本发明属于生物分析领域，尤其是涉及一种人尿中对羟基苯甲酸酯类防腐剂浓度的UPLC-MS/MS检测方法。
背景技术：
：对羟基苯甲酸酯又名尼泊金酯,常温条件下为无色晶体或结晶性粉末，包括了其甲酯、乙酯、丙酯、异丙酯、丁酯、异丁酯等,通常来说，随着其烷基碳链的增大，其毒性降低，抗菌作用增强。羟基苯甲酸酯水溶性较差，可以通过合成其钠盐来提高其水溶性。对羟基苯甲酸甲酯，也称尼泊金甲酯或羟苯甲酯，白色结晶粉末或无色结晶，易溶于醇，醚和丙酮，极微溶于水，沸点270-280℃。主要用作有机合成、食品、化妆品、医药的杀菌防腐剂，也用作于饲料防腐剂。对羟基苯甲酸甲酯防腐剂主要添加在食品中，如果长期大量食用对羟基苯甲酸甲酯，可能会造成肠胃不适，皮肤、黏膜发炎和产生女性荷尔蒙。对羟基苯甲酸乙酯对霉菌的抑菌效能较强，对细菌也有一定的抑制作用。在药剂中用作抑菌防腐剂，广泛用于液体制剂、半固体制剂。本品在食品工业和日化工业中具有相似的用途，广泛用于食品和化妆品的防腐。对羟基苯甲酸乙酯服用量大也会对人体造成肠胃等不适。对羟基苯甲酸丙酯又名尼泊金丙酯，对羟基安息香酸丙酯。对霉菌、酵母与细菌有广泛的抗菌作用，其抗菌作用大于尼泊金乙酯。曾用于酱油、酱菜生产中的食品防腐剂。健康危害：吸入、摄入或经皮肤吸收对身体有害。对眼、粘膜和上呼吸道和皮肤有刺激作用。对羟基苯甲酸丁酯又名尼泊金丁酯；用于药品、化妆品及食品的抑菌和防腐。对酵母和霉菌有很强的抑制作用。对羟基苯甲酸酯类防腐剂已在人体血液和尿液中广泛检出，在人体内主要以代谢物对羟基苯甲酸的形式存在。研究表明，该类防腐剂可能与乳腺癌的发病有关，动物实验表明该类防腐剂可能具有雌激素活性，因此其在环境介质和人体组织中的残留、污染和毒性受到广泛关注。技术实现要素：本发明的目的是提供一种操作简单、检测效率高、成本低的对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯浓度检测方法，尤其适合对尿液中对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯浓度的检测。本发明的技术方案是：人尿中人尿中对羟基苯甲酸酯类防腐剂浓度的UPLC-MS/MS检测方法，包括以下步骤：1)样品处理：取待测尿液样品于试管或离心管中，加样1/10倍体积的水，然后加入β-葡糖糖苷酸酶，摇匀并密封，放入37℃水浴中加热至反应完全，取一定量的反应液，加入3倍量的沉淀剂(甲醇/乙腈＝1：1)沉淀蛋白，涡旋混匀后，15000rpm离心10min，取上清5-10μL进行样分析。2)HPLC-MS/MS分析：将处理后的样品用三重四级杆液质联用仪，在以下条件下进行分析液相条件：流动相：A:0.1％甲酸水溶液，B:乙腈；流速：0.3ml/min；进样量：5μL；柱温：45℃；色谱柱：WatersACQUITYBEHC18,1.7μm,2.1*50mmColumn表1.梯度洗脱程序Time/minA％B％09552.070305.060407.010908.010908.195510.0955表2.质谱条件其他质谱参数：毛细管电压(kV):3.2kV；源温度(℃):120；脱溶剂气温度(℃):350；脱溶剂气流量(L/Hr):800；气帘气流量(L/Hr):50；驻留时间(s)：0.1s3)根据样品的峰面积和标准曲线的回归方程中，计算尿液中对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯的浓度。进一步，步骤(1)样品处理方法为：取500μL尿液，加50μL水，50μL的β葡糖糖苷酸酶(80U/mL)，摇匀并密封，放入37℃水浴中加热120min。反应结束后，取反应液100μL，加入300μL沉淀剂(甲醇/乙腈＝1：1)沉淀蛋白，涡旋混匀后，15000rpm离心10min，取上清5μL进样分析。以上方法步骤(3)标准曲线的制作过程：a.标准品处理：取500μL尿液，加入50μL标准溶液，配置成相当于尿液中塑化剂各成分浓度为：5，10，25，50，100，250，500ng/ml的系列溶液，加入50υΛ的β葡糖糖苷酸酶(80U/mL)，摇匀并密封，放入37℃水浴中加热120min。反应结束后，取反应液100μL，加入300μL沉淀剂(甲醇/乙腈＝1：1)沉淀蛋白，涡旋混匀后，15000rpm离心10min，取上清5μL进样分析。b.标准曲线制作：以待测物浓度为横坐标，待测物峰面积与尿液样品相应成分峰面积的差值为纵坐标，制作标准曲线。在HPLC-MS分析时，按照常规方法绘制4种对羟基苯甲酸酯类防腐剂的标准曲线，根据其标准曲线可以确定4种对羟基苯甲酸酯类防腐剂线性方程、相关系数、检出限和定量限，具体见表3。表3HPLC-MS/MS测定对羟基苯甲酸酯类防腐剂的线性方程，相关系数，检出限LOD和定量限LOQ本发明具有的优点和积极效果是：UPLC-MS/MS检测方法检测人尿中对羟基苯甲酸酯类浓度，简单快捷，灵敏度高，抗干扰能力强，适合尿液中防腐添加剂的同时定性定量检测，过量防腐剂的食品可通过代谢在尿中检出，为食品行业中食品中防腐添加剂的监管提供了技术支持。附图说明图1是本发明的四种对羟基苯甲酸酯类的标准曲线图(A:对羟基苯甲酸甲酯；B:对羟基苯甲酸乙酯；C:对羟基苯甲酸丙酯；D:对羟基苯甲酸丁酯)。图2是最低定量限(5ng/ml)浓度混合标准品色谱图((A:对羟基苯甲酸甲酯；B:对羟基苯甲酸乙酯；C:对羟基苯甲酸丙酯；D:对羟基苯甲酸丁酯)。图3是标线(25ng/ml)浓度混合标准品色谱图((A:对羟基苯甲酸甲酯；B:对羟基苯甲酸乙酯；C:对羟基苯甲酸丙酯；D:对羟基苯甲酸丁酯)具体实施方式实施例1样品1、样品2、样品3、样品4、样品5中对羟基苯甲酸酯类浓度的检测(其样品处理方法和检测条件相同)：(1)标准品处理：取500uL尿液，加入50uL标准溶液，配置成相当于尿液中塑化剂各成分浓度为：5，10，25，50，100，250，500ng/ml的系列溶液。加入50uL的β葡糖糖苷酸酶(80U/mL)，摇匀并密封，放入37℃水浴中加热120min。反应结束后，取反应液100uL，加入300uL沉淀剂(甲醇/乙腈＝1：1)沉淀蛋白，涡旋混匀后，15000rpm离心10min，取上清5uL进行样分析。(2)标准曲线制作：以待测物浓度为横坐标，待测物峰面积与尿液样品相应成分峰面积的差值为纵坐标，制作标准曲线。标准曲线见图1。(3)样品处理：取500uL尿液，加50uL水，50uL的β葡糖糖苷酸酶(80U/mL)，摇匀并密封，放入37℃水浴中加热120min。反应结束后，取反应液100uL，加入300uL沉淀剂(甲醇/乙腈＝1：1)沉淀蛋白，涡旋混匀后，15000rpm离心10min，取上清5uL进行样分析。(4)检测条件为：三重四级杆液质联用仪，液相条件：流动相：A:0.1％FA水溶液，B:乙腈；流速：0.3ml/min；进样量：5uL；柱温：45℃；色谱柱：WatersACQUITYBEHC18,1.7μm,2.1*50mmColumn梯度洗脱程序，与表1相同质谱条件：与表2相同其他质谱参数：毛细管电压(kV):3.2kV；源温度(℃):120；脱溶剂气温度(℃):350；脱溶剂气流量(L/Hr):800；气帘气流量(L/Hr):50；驻留时间(s)：0.1s(5)根据样品的峰面积和标准曲线的回归方程中，计算尿液中4种对羟基苯甲酸酯类防腐剂的浓度(结果见表4)。表4样品1-5中4种对羟基苯甲酸酯的浓度实施例22.1方法回收率实验取六份供试品溶液，分别加等体积10，100,800ng/ml的各成分对照品溶液，混合均匀，配制成5，50,400ng/ml的各成分对照品溶液，进样，每样本平行操作六份，计算回收率。结果详见表5。表5回收率测试结果2.2方法精密度实验按QC样品配制方法配制成5，50,400ng/ml的各成分溶液，进样，每样本平行操作六份，考察方法的精密度。结果详见表6。表6方法精密度试验结果2.3溶液稳定性试验按QC样品配制方法配制成5，50,400ng/ml的各成分溶液，进样，每样本平行操作三份，考察100％加样溶液随时间的变化规律。100％加样溶液室温放置在4小时后考察各化合物浓度的变化情况，要求：化合物的RSD应不大于10.0％。若符合验证方案要求，则说明对照品溶液在该时间段内放置是稳定的，为以后检测时测试溶液放置时间的期限提供依据。结果详见表7。表7稳定性试验结果实施例3最低定量限(5ng/ml)浓度混合标准品和标线(25ng/ml)浓度混合标准品的制备和检测条件：(1)标准品处理：取500uL尿液，加入50uL标准溶液，配置成相当于尿液中塑化剂各成分浓度为：5，10，25，50，100，250，500ng/ml的系列溶液。加入50uL的β葡糖糖苷酸酶(80U/mL)，摇匀并密封，放入37℃水浴中加热120min。反应结束后，取反应液100uL，加入300uL沉淀剂(甲醇/乙腈＝1：1)沉淀蛋白，涡旋混匀后，15000rpm离心10min，取上清5uL进行样分析。(2)标准曲线制作：以待测物浓度为横坐标，待测物峰面积与尿液样品相应成分峰面积的差值为纵坐标，制作标准曲线。标准曲线见图1。(3)样品处理：取500uL尿液，加50uL水，50uL的β葡糖糖苷酸酶(80U/mL)，摇匀并密封，放入37℃水浴中加热120min。反应结束后，取反应液100uL，加入300uL沉淀剂(甲醇/乙腈＝1：1)沉淀蛋白，涡旋混匀后，15000rpm离心10min，取上清5uL进行样分析。(4)检测条件为：三重四级杆液质联用仪，液相条件：流动相：A:0.1％FA水溶液，B:乙腈；流速：0.3ml/min；进样量：5uL；柱温：45℃；色谱柱：WatersACQUITYBEHC18,1.7μm,2.1*50mmColumn梯度洗脱程序，与表1相同质谱条件：与表2相同其他质谱参数：毛细管电压(kV):3.2kV；源温度(℃):120；脱溶剂气温度(℃):350；脱溶剂气流量(L/Hr):800；气帘气流量(L/Hr):50；驻留时间(s)：0.1s检测结果的色谱图分别见图2和图3。以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。当前第1页1 2 3