本发明属于动物卫生检测技术领域，具体地涉及一种检测区域性猪流感病毒亚型分布的方法。
背景技术：
猪流感病毒（Swine Influenza Virus，SIV）在分类上属于正粘病毒科、A型流感病毒属，单股负链RNA病毒，基因组由大小不等的8个独立片段组成，能引起一种猪的三类动物疫病，H1N1、H3N2和H1N2亚型猪流感病毒是猪群中广泛存在并频繁引起猪群发病的毒株。单纯的SIV感染具有发病率高、死亡率低的特点，但猪流感是典型的免疫抑制性疾病，会引起其他病原的混合或继发感染，进而造成严重的经济损失。
1918年西班牙大流感以后，流感病毒感染猪群演变为经典猪流感（H1/CS）分支，1976年欧洲H1N1亚型禽源流感病毒感染猪群，并逐渐替代CS分支，成为猪流感病毒主要分支，即欧亚类禽猪源流感病毒分支（H1/EA），中国香港在2001年首次分离到EA分支的流感病毒，另外H1和H3亚型季节性流感（HS）则在猪群中呈现明显的地域性分布。2009年从墨西哥爆发了席卷全球的流感大流行，并在中国猪群中广泛传播，通过遗传进化分析后表明猪源、人源和禽源流感病毒重组形成的新型流感病毒就是新爆发的pdm/09。
猪的呼吸道上皮细胞具有同时表达α-2,3和α-2,6两种流感病毒的受体的能力，因而猪可同时感染人、猪和禽源流感病毒，普遍认为猪是流感病毒的“混合器”。中国猪群内呈现多种亚型流感病毒共存的现状，自pdm/09感染中国猪群后，pdm/09逐渐成为中国猪群内主要的流行分支，并开始在中国猪群中广泛存在。研究表明pdm/09已经与其它流感病毒发生重组，形成新型流感病毒，并开始在猪群中传播。所以加强猪群流感病毒的检测对公共卫生具有非常重要的意义，为此国内外学者对猪流感病毒的诊断与检测做了大量研究，研制出PCR、ELISA和Real-Time PCR等检测方法，但这些方法费事费力，需要昂贵的实验仪器和熟练的操作技能来完成，不适用于检测区域性猪流感病毒的分布情况，常用的也是最基本的检测区域性猪流感病毒分布情况的方法是血凝和血凝抑制试验，但由于动物血清中含有非特异性凝血因子，常造成结果的假阳性，对检测工作造成阻碍，另外由于检测工作量大，试验样本多，在结果数据的分析上，易造成紊乱。
技术实现要素：
为了解决血凝和血凝抑制试验受非特异性凝血因子干扰以及数据分析难的问题，本发明拟提供一种检测区域性猪流感病毒亚型分布的方法，该方法简单有效、成本低廉，适用于地方性检测工作的开展。
一种检测区域性猪流感病毒亚型分布的方法，包括以下步骤：
步骤一、采集血清样品，按照不同地点将其分成不同组，对每组中的每份血清样品进行处理，处理步骤为：在每30μL血清样品中加入15μL 8mg/mL的胰酶溶液，56℃水浴处理30min，加入60μL 2.3mg/mL的高铁酸钠水溶液和60μL 体积百分数为3%的过氧化氢水溶液，混匀后室温静置15min，再加60μL质量体积百分数为0.5%的聚乙二醇水溶液，混匀后室温静置10min，与75μL的PBS溶液混合，得待检血清；取待检血清和体积分数为1%的鸡红细胞悬液，按照1:1的体积比将两者进行混合，鸡红细胞呈泪滴状下沉，血清样品处理成功，待检血清用于后续步骤；
步骤二、在V型微量反应板的2-12孔中分别加入50μL的PBS溶液；在第1孔中加入100μL待检抗原，将其吸出50μL置于第2孔中，混匀后从第2孔中吸出50μL置于第3孔中，依次进行系列倍比稀释至第11孔，弃最终的50μL；在第1至12孔中加入50μL的1%的鸡红细胞悬液，将V型微量反应板置于微量振荡器上处理1-2min，37℃静置15min，观察结果，获取待检抗原的血凝单位；
步骤三、根据步骤二的结果配制浓度为4个血凝单位的待检抗原，在V型微量反应板的2-11孔中分别加入25μL的PBS溶液，第12孔加入50μL的PBS溶液；在第1孔加入50μL处理好的待检血清，将其吸出25μL置于第2孔中，混匀后从第2孔中吸出25μL置于第3孔中，依次进行系列倍比稀释至第10孔，弃最终的25μL；在第1-11孔中分别加入25μL 浓度为4 个血凝单位的待检抗原，37℃静置30分钟，第1-12孔中分别加入50μL的1%的鸡红细胞悬液；以完全抑制4个血凝单位待检抗原的待检血清最高稀释倍数作为血清抗体的效价，血清抗体效价≥40 时为阳性；
步骤四、对步骤三获得的数据进行统计分析，比较不同组待检血清阳性率的差异是否显著。
作为进一步的优化，步骤一中胰酶溶液的配制方法：在每0.8g胰酶中加入15mL的D-Hank’s液调制成糊状，再加入40mL的D-Hank’s液搅拌至完全溶解，定容至100mL，用碳酸氢钠溶液调pH 至7.2，过滤灭菌，备用。
作为进一步的优化，V型微量反应板在使用前进行清洗，清洗步骤为：将浸泡有75%乙醇的棉签置于V型微量反应板的每孔内旋转，然后用蒸馏水冲洗2遍，再用双蒸水洗涤3遍，置37℃温箱中干燥。
作为进一步的优化，所述1%的鸡红细胞悬液是将3只SPF鸡的混合血液，加入到其2倍体积的Alsever液中，混合摇匀；500rpm/min水平离心5min，吸出上层的Alsever液和血球沉淀物表面的白细胞层，得血球沉淀物；加入血球沉淀物20倍体积的pH=7.2的生理盐水，混合均匀，1500rpm/min离心10min进行洗涤，吸出上清后再重复洗涤3次，取沉淀；将沉淀与生理盐水以1:100的体积比混合均匀，得1%的鸡红细胞悬液。
有益效果：
本发明采用胰酶、高铁酸钠、过氧化氢和聚乙二醇依次作用处理血清样品，其中，胰酶通过在特定位置上降解蛋白，使细胞间结合处蛋白降解，这时细胞由于自身内部细胞骨架的张力作用下成为球形，从而使细胞分开。过氧化氢与高铁酸钠释放的原子氧作用不稳定非特异内源因子，使其趋于稳定，而高铁酸钠自身被还原，具有一定的絮凝效果，可将血清中残留的白细胞碎片和稳定的非特异性内源因子絮集，利用聚乙二醇的诱导作用，沉淀大分子物质，消除对红细胞凝集的影响，同时聚乙二醇使血清中各类物质处于疏散和活跃状态，为与鸡红细胞的反应创造了良好的环境，此方法简单有效、方便快捷，与常用非特异性凝集因子的去除方法相比，效果明显，凝集率降为0，消除了非特异性凝集因子的干扰。
具体实施方式
下面通过具体的实施方式对本发明做进一步的解释。
一种检测区域性猪流感病毒亚型分布的方法，包括以下步骤：
步骤一、采集血清样品，按照不同地点将其分成不同组，对每组中的每份血清样品进行处理，处理步骤为：在每30μL血清样品中加入15μL 8mg/mL的胰酶溶液，56℃水浴处理30min，加入60μL 2.3mg/mL的高铁酸钠水溶液和60μL 体积百分数为3%的过氧化氢水溶液，混匀后室温静置15min，再加60μL质量体积百分数为0.5%的聚乙二醇水溶液，混匀后室温静置10min，与75μL的磷酸盐缓冲液（即PBS溶液）混合，得待检血清；取待检血清和体积分数为1%的鸡红细胞悬液，按照1:1的体积比将两者进行混合，鸡红细胞呈泪滴状下沉，血清样品处理成功，待检血清用于后续步骤；
其中，胰酶溶液的配制方法：在每0.8g胰酶中加入15mL的平衡盐溶液（即D-Hank’s液）调制成糊状，再加入40mL的D-Hank’s液搅拌至完全溶解，定容至100mL，用碳酸氢钠溶液调pH 至7.2，过滤灭菌，备用。
其中，1%的鸡红细胞悬液是将3只SPF鸡的混合血液，加入到其2倍体积的阿氏液（即Alsever液）中，混合摇匀；500rpm/min水平离心5min，吸出上层的Alsever液和血球沉淀物表面的白细胞层，得血球沉淀物；加入血球沉淀物20倍体积的pH=7.2的生理盐水，混合均匀，1500rpm/min离心10min进行洗涤，吸出上清后再重复洗涤3次，取沉淀；将沉淀与生理盐水以1:100的体积比混合均匀，得1%的鸡红细胞悬液。
步骤二、在V型微量反应板的2-12孔中分别加入50μL的PBS溶液；在第1孔中加入100μL待检抗原，将其吸出50μL置于第2孔中，混匀后从第2孔中吸出50μL置于第3孔中，依次进行系列倍比稀释至第11孔，弃最终的50μL；在第1至12孔中加入50μL的1%的鸡红细胞悬液，将V型微量反应板置于微量振荡器上处理1-2min，37℃静置15min，观察结果，获取待检抗原的血凝单位；
其中，V型微量反应板在使用前进行清洗，清洗步骤为：将浸泡有75%乙醇的棉签置于V型微量反应板的每孔内旋转，然后用蒸馏水冲洗2遍，再用双蒸水洗涤3遍，置37℃温箱中干燥。
步骤三、根据步骤二的结果配制浓度为4个血凝单位的待检抗原，在V型微量反应板的2-11孔中分别加入25μL的PBS溶液，第12孔加入50μL的PBS溶液；在第1孔加入50μL处理好的待检血清，将其吸出25μL置于第2孔中，混匀后从第2孔中吸出25μL置于第3孔中，依次进行系列倍比稀释至第10孔，弃最终的25μL；在第1-11孔中分别加入25μL 浓度为4 个血凝单位的待检抗原，37℃静置30分钟，第1-12孔中分别加入50μL的1%的鸡红细胞悬液；以完全抑制4个血凝单位待检抗原的待检血清最高稀释倍数作为血清抗体的效价，血清抗体效价≥40 时为阳性；
步骤四、对步骤三获得的数据进行统计分析，计算不同样本量时待检血清阳性率的95%的置信区间，比较不同组待检血清阳性率的差异是否显著。
对非特异性凝集因子去除方法效果测定：
用以下4种方法（A、B、C、D）分别处理40个血清样品，用1%鸡红细胞悬液对上述处理的血清样品进行血凝试验，测定非特异性凝集现象的去除效果。
A：血清样品直接测定；
B：血清样品56℃水浴处理30min放冷后测定；
C：“胰酶-高碘酸钾-丙三醇”方法处理后测定；
D：采用本发明方法处理后测定。
测定结果如下表1所示。
其中，“1-2孔”表示仅1-2孔出现凝集的份数；“3孔及以上”表示3孔及以上出现凝集的份数。
结果表明，未经处理的血清样品的非特异性凝集率高达65%，经热处理之后，非特异性凝集率有所降低，下降至37.5%，常用的“胰酶-高碘酸钾-丙三醇”法效果稍显著，但仍会对血凝抑制试验产生影响，用本发明中所述方法处理后，非特异性凝集现象消失，用于血凝抑制试验的血清样品不会产生假阳性。
实施例1 利用一种检测区域性猪流感病毒亚型分布的方法对江西省流感病毒进行血清学调查
通过对江西省猪群进行H1和H3亚型猪流感病毒的血清学监测与统计分析，进而掌握江西省内猪群中流感病毒的流行情况。
步骤一、样品与信息的收集
从2012年10月至2015年3月间，收集了覆盖江西省全省范围养殖场的血清共2005份，其中2012年为130份，2013年为430份。2014年为924份，2015年为548份。每个设区市的血清不同，其中抚州市和吉安市最多，为562和338份，其次为赣州市、上饶市、南昌市、景德镇、宜春市和九江市，分别为205、172、158、155、139和126份，其中萍乡市、新余市和鹰潭市最少，分别为65、55和30份。
步骤二、血清样品的收集与处理
收集来自于江西省各设区市内猪场的血清，每个养殖场至少收集15份血清。对血清样品进行处理，去除血清中的非特异性凝血因子，并于4℃保存。具体步骤为：在每30μL血清样品中加入15μL 8mg/mL的胰酶溶液，56℃水浴处理30min，加入60μL 2.3mg/mL的高铁酸钠水溶液和60μL 体积百分数为3%的过氧化氢水溶液，混匀后室温静置15min，再加60μL质量体积百分数为0.5%的聚乙二醇水溶液，混匀后室温静置10min，与75μLPBS溶液混合，得待检血清；取待检血清，按照1:1的体积比与1%的鸡红细胞悬液混合，鸡红细胞呈泪滴状下沉，血清样品处理成功，待检血清用于后续步骤。
步骤三、血清HI抗体的检测与统计分析
首先检测选用抗原的血凝单位，在V型微量反应板的2-12孔中分别加入50μL PBS，在第1孔中加入100μL待检抗原，吸出50μL置于第2孔中，依次按照1/2倍倍比稀释至第11孔，弃最终的50μL，在第1至12孔中加入50μL的1%的鸡红细胞悬液，37℃静置15分钟，观察结果，获得参考抗原的血凝单位。
结果判定：结果以++++，+++，++，+，+，- 表示，其中：
一层红细胞均匀地铺于孔壁上为++++；
一层红细胞均匀铺于孔壁上，但边缘不整齐，铺的面积稍小为+++；
红细胞形成一个环状，四周有小凝集块为++；
红细胞形成一个小团，但边缘不光滑，四周有小凝块为+；
红细胞形成一个小圆圈，边缘无任何小凝块为-。
以++为终点，即以能完全抑制红细胞凝集的最高稀释度的倒数为终点。得一血凝滴度。将血凝滴度除以4得稀释倍数，将标准参考抗原按此倍数稀释，即为4个血凝单位。
配制浓度为4个血凝单位的待检抗原，在V型微量反应板的2-11孔中分别加入25μL PBS，第12孔加入50μL PBS，在第1孔加入50μL处理好的待检血清，吸出25μL置于第2孔中，依次按照1/2倍倍比稀释至第10孔，弃最终的25μL；在第1-11孔中分别加入25μL 浓度为4 个血凝单位的待检抗原，37℃静置30分钟，第1-12孔中分别加入50μL的1%的鸡红细胞悬液；以完全抑制4个血凝单位待检抗原的待检血清最高稀释倍数作为血清抗体的效价，血清抗体效价≥40 时为阳性。
步骤四、数据统计与分析
使用IBM SPSS Statistics 20和Graphpad Prism 5对获得的数据进行统计分析，计算不同样本量时的血清阳性率的95%的置信区间，比较不同组血清阳性率的差异是否显著。结果如下：
（1） H1和H3亚型流感病毒流行情况
通过血凝抑制试验检测了江西省收集的2005份血清中流感病毒的抗体水平，其中H1总阳性率为34.76%，95%置信区间为32.68%-36.89%，显著高于其他亚型流感病毒，H3流感病毒血清抗体阳性率为23.69%。H1亚型流感病毒中pdm/09分支流感病毒的血清抗体阳性率最高，达到28.73%，并显著高于其它分支的流感病毒，其后依次为H1/CS和H1/EA。结果如下表2所示。
（2）H1和H3亚型流感病毒共感染情况
若血凝抑制试验检测抗体阳性，则认为曾经感染过此分支的流感病毒，若两种或者以上的抗原的抗体出现阳性，则认为此猪曾感染过两个甚至两个以上分支的流感病毒，通过对实验数据进行统计分析发现：H1亚型的多个分支之间存在大量的共感染病例，pdm/09和EA/H1N1之间的共感染率为11.62%，pdm/09与CS的共感染率为6.38%，而EA与CS的共感染率为5.19%；H1和H3亚型流感病毒抗体阳性率为6.78 %，H1各分支的流感病毒也均出现与H3亚型流感病毒的共感染病例。结果如下表3所示。
（3）江西省不同地区流感病毒的流行情况
对江西省内11个设区市的H1和H3亚型流感病毒的血清学的检测结果进行统计分析后，发现上饶市和吉安市的pdm/09分支的流感病毒的抗体阳性率最高，分别为44.77%和29.88%，并且显著高于该地区其他分支流感病毒的抗体阳性率；鹰潭市、景德镇市、新余市和宜春市的H3/L22的抗体阳性率最高，分别为50.00%、25.16%、43.64%以及26.62%，并显著高于当地其他分支的SIV的抗体阳性率；南昌市的pdm/09和H1/CS分支流感病毒的抗体阳性率最高，分别为49.37%和41.77%，两个分支流感病毒的抗体阳性率差异不显著；九江市、赣州市、萍乡市和抚州市内猪群的pdm/09和H3/L22分支的流感病毒抗体阳性率最高，并显著高于H1/EA和H1/CS的阳性率。结果如下表4所示。
（4）2012年至2015年江西省猪群流感病毒流行情况
通过对2012年至2015年不同分支流感病毒血清阳性率进行统计分析后，发现2013年江西省收集的血清中pdm/09分支流感病毒的血清抗体阳性率为36.74%，显著高于其他年份，并显著高于同期其他分枝和H3亚型流感病毒抗体阳性率，2014年开始下降，到2015年阳性率降低为20.44%；与pdm/09相反，H3流感病毒的血清阳性率逐渐上升，由2012年的4.85%上升至2015年的41.24%。2012年至2015年间H1/HS的抗体阳性率相对稳定，而H1/CS和H1/EA则在2014年达到最高，阳性率分别达到17.21%和16.23%。结果如表3和下表5所示。