一种通过水蒸馏提取烟叶中挥发性致香物构建烟叶指纹图谱的方法与应用与流程

本发明涉及检测领域，特别是指一种通过水蒸馏提取烟叶中挥发性致香物构建烟叶指纹图谱的方法，本发明还涉及所述方法在烟叶挥发性致香物分析中的应用。

背景技术：

烟草在我国种植历史悠久，是我国重要的经济作物之一。烟叶质量是反映和体现烟叶必要性状均衡情况的综合性概念,它包括外观质量和内在质量。长期以来，烟叶品质主要由四个方面进行评价和分类,即外观质量、感官评吸、化学分析、物理特性，从某个角度看，仍不能全面地满足要求。如化学分析只有8、9个指标，强调共性；外观评价和感官评吸受主观因素的影响较大。为此，国内外专家做了大量的研究工作，以期客观准确地评价烟叶质量，化学成分分析就是其中一项主要的研究内容。

指纹图谱是指某些复杂物质，比如中药，某种生物体或某种组织或细胞的DNA，蛋白质经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。

指纹图谱主要分为中药指纹图谱，DNA指纹图谱和肽指纹图谱。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。在此基础上，如果进一步开展谱效学研究，可使中药质量与其药效真正结合起来，有助于阐明中药作用机理。总之，中药指纹图谱的研究和建立，对于提高中药质量，促进中药现代化具有重要意义。

烟叶是烟草的主要经济部位，不同的品种，不同地区，甚至不同环境(如降雨量、施肥量等)都会对烟叶的品质和风味造成不同的影响，烟叶的风味也是区分不同烟叶的主要标准，而烟叶风味的形成，主要由内部的几种主要的组分构成，尤其是具有挥发性的致香物。

但目前，这些物质的检测和评价，还主要集中在人工评价，以及一些简单的化学分析，在精准度方面还远远不够，并且，在不同的烟叶之间的区分，尤其是一些较为细微的区分，如前述一些种植过程中环境因素的变化，对于烟叶风味的调整，常规的手段较为难以区分，这对于进一步提升和改善烟叶的品质，实现我国“卷烟上水平”战略任务造成了困难。

因此，需要充分结合一些新兴的技术，以及烟叶这一产品的特色，对烟叶的检测方法和方式，都进行改善。

技术实现要素：

本发明提出一种通过水蒸馏提取烟叶中挥发性致香物构建烟叶指纹图谱的方法及其在烟叶挥发性致香物分析中的应用，为烟叶的深入研究提供了更加科学可靠的方法。

本发明的技术方案是这样实现的：一种通过水蒸馏提取烟叶中挥发性致香物构建烟叶指纹图谱的方法，包括：称取烤烟叶，剪成小片装入的圆底烧瓶内，加入1000mL水，电热套加热；在另一250mL烧瓶中加入50mL石油醚，水浴加热，同时蒸馏萃取2h后，保留石油醚萃取液，加无水硫酸钠干燥24h，用旋转蒸发仪在50℃水浴中将其浓缩至3mL左右，即得香气浓缩物，供GC/MS分析。

进一步，GC条件为：Ultra－2毛细管柱，载气为N₂，柱头压170kPa。

进一步，烤烟叶小片的大小为(0.5–1)×(0.5–1)cm。

进一步，其中检测器FID进样口温度280℃，检测器温度280℃，进样量2μl，分流比10∶1。

进一步，在GC/MS测定时，电离电压70ev，离子源温度200℃，传输线温度220℃，使用Wiley谱库进行图谱检索。

一种通过水蒸馏提取烟叶中挥发性致香物构建烟叶指纹图谱的方法在烟叶挥发性致香物分析中的应用。通过构建出不同烟叶中挥发性致香物的指纹图谱，形成烟叶挥发性致香物的指纹图谱库，并针对所述烟叶挥发性致香物的指纹图谱库进行划分，形成对不同烟叶挥发性致香物的分类与划分。

本发明的所述通过水蒸馏提取烟叶中挥发性致香物构建烟叶指纹图谱的方法，结合指纹图谱技术和烟叶的特质，创造性的形成了对烟叶中挥发性致香物构建烟叶指纹图谱构建，并具体采用了水蒸馏提取的方式，保证了烟叶中物质的有效获取，并防止物质的损伤或者变化。所述通过水蒸馏提取烟叶中挥发性致香物构建烟叶指纹图谱的方法在烟叶挥发性致香物分析中的应用，也为烟叶的风味的深入研究提供了新的方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为南雄粤烟97(C3F)2008烤烟精油指纹图谱；

图2为南雄粤烟97(C3F)2009烤烟精油指纹图谱。

图3为南雄粤烟97(X2F)2009烤烟精油指纹图谱。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

南雄粤烟97(C3F)2008烤烟挥发性香气物组成成分指纹图谱构建分析

称取50.00g烤烟叶,剪成小片(约0.5–1×0.5–1cm大小)装入2000mL的圆底烧瓶内,加入1000mL水,电热套加热；在另一250mL烧瓶中加入50mL石油醚,水浴加热,同时蒸馏萃取2h后,保留石油醚萃取液,加无水硫酸钠干燥24h,用旋转蒸发仪在50℃水浴中将其浓缩至3mL左右,即得香气浓缩物,供GC/MS分析。

GC条件：Ultra－2毛细管柱(50m×0.2mm×0.33μm)，载气为N₂，柱头压170kPa，检测器FID，进样口温度280℃,检测器温度280℃,程序升温:80℃(1min),2℃/min,至280℃(30min)，进样量2μl，分流比10∶1。GC/MS测定时GC条件同上，电离电压70ev，离子源温度200℃，传输线温度220℃，使用Wiley谱库进行图谱检索。

南雄粤烟97(C3F)2008烤烟挥发性香气物组成成分分析结果见表1。从图1可辩出10个峰，其中主要挥发性成份有：2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、尼古丁、大马酮、2-叔丁基苯并噻吩、氧化茄酮、巨豆三烯酮-2(二个峰)、3-羟基马铃薯螺二烯酮、棕榈酸和硬脂酸酸。它们的相对含量分别是：21.65％、4.84％、4.47％、3.76％、11.02％、18.44％、1.90％、4.01％、5.21％和3.30％。

表1南雄C3F烟叶精油主要致香成分(2008)

实施例2

南雄粤烟97(C3F)2009烤烟挥发性香气物组成成分指纹图谱分析

南雄粤烟97(C3F)2009烤烟挥发性香气物组成成分分析结果见表2。从表2可以看出，粤烟97(C3F)烤烟精油中可检测出67种成分，除邻二甲苯、间二甲苯、苯并噻唑和四十四烷不为非香味成分外，其它63种为致香物质,它们的代谢途径与主要致香物的分类如下：

代谢转化产物有：

(1)类胡萝卜素的降解和转化产物有：香叶基丙酮1.06％、4-氧代异氟尔酮含量0.06％、β-环柠檬醛和藏红花醛0.16％、二氢猕猴桃内酯0.31％,β-紫罗兰酮4.13％、4-(2,6,6-三甲基-1,3-环己二烯)-3-丁烯-2-酮(大马酮)0.54％,4-羟大马士酮0.1％、β-大马烯酮含量4.13％、巨豆三烯酮11.83％；

(2)叶绿素分解代谢产物,新植二烯22.64％。

(3)苯丙氨酸和本质素代谢产物有：苯甲醛0.15％,2,5-二甲基苯甲醛0.03％、苯乙醛0.4％,苯甲醇0.42％、苯乙醇0.46％

(4)类脂物的降解产物：亚油酸2.98％、亚麻酸甲酯、十四烷酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、二十七烷酸和四十四烷酸,分别含量为1.2％、0.33％、26.39％、0.55％、1.2％、0.33％和0.33％、棕榈酸甲酯0.29％。

(5)非酶棕化反应产物有：2-戊基呋喃、2-甲基四氢呋喃-3-酮。

(6)西柏烯降解产物：茄酮2.51％。

致香物类型：

(1)酮类

2-戊基呋喃0.01％、2-甲基四氢呋喃-3-酮0.01％、2,3-辛二酮0.01％、6-甲基-5-庚烯-2-酮0.06％、4-氧代异氟尔酮0.06％、E-5-异丙基-8-甲基-6,8-壬二烯-2-酮(茄酮)2.51％、4-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-3-丁烯-1-酮(4-羟大马士酮)0.1％、香叶基丙酮1.06％、β-紫罗兰酮0.19％、4-[2,2,6-三甲基-7-氧杂双环[4.1.0]庚-1-基]-3-丁烯-2-酮0.34％、4-(2,6,6-三甲基-1,3-环己二烯)-3-丁烯-2-酮(大马酮)0.54％、植酮0.11％、巨豆三烯酮11.83％、法尼基丙酮0.42％、1-亚甲基-7-甲基-5-(二甲基亚甲基)双环[5.3.0]-7-癸烯-3-酮0.22％。酮类占致香物的17.47％。

(2)醛类

壬醛0.02％、糠醛0.34％、癸醛0.03％、苯甲醛0.15％、反式-2-壬烯醛0.04％、β-环柠檬醛0.12％、藏红花醛0.04％、苯乙醛0.4％、2,5-二甲基苯甲醛0.03％。醛类占致香物的1.17％。

(3)醇类

异辛醇0.22％、3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇(沉香醇)0.10％、苯甲醇0.42％、苯乙醇0.46％、叶绿醇0.02％、9-(1,1-二甲基丙烯基)-5-香柠檬醇0.21％、西柏三烯二醇1.48％、1,5,9-三甲基-12-异丙基-4,8,13-环十四烯-1,3-二醇1.13％、柏木醇0.08％。醇类占致香物的4.12％。

(4)脂肪酸类

壬酸0.17％、肉豆蔻酸1.20％、十五烷酸0.33％、棕榈酸26.39％、十七烷酸0.55％、硬脂酸1.20％、反油酸2.19％、亚油酸2.98％。脂肪酸类占致香物的35.01％。

(5)酯类

邻苯二甲酸二异丁酯0.87％、棕榈酸甲酯0.29％、二氢猕猴桃内酯0.31％、亚麻酸甲酯4.03％。酯类占致香物的5.50％

(6)稠环芳香烃类

1,2,3,4-四氢-1,1,6-三甲基萘0.02％、1,2-二氢-1,1,6-三甲基萘0.25％。稠环芳香烃类占致香物的0.27％。

(7)酚类

4-甲氧基苯酚0.08％、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚1.00％。酚类占致香物的1.08％。

(8)不饱和脂肪烃类

1-十四烯0.02％、3,6-二氧-1-甲基-8-异丙基-三环[6,2,2,0(2,7)]十二-4,9-二烯0.03％、(E,E)-7,11,15-三甲基-3-亚甲基-十六-1,6,10,14-四烯0.14％、(E)-1-叠氮基-2-苯乙烯0.06％。不饱和脂肪烃类占致香物的0.25％。

(9)烷烃类

7-甲基-四环[4.1.0.0(2.4).0(3.5)]庚烷0.01％、二十七烷0.33％、四十四烷0.33％。烷烃类占致香物的0.67％。

(10)生物碱类

烟碱1.51％、二烯烟碱0.05％。生物碱类占致香物的1.56％。

(11)萜类

新植二烯22.64％、角鲨烯0.36％。萜类占致香物的23.00％。

(12)杂环类

2-乙酰基吡咯0.12％、苯并噻唑0.1％。杂环类占致香物的0.22％。

(13)芳香烃类

2,3-二氢-1,1,5,6-四甲基-1H-茚0.03％。芳香烃类占致香物的0.03％。

表2南雄C3F烟叶精油主要致香成分(2009)

实施例3

南雄粤烟97(X2F)2009烤烟挥发性香气物组成成分指纹图谱分析

南雄粤烟97(X2F)2009烤烟挥发性香气物组成成分分析结果见表3。从表3可以看出,粤烟97(X2F)烤烟精油中可检测出68种成分,除对二甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、苯并噻唑和四十四烷为非香味成分外,其它63种为致香物质,它们代谢途径与主要致香物的分类如下：

代谢转化产物有：

⑴类胡萝卜素的降解和转化产物有：香叶基丙酮1.23％、4-氧代异氟尔酮含量0.05％、β-环柠檬醛和藏红花醛0.16％、二氢猕猴桃内酯0.32％、β-紫罗兰酮0.16％、4-(2,6,6-三甲基-1,3-环己二烯)-3-丁烯-2-酮(大马酮)0.29％、4-羟大马士酮0.15％、β-大马烯酮含量3.86％、巨豆三烯酮8.56％。

⑵叶绿素分解代谢产物,新植二烯19.39％。

⑶苯丙氨酸和本质素代谢产物有：苯甲醛0.06％、2,5-二甲基苯甲醛0.03％、苯乙醛0.11％,苯甲醇0.24％、苯乙醇0.19％。

⑷类脂物的降解产物：亚油酸5.26％、亚麻酸甲酯9.02％、十四烷酸1.29％、十五烷酸1.18％、棕榈酸28.49％、十七烷酸0.54％、硬脂酸1.39％、反油酸2.53％、棕榈酸甲酯0.44％。

⑸西柏烯降解产物：茄酮1.6％。

致香物类型：

⑴酮类

6-甲基-5-庚烯-2-酮0.13％、4-氧代异氟尔酮0.05％、E-5-异丙基-8-甲基-6,8-壬二烯-2-酮(茄酮)1.6％、4-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-3-丁烯-1-酮(4-羟大马士酮)0.15％、香叶基丙酮1.23％、β-紫罗兰酮0.16％、β-大马烯酮含量3.86％、4-[2,2,6-三甲基-7-氧杂双环[4.1.0]庚-1-基]-3-丁烯-2-酮0.29％、4-(2,6,6-三甲基-1,3-环己二烯)-3-丁烯-2-酮(大马士酮)0.36％、植酮0.14％、巨豆三烯酮8.56％、法尼基丙酮0.56％、1-硫茚-2,3-C-喹啉-6(5H)-硫酮0.02％、2-环戊烯-1,4-二酮0.02％、α-香附酮0.4％。酮类占致香物的17.53％。

⑵醛类

壬醛0.02％、糠醛0.18％、癸醛0.03％、苯甲醛0.06％、(E)-壬烯醛0.05％、反-2-顺-6-壬二烯醛0.1％、β-环柠檬醛0.11％、藏红花醛0.05％、苯乙醛0.11％、2,5-二甲基苯甲醛0.03％。醛类占致香物的0.74％。

⑶醇类

异辛醇0.23％、3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇(沉香醇)0.08％、苯甲醇0.24％、苯乙醇0.19％、反式橙花叔醇0.03％、金合欢醇0.04％、叶绿醇0.15％、9-(1,1-二甲基丙烯基)-5-香柠檬醇0.21％、西柏三烯二醇0.79％、柏木醇0.1％。醇类占致香物的2.06％。

⑷脂肪酸类

壬酸0.26％、肉豆蔻酸1.29％、十五烷酸1.18％、棕榈酸28.49％、十七烷酸0.54％、硬脂酸1.39％、反油酸2.53％、亚油酸5.26％。脂肪酸类占致香物的40.94％。

⑸酯类

邻苯二甲酸二异丁酯0.33％、棕榈酸甲酯0.44％、二氢猕猴桃内酯0.32％、亚麻酸甲酯9.02％。酯类占致香物的10.11％。

⑹稠环芳香烃类

1,2,3,4-四氢-1,1,6-三甲基萘0.03％、1,2-二氢-1,1,6-三甲基萘0.28％、三甲基四氢化萘0.02％。稠环芳香烃类占致香物的0.33％.

⑺酚类

邻甲氧基苯酚0.05％、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚0.96％。酚类占致香物的1.01％。

⑻不饱和脂肪烃类

2,6-二甲基-2-反式-6-辛二烯0.03％、3,6-氧代-1-甲基-8-异丙基三环[6.2.2.0(2,7)]十二4,9-二烯0.03％、(E,E)-7,11,15-三甲基-3-亚甲基-1,6,10,14-十六碳烯0.11％。不饱和脂肪烃类占致香物的0.17％。

⑼烷烃类

戊基环丙烷0.02％、二十七烷0.22％、二十九烷0.73％％、三十五烷0.72％、四十四烷0.47％。烷烃类占致香物的2.16％。

⑽生物碱类

烟碱0.23％。生物碱类占致香物的0.23％

⑾萜类

新植二烯19.39％。萜类占致香物的19.39％。

⑿杂环类

3-乙基-2,4-二甲基吡啶0.02％、苯并噻唑0.16％。杂环类占致香物的0.18％。

表3：南雄粤烟97(X2F)2009烤烟精油香气物组成

从上述实施例可以明显的看出，即使是同一烤烟品种、同一采摘部分的不年份，或同一烤烟品种同一年份不同采摘部位，采用上述的方法进行指纹图谱的构建后，都能够进行区分，并形成对同一品种的不同部位、不同年份的指纹图谱分析，为深入分析南雄粤烟97的风味提供了更为可靠科学的方法，为获得更加具有特色风味的烤烟提供了更好的思路与方法。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。