一种尿液羟基多环芳烃的快速检测方法与流程

本发明涉及一种快速检测方法，特别涉及一种尿液羟基多环芳烃的快速检测方法。

背景技术：

尿中OH-PAHs是致癌性环境有机污染物PAHs的重要生物标志物，在人体对PAHs暴露及健康风险评价研究(如PAHs分子流行病学研究)中意义重大。

尿中OH-PAHs的检测流程主要包括样品前处理和仪器分析两部分。其中，样品前处理过程能够直接影响整个分析方法的灵敏度/检测限、重现性和分析速度。目前，文献报道尿中OH-PAHs的前处理技术主要包括：固相萃取(Solid phase extraction,SPE)、固相微萃取(Solid-phase microextraction,SPME)、液液萃取(Liquid-liquid extraction,LLE)、液液微萃取(Liquid-liquid microextraction,LLME)、免疫亲和萃取(Immunosorbent extraction)等。固相萃(SPE)虽然能基本满足检测的需要，但是前处理方式耗时长，有机溶剂使用量大，需要特定的实验设备且对操作者有较高的技术要求，难以满足大量样品的分析工作，无法实现对OH-PAHs的临床常规检测。

2006年，Assidi^[1]提出了用液液分散萃取(DLLME)的方法来提取水溶液中的微量有机化合物，此方法操作简单、快速，需要的萃取溶剂少，且能提供很好的回收率，但不能用于尿液样品等复杂基质中有机化合物的萃取。2008年，Leong^[2]等人对DLLME方法进行改进，他结合了固体悬浮有机液滴(SFO)的方法，使用密度小于水的低毒性有机溶剂作为萃取剂。悬浮有机液滴置于低温下凝固后，很容易被收集，弥补了传统DLLME方法的不足，此方法也被广泛应用于尿液、血液以及环境样品中极性和非极性物质的提取，但相关方法尚未实现对OH-PAHs的提取^[3,4]。2012年，Wang用液液分散萃取的方法萃取了沉积物中8种OH-PAHs，使用氯苯作为萃取剂^[5]。相关方法有望用于提取尿液中的OH-PAHs，但氯苯毒性较大，不利于操作者与环境安全。

参考文献：

1.Rezaee M,Assadi Y,Milani Hosseini MR,Aghaee E,Ahmadi F and Berijani S:Determination of organic compounds in water using dispersive liquid-liquid microextraction.J Chromatogr A.1116:1-9,2006.

2.Leong MI and Huang SD:Dispersive liquid-liquid microextraction method based on solidification of floating organic drop combined with gas chromatography with electron-capture or mass spectrometry detection.J Chromatogr A.1211:8-12,2008.

3.Ahmadi-Jouibari T,Fattahi N and Shamsipur M:Rapid extraction and determination of amphetamines in human urine samples using dispersive liquid-liquid microextraction and solidification of floating organic drop followed by high performance liquid chromatography.J Pharm Biomed Anal.94:145-51.

4.Chen B and Huang Y:Dispersive liquid-phase microextraction with solidification of floating organic droplet coupled with high-performance liquid chromatography for the determination of Sudan dyes in foodstuffs and water samples.J Agric Food Chem.62:5818-26.

5.Wang X,Lin L,Luan T,Yang L and Tam NF:Determination of hydroxylated metabolites of polycyclic aromatic hydrocarbons in sediment samples by combining subcritical water extraction and dispersive liquid-liquid microextraction with derivatization.Anal Chim Acta.753:57-63。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种尿液羟基多环芳烃的快速检测方法，该方法同时还极为绿色环保，同时也是一种高通量的检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种尿液羟基多环芳烃的快速检测方法，包括如下步骤：

1)尿样预处理：将尿样离心并对上清进行酶解处理使OH-PAHs游离，得到预处理的尿样；

2)萃取：在预处理的尿样中加入混合均匀的分散剂丙酮和萃取剂正十一醇，混匀后分层，正十一醇层悬浮于表面；

3)将样品冷却至正十一醇层凝固，取出凝固的正十一醇层溶解于有机溶剂中，进行色谱分析。

优选的，丙酮和正十一醇的体积混合比为20：(1～4)，更佳为20：(1～3)。

优选的，丙酮和正十一醇混合液与尿样的体积混合比为1：(5～40)，进一步的，丙酮和正十一醇的体积混合比为20：(1～3)。

优选的，酶解处理的操作如下：

1)在尿样上清加入pH缓冲剂并调节上清的pH至酶的最适pH；

2)加入适量葡糖甘酸酶/硫酸酯酶，混匀后振荡至酶解完全。

优选的，酶解处理时使用的pH缓冲剂为醋酸-醋酸钠缓冲体系，反应体系的pH为5～6。

优选的，萃取前，将预处理的尿样的pH调节至4～6。

优选的，萃取前，将预处理的尿样的离子质量浓度调节至15～25％。

本发明的有益效果是：

与现有技术相比，发明采用分散液液萃取-上浮液滴固化法快速富集，高效液相色谱-荧光检测方法，快速有效地检测尿液中的OH-PAHs，其中前处理过程采用微量的有机溶剂(400μL丙酮和40μL正十一醇)进行快速注射提取，处理过程仅需15分钟即可完成；使用溶剂量是传统固相萃取的1/30，处理时间仅为传统方法的1/16，大大降低了流行病学上大量样本的处理成本和分析时间，同时也更为绿色环保，有利于保护对分析操作人员的身体健康。

附图说明

图1是尿液pH值对6种加标OH-PAHs回收率的影响；

图2是萃取剂(正十一醇)的体积对回收率的影响；

图3是分散剂的选择对回收率的影响；

图4是分散剂的体积对回收率的影响；

图5是盐的添加量对回收率的影响。

具体实施方式

一种尿液羟基多环芳烃的快速检测方法，包括如下步骤：

1)尿样预处理：将尿样离心并对上清进行酶解处理使OH-PAHs游离，得到预处理的尿样；

2)萃取：在预处理的尿样中加入混合均匀的分散剂丙酮和萃取剂正十一醇，混匀后分层，正十一醇层悬浮于表面；

3)将样品冷却至正十一醇层凝固，取出凝固的正十一醇层溶解于有机溶剂中，进行色谱分析。

优选的，丙酮和正十一醇的体积混合比为20：(1～4)，更佳为20：(1～3)。

优选的，丙酮和正十一醇混合液与尿样的体积混合比为1：(5～40)，进一步的，丙酮和正十一醇的体积混合比为20：(1～3)。

优选的，酶解处理的操作如下：

1)在尿样上清加入pH缓冲剂并调节上清的pH至酶的最适pH；

2)加入适量葡糖甘酸酶/硫酸酯酶，混匀后振荡至酶解完全。

优选的，酶解处理时使用的pH缓冲剂为醋酸-醋酸钠缓冲体系，反应体系的pH为5～6。

调节尿液的pH值，增加或减少尿液中质子的总量，可有利于OH-PAHs的萃取。优选的，萃取前，将预处理的尿样的pH调节至4～6。

在尿液中添加盐溶液增加尿液中的离子强度，有利于OH-PAHs以分子形式存在于尿液中，易于萃取。优选的，萃取前，将预处理的尿样的离子质量浓度调节至15～25％。

下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。

目标物标准溶液的配制

购于Cambridge Isotope Laboratories的单标浓度均为50mg/L，作为储备液；OH-PAHs标准混合使用液：量取OH-PAHs各单体的标准储备液于10mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，得到OH-PAHs浓度为5mg/L的混合标准使用液。稀释混标得到浓度分别为10、50、250μg/L，作为加标尿样的浓度。标样密封于-20℃冰箱避光保存。

样品预处理

1)样品离心：取出冷藏样品放至室温后，取多于5mL的尿样，3000r/min离心后，取上层清液；

2)样品的酶解：准确量取5mL尿样(离心后的上层清液)于具塞刻度离心管中，加回收率指示物使用溶液10μL，混匀后加0.5mL盐酸和1.5mL醋酸钠和醋酸的缓冲溶液，调节pH值为5.5，加20μL葡糖甘酸酶/硫酸酯酶，混匀后置于恒温振荡箱中反应16h，恒温37℃，振荡箱振荡速度100r/min。

样品的萃取

1)取上述酶解好的尿样5ml，分别加入不同比例混合均匀的分散剂和萃取剂正十一醇，之后用注射器吸取混合均匀的分散剂和萃取剂，快速注入尿样中，混匀进行萃取；

2)萃取完成后离心，使正十一醇悬浮于表面，将样品冷冻至正十一醇凝固；

3)取出凝固的正十一醇，用甲醇溶解，过0.2μm的尼龙膜去除颗粒物后进行色谱分析。

下面基于上述样品的萃取处理流程，改变其中的部分条件，确定不同萃取条件对OH-PAHs回收率的影响。

pH对加标化合物回收率的影响

在加标(6种OH-PAHs)浓度为50μg/L的尿样中，调节尿液的pH值分别为2、3、4、5、6、7、8和9，添加2.0g的NaCl调节盐溶液浓度，取400μL丙酮与40μL的正十一醇混合，萃取时间为5min，比较加标化合物的回收率。实验结果如图1所示，从图中可以看出，pH 3～6时，6种OH-PAHs均具有较好的回收率，pH为5时最佳。

萃取剂同量对加标化合物回收率的影响

在加标(6种OH-PAHs)浓度为50μg/L的尿样中，调节尿液的pH值为5，添加2g NaCl调节盐溶液浓度，取分散剂为400μL丙酮分别与30、40、50、60和70μL体积的萃取剂(正十一醇)混合，萃取时间为5min，比较加标化合物的回收率。实验结果如图2所示，从图中可以看出，正十一醇的添加量对6种OH-PAHs的回收率有一定的影响，添加量在30～70μL时均具有较好的回收率，特别是其用量为40μL时，具有最佳的综合回收率。

分散剂对回收率的影响

在加标(6种OH-PAHs)浓度为50μg/L的尿样中，调节尿液的pH值为5，添加2g NaCl调节盐溶液浓度，取分散剂的体积为400μL，三种溶剂(甲醇、乙腈和丙酮)分别与40μL的正十一醇混合，萃取时间为5min，比较加标化合物的回收率。实验结果如图3所示，从图中可以看出，当分散剂为丙酮时，能使6种OH-PAHs均获得良好的回收率。

分散剂体积对回收率的影响

在加标(6种OH-PAHs)浓度为50μg/L的尿样中，调节尿液的pH值为5，添加2g NaCl调节盐溶液浓度，取分散剂丙酮的体积分别为200、300、400、500和600μL，分别与40μL的正十一醇混合，萃取时间为5min，比较加标化合物的回收率。实验结果如图4所示，从图中可以看出，丙酮的用量在200～400μL时，6种OH-PAHs的回收率均可以接受，综合考虑，丙酮的体积为400μL时，6种OH-PAHs的回收率最佳。

盐溶液的量对回收率的影响

在加标(6种OH-PAHs)浓度为50μg/L的尿样中，调节尿液的pH值为5，分别添加0.5、1.0、1.5和2.0g的NaCl调节盐溶液浓度，取400μL丙酮与40μL的正十一醇混合，萃取时间为5min，比较加标化合物的回收率。实验结果如图4所示，从图中可以看出，盐的添加量在1～2g时，6种OH-PAHs的回收率均可以接受，盐的添加量为2时，6种OH-PAHs可以获得最佳的回收率。

萃取时间对回收率的影响

在加标(6种OH-PAHs)浓度为50μg/L的尿样中，调节尿液的pH值为5，添加2.0g的NaCl调节盐溶液浓度，取400μL丙酮与40μL的正十一醇混合，萃取时间分别为2、5、10和20min，比较加标化合物的回收率。发现随着萃取时间的增加，化合物的回收率几乎没变化，因此认为分散液液萃取过程非常快速，为了达到充分的萃取，最终选择萃取时间为5min。

综上，为获得最佳的萃取效果，选择的萃取条件为：每5ml酶解处理后的尿样，调节尿液的pH值为5，添加2.0g的NaCl调节盐溶液浓度，取400μL丙酮与40μL的正十一醇混合，萃取时间为5min。

采用上述优化的萃取条件，将处理得到的固化正十一醇取出，溶于400μL甲醇中，过0.2μm的尼龙膜去除颗粒物，进液相色谱检测分析。

液相色谱及检测器条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱子，内径4.6mm,长250mm,不锈钢柱。柱填充：C18键合多孔硅胶，粒径5μm；柱温：25℃；流动相梯度淋洗比例和流速见表1；检测波长见表2；进样量：20μL。

表1流动相比例及流速

表2紫外光检测参数

以甲醇为溶剂将下述目标物标样配置得到不同的浓度梯度(共7个检测点)，绘制标准曲线并检测计算其线性范围。当线性系数(R²)>0.999时，表明线性较好，可由此进行定量计算。其中，RSD为同一浓度3次检测的标准偏差，LOD为最低检测浓度，LOQ为最低定量浓度，浓缩倍数为尿液处理后体积较原始样本体积的缩小倍数。实验结果如表3所示。

表3 DLLME-SFO方法分析人体尿液的分析特征

将相应标准品按如下加标浓度分别加入尿液样本中，经样本处理与萃取后，计算相应目标物的回收率。实验结果如表4所示。

表4各种加标浓度下的回收率

在上述优化的萃取条件下，采用高效液相色谱荧光检测器检测，6种羟基多环芳烃的富集倍数可达到52～65倍；各化合物的回收率达到70.4％～129％；方法检出限(S/N＝3)在0.5～1.0μg/L。