏检测的方法与流程

本发明涉及一种基于金-石墨烯纳米组装体对Mucin-1手性信号超灵敏检测的方法，属于材料化学技术领域。

背景技术：

黏蛋白是重要的糖蛋白，它是由在粘膜表面的粘液凝胶层组成。粘蛋白固定在细胞表面形成凝胶基质，作为细胞的防御屏障，其黏膜保护和通信与外部环境发挥了重要作用。粘蛋白家族包括21个成员名叫Muc1-muc21，已分为分泌型和膜型。其中，粘蛋白1（Mucin-1）是由一个疏水的跨膜结构域，胞质结构域，和胞外结构域构成。Mucin-1 是一种广泛表达于导管上皮细胞的跨膜糖蛋白，其多肽骨架由多个串联的重复序列( variable number of tandem repeats，VNTR) 组成。正常导管上皮细胞中 Mucin-1 的 VNTR 结构域高度糖基化，而 IBD 患者结肠上皮组织中高表达一种 VNTR结构域低糖基化的突变型 Mucin-1。Mucin-1是已知的与多种癌症（如乳腺癌、胃癌和肺癌）的发生相关。因此，灵敏的检测Mucin1在肿瘤的初步诊断中具有非常重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于金-石墨烯纳米组装体对Mucin-1手性信号超灵敏检测的方法，首先通过在金纳米粒子的表面修饰Mucin 1的适配体，在石墨烯表面修饰与Mucin-1适配体部分互补的序列，随着DNA的杂交组装成金-石墨烯纳米自组装体，并对其圆二色性质进行了研究和探讨。加入不同浓度的Mucin-1溶液，对金-石墨烯自组装体的手性信号进行测试，以达到对Mucin-1的超灵敏检测的目的。

本发明的技术方案，一种基于金-石墨烯纳米组装体对Mucin-1手性信号超灵敏检测的方法，将偶联有Mucin-1适配体的金纳米粒子和偶联有与Mucin-1适配体部分互补序列的石墨烯组装得到金-石墨烯纳米组装体，当存在有待测物Mucin-1时，组装体的结构发生改变，金纳米粒子从组装体上解离，进而引起组装体手性信号的改变，从而实现对Mucin-1的超灵敏检测；具体步骤如下：

（1）检测传感器的构建：

a、金纳米粒子上修饰Mucin-1适配体Mucin-1 aptamer：采用柠檬酸还原法合成的金纳米粒子，将其离心浓缩后，重悬于超纯水中，浓度为5nM；取100μL浓缩重悬后的金纳米粒子，加入2μL 10μM巯基化的Mucin-1 aptamer，和终浓度为50mM的NaCl溶液中，37℃孵育过夜，得到偶联了Mucin-1 aptamer的金纳米粒子溶液，待用；

b、石墨烯偶联Mucin-1适配体部分互补序列Mucin-1 CS：取破碎后的石墨烯用超纯水稀释使终浓度为0.1mg/ml；按EDC、NHS和石墨烯的摩尔比为1000︰1000︰1，加入EDC和NHS，在避光的情况下反应2h；之后，用截留量30k的超滤管过滤，用pH为7.5、10mM的PB缓冲液重悬；向其中加入终浓度2μM的Mucin-1 CS，反应3h，得到石墨烯- Mucin-1 CS溶液，待用；

c、金-石墨烯纳米结构的组装：取100μL步骤a制备的金纳米粒子偶联Mucin-1aptamer溶液7500rpm离心10min，除去上清；取100μL步骤b制得的石墨烯- Mucin-1 CS溶液用超滤管过滤；最后两种过滤物混合于100μL含有50mM NaCl、50mM Mg(NO₃)₂ 和质量浓度为 0.01% SDS的10mM TBE 缓冲液中，杂交12h；梯度离心，用超纯水重悬，得到高产率的金-石墨烯纳米组装体；

（2）圆二色光谱检测：建立金-石墨烯纳米组装体手性信号与Mucin-1浓度的标准曲线，根据Mucin-1浓度与金-石墨烯纳米组装体手性信号强度的关系建立两者之间的标准曲线，从而应用手性信号对Mucin-1浓度进行检测。

步骤（2）具体如下：金纳米粒子偶联Mucin-1 aptamer，石墨烯偶联 Mucin-1 CS，两者混合于100μL含有50mM NaCl、50mM Mg(NO₃)₂和质量浓度为0.01% SDS的10mM TBE 缓冲液后，分别加入不同浓度的目标物Mucin-1，室温孵育12h，由于Mucin-1会与Mucin-1 aptamer的特异性结合，随着Mucin-1浓度的增加，金-石墨烯纳米组装体会有不同程度的解离，因此得到不同的手性信号强度；根据Mucin-1浓度与金-石墨烯纳米组装体手性信号强度的关系建立两者之间的标准曲线，从而应用手性信号对Mucin-1浓度进行检测。

所述Mucin-1 aptamer序列和Mucin-1 CS序列如表1所示。

表1：

本发明的有益效果：本发明制备出了组装产率高，性质稳定的金-石墨烯纳米自组装体，提供了能够通过圆二色光谱超灵敏检测Mucin-1浓度的方法，建立了Mucin-1浓度与金-石墨烯纳米组装体圆二色信号强度两者之间的标准曲线，具有灵敏度高、选择性好，省时省力的优点，具有非常好的实际应用前景。

附图说明

图1 本发明的金-石墨烯纳米自组装体的透射电镜图。

图2 本发明中向金-石墨烯纳米自组装体中加入不同浓度的Mucin-1，导致的圆二色光谱的变化图。

具体实施方式

以下实施例所用试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

实施例1

（1）检测传感器的构建：

a、金纳米粒子上修饰Mucin-1适配体：采用柠檬酸还原法合成的金纳米粒子，将其离心浓缩后，重悬于超纯水中，浓度为5nM；取100μL浓缩重悬后的金纳米粒子，加入2μL 10μM巯基化的Mucin-1 aptamer，和终浓度为50mM的NaCl溶液中，37℃孵育过夜，得到偶联了Mucin-1 aptamer的金纳米粒子溶液，待用；

b、石墨烯偶联Mucin-1适配体部分互补序列Mucin-1 CS：取破碎后的石墨烯用超纯水稀释使终浓度为0.1mg/mL；按EDC、NHS和石墨烯的摩尔比为1000︰1000︰1，加入EDC和NHS，在避光的情况下反应2h；之后，用截留量30k的超滤管过滤，pH为7.5、10mM的PB缓冲液重悬；向其中加入终浓度2μM的Mucin-1 CS，反应3h，得到石墨烯- Mucin-1 CS溶液，待用；

c、金-石墨烯纳米结构的组装：100μL金纳米粒子偶联Mucin-1 aptamer溶液7500rpm离心10min，除去上清；100μL石墨烯- Mucin-1 CS溶液用超滤管过滤，最后两种过滤物混合于100μL含有50mM NaCl、50mM Mg(NO₃)₂ 和 0.01% SDS的10mM TBE 缓冲液中，杂交12h；梯度离心，用超纯水重悬，得到高产率的金-石墨烯纳米组装体，如图1所示；

（2）圆二色光谱检测：建立金-石墨烯纳米组装体手性信号与Mucin-1浓度的标准曲线，如图2所示。根据Mucin-1浓度与手性信号强度的关系建立两者之间的标准曲线，从而应用手性信号对Mucin-1浓度进行检测。

Mucin-1 aptamer序列为：

5’-SH-AAAAAGCAGT TGATCCTTTG GATACCCTGG T-3’；

Mucin-1 CS序列为：5’- SH-AAAAAATCCA AAGGATGTTC TG-3’。