一种高通量的植物抗旱性突变体的筛选方法及装置与流程

本发明涉及植物突变体的筛选技术领域，尤其涉及一种高通量的植物抗旱性突变体的筛选方法及装置。

背景技术：

在自然或农业生产条件下，植物不断遭受着环境胁迫。其中由水分亏缺引起的干旱胁迫最为严峻。不同的物种、基因型对干旱胁迫环境的适应性会不同，表现的抗旱性、生存能力也不同。因此筛选抗旱性强的基因型作物，有利于提高水分利用率，同时也能为作物产量的提高作出贡献。

植物的抗旱性是复杂的数量性状，对于大规模的突变体筛选工作，一个高通量的、快速、方便、重复性好的抗旱性筛选方法及指标是成败的关键。在国内，抗旱性筛选方法大多采用生物化学测量方法，步骤相对复杂、测量周期较长，难以应用于大批量筛选工作。

叶绿素荧光作为植物光合作用的探针，已经成为跟踪植物干旱胁迫下光合作用变化的有利工具；叶绿素荧光参数可以反映光合机构的“内部”特征。

目前，叶绿素荧光技术已初步应用于突变体筛选工作。公开号为CN104007093A的中国专利文献公开了一种快速定量计算植物固有抗干旱能力的方法，包括以下步骤：将待测植物叶片清理后放入水中浸泡，30分钟后取出叶片并将表面的水吸干；用IMAGING-PAM调制式叶绿素荧光仪测定0水平荧光时叶片的初始荧光(Fo)和PS II最大光化学量子产量(Fv/Fm)，重复3次；随后，让上述叶片失水，每隔1小时重复上述操作。将饱水0小时的测得结果作为参照，计算各测定时刻的相对Fo和相对Fv/Fm，分别相加得到饱水后前5个小时累积相对Fo(TRSF)和累积相对Fv/Fm(TRPF)。比较TRSF和TRPF数值大小，定量不同植物固有的抗干旱能力。该技术方案存在一些问题，即操作过程复杂、检测精度不高、自动化水平不高。

而叶绿素荧光成像技术可以实现荧光参数在叶片空间分布的可视化，并且能够分析不同耐旱性植物的叶片表面以及叶片之间光合作用活动的异质性。

RGB成像分析技术能快速准确地提供植株的叶片投影面积和叶片颜色。叶面积的减小被认为是植物抵御干旱胁迫的第一道防线；叶片颜色可以用来评估干旱胁迫对叶绿素的降解的作用程度。目前，该技术应用于突变体筛选工作还比较少见。

技术实现要素：

本发明提供一种高通量的植物抗旱性突变体的筛选方法及装置，通过结合叶绿素荧光成像技术和RGB成像技术，进行高通量、高精度识别筛选植物抗旱性突变体。

一种高通量的植物抗旱性突变体的筛选方法，包括：

(1)对具有不同抗旱程度的植物抗旱性突变体进行干旱处理，建立建模样本；

(2)将建模样本暗适应后，分别采集建模样本的叶绿素荧光图像和RGB图像，对叶绿素荧光图像和RGB图像进行预处理并计算特征值；

(3)将计算得到的特征值最为输入变量，将建模样本已知的抗旱程度作为输出变量，建立突变体抗旱程度判别模型；

(4)对待筛选植株进行干旱处理，采集叶绿素荧光图像和RGB图像并提取特征值，代入突变体抗旱程度判别模型确定待筛选植株的抗旱程度。

本发明高通量的植物抗旱性突变体的筛选方法，通过结合叶绿素荧光成像技术和RGB成像技术，并利用图像处理技术计算叶绿素荧光特征参数、形态特征参数和颜色特征参数，采用模式识别筛选高度抗旱、抗旱、不抗旱和易干旱共4个梯度的抗旱性突变体。

为了提高筛选效率，建模样本中的抗旱性突变体选择健康、大小一致、饱满的种子，每个品种大于100株；选择最佳栽种环境条件，包括温度、湿度、光照强度、土壤等；选择在合适的(由植株类型决定)生长期停止供水。

作为优选，步骤(2)中，所述的叶绿素荧光图像包括：暗适应后的最小荧光图像Fo、暗适应后的最大荧光图像Fm、光适应后的最大荧光图像Fm′、最大光量子效率图像FV/FM＝(Fm-Fo)/Fm及非光化荧光淬灭系数图像NPQ＝(Fm-Fm′)/Fm′。

作为优选，步骤(2)中，对叶绿素荧光图像和RGB图像进行预处理并计算特征值，包括：

对叶绿素荧光图像进行平滑滤波、图像分割并计算冠层区域的叶绿素荧光图像的均值、方差值；

对RGB图像进行畸变校正、白板校正、平滑滤波、图像分割并计算形态特征值和颜色特征值。

作为优选，所述的形态特征值包括叶面积、叶周长和叶宽指数；所述的颜色特征值包括色调H、红光标准化值R/(R+G+B)、绿光与红光的比值G/R。

为了提高突变体抗旱程度判别模型的准确性，作为优选，步骤(3)中，采用随机森林(random forest，RF)机器学习方法构建突变体抗旱程度判别模型。

采用随机森林机器学习方法构建突变体抗旱程度判别模型基于MATLAB软件进行。

本发明还提供了一种高通量的植物抗旱性突变体的筛选装置，包括：

遮光室，遮光室设有开关门，遮光室内设置有：

支撑架；

平移装置，设置在支撑架的顶部，可沿支撑架的顶部水平往复运动；

光源和成像模块，朝下固定安装在平移装置上；

载物台，设置在平移装置下方，载物台设有升降机构；

还包括控制台，控制台包括：

计算机，通过分析处理来自成像模块采集的图像信息，对植株的抗旱程度进行判定；

数据采集模块，分别与计算机和成像模块相连，用于将成像模块采集的图像信息实时传输给计算机；

控制模块，分别与计算机、平移装置、载物台、光源和成像模块相连，用于接收计算机发出的指令，对平移装置、载物台、光源和成像模块进行控制。

本发明提供的筛选装置，能实现图像采集、分析、诊断功能的自动化，操作简单，适用于大规模的植物抗旱性突变体筛选。

为了方便安装使用并提高移动的稳定性和精度，作为优选，所述的平移装置包括水平固定在支撑架顶部的平移轨道和设置在平移轨道上的滚珠丝杠副。

为了增强光照强度，均匀光源分布并实现叶绿素荧光图像的测量，作为优选，所述的光源模块包括光源板和LED灯，光源板的几何中心镂空，LED灯环绕光源板的几何中心安装，成像模块安装在光源板的镂空区域。

所述的LED灯包括：

红橙光LED灯，产生波长为620nm的测量光；

白光LED灯，产生波长为450～465nm的光化光和饱和光；

色温LED灯，产生色温为3700～5000K的白光。

成像模块包括叶绿素荧光成像仪和RGB成像仪，为了减轻负载，成像模块包括叶绿素荧光成像仪和RGB成像仪集成在一起，作为优选，所述的成像模块包括CCD相机、镜头和滤波轮。

为了提高避光效果，作为优选，遮光室的内壁上设有吸光涂层。

本发明的植物抗旱性突变体的筛选方法及装置适用于不同品种植株的抗旱性突变体筛选。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明有效解决现有的突变体筛选工作中普遍存在的测定方法繁复、效率低、周期长等问题，提出了一种高通量的筛选方法，对抗旱育种工程的意义重大；本发明提供的突变体筛选装置切实、可行，经济效益和社会效益十分显著；

(2)图像采集、处理、分析工作无需人工操作，均由计算机、控制模块、数据采集模块等控制完成，减少人力耗费，提高了筛选工作的速度与精度；

(3)本发明应用成像技术，相较于单点或多点测量，获取的数据信息更丰富，结合图像处理技术的分析使测量精度大大提高。

附图说明

图1为本发明的筛选装置的内部结构示意图；

图2为本发明的光源和成像模块的结构示意图。

其中，1、支撑架；2、平移轨道；3、光源和成像模块；3-1、LED灯；3-2、光源板；3-3、成像模块；4、载物台；5、防滑垫；6、待筛选突变体植株。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述。

本发明高通量的植物抗旱性突变体的筛选装置包括：

遮光室，遮光室开设有开关门；

如图1所示，遮光室内设有支撑架1，支撑架1顶部安装有平移轨道2，平移轨道2上安装有可沿平移轨道2往复运动的平移机构，光源和成像模块3朝下安装在平移机构上；平移轨道2下方设有可升降的载物台4；

还包括控制台，控制台包括计算机、控制模块、数据采集模块，图像数据的传输、图像信息的保存、分析处理及筛选均由室外的控制台进行。

支撑架1由8根支撑杆组成，为了提高支撑架1的稳定性，支撑杆之间采用焊接的方式进行连接，并且支撑架1的底部装有防滑垫5。

平移轨道2为相互平行设置的2根，平移机构为安装在平移轨道2上的滚珠丝杠副，可沿平移轨道2的长度方向往复运动，光源和成像模块3朝下安装在平移机构上。

如图2所示，光源和成像模块3中，光源模块包括LED灯3-1和光源板3-2，光源板3-2为“回”字形状，几何中心镂空，LED灯3-1环绕光源板3-2的几何中心进行安装，LED灯3-1包括：

红橙光LED灯，产生波长为620nm的测量光；

白光LED灯，产生波长为450～465nm的光化光和饱和光；

色温LED灯，产生色温为3700～5000K的白色光；

成像模块3-3由CCD相机、镜头和滤波轮组成，镜头上装有滤波轮，用于选择不同的波长的入射光。成像模块3-3安装在光源板3-2几何中心的镂空区域。

载物台4下方安装有升降机构，升降机构为滚珠丝杠副。待筛选突变体植株6放置在载物台4上。

控制台包括计算机、控制模块、数据采集模块。控制模块实现光源和成像模块3的往复匀速运动，并可通过计算机软件设置速度及任意位置的停止；控制模块也可实现对载物台4的升降运动，并可通过计算机软件设置物镜距离；控制模块也可以控制任意一种LED灯3-1的光照强度及开关，同时也可以控制成像模块3-3图像采集的开始或停止，还可以控制滤波轮选择不同波长的入射光。

高通量的植物抗旱性突变体的筛选方法如下：

(1)将一定数量的受干旱胁迫处理的建模样本放置在载物台4上暗适应20min以上；

建模样本为抗旱等级已知的抗旱性突变体样本，选择5种以上抗旱性突变体，每个抗旱等级的突变体至少选择1种，每种突变体样本的数量为100，抗旱等级分别用不同数值表示，即高度抗旱为0、抗旱为1、不抗旱为2和易干旱为3；

(2)由计算机软件通过数据线发送控制指令，调整平移机构的移动速度与载物台4的高度，使平移机构往x轴正方移动固定的距离，并停止；

(3)由计算机软件通过数据线发送控制指令，先后地控制：

红橙光LED灯产生红橙光脉冲，同时成像模块3-3采集暗适应后的最小荧光Fo图像；

白光LED灯产生波长为450nm～465nm、光强为1100μmol·m^-2·s^-1的白光脉冲，同时成像模块3-3采集暗适应后的最大荧光Fm图像；

白光LED灯产生波长为450nm～465nm、光强为100μmol·m^-2·s^-1的白光脉冲，接着白光LED灯产生波长为450nm～465nm、光强为1100μmol·m^-2·s^-1的白光脉冲，成像模块3-3采集光适应后的最大荧光Fm′图像；

色温LED灯产生色温为3700～5000K的白光；成像模块3-3采集RGB图像；

以上图像通过数据线传入数据采集模块；

(4)由计算机软件发送控制指令，使平移机构往x轴正方向移动至固定距离停止，采集图像，依次循环直至采集完控制平台上的所有样本；

(5)由计算机软件通过Fo图像、Fm图像、Fm′图像计算最大光量子效率FV/FM图像及非光化荧光淬灭系数NPQ图像，然后对上述Fo、Fm、Fm′、FV/FM、NPQ图像进行平滑滤波，并通过大津(OTSU)法进行图像分割获取冠层区域，计算该区域的均值(MFo、MFm、MFm′、MFV/FM、MNPQ)、方差值(σFo、σFm、σFm′、σFV/FM、σNPQ)；

最大光量子效率FV/FM＝(Fm-Fo)/Fm；

非光化荧光淬灭系数NPQ＝(Fm-Fm′)/Fm′；

对RGB图像用张氏校正法进行畸变校正，再进行白板校正和平滑滤波，通过OTSU法进行图像分割获取冠层区域，计算该区域的叶面积S、叶周长L、叶宽指数W、色调H、红光标准化值R/(R+G+B)、绿光与红光的比值G/R；

(6)导入特征值并划分训练集和测试集，训练集和测试集的比例为2∶1；设定随机森林分类器参数，包括决策树数量ntree、每个节点随机选择候选属性的个数mtry；

(7)采用袋装法(Bagging)抽取每棵决策树的训练集，并选用分类与回归树(Classification And Regression Tree，CART)法生成ntree棵决策树，并不对CART树进行剪枝；然后用袋外数据(Out-Of-Bag，OOB)对森林中的每棵决策树进行测试，得到分类准确率；将所有测试集输入随机森林分类器，采用加权投票法(每棵树的投票权值为该树的OOB准确率)确定样本的抗旱程度，并计算准确率；对随机森林分类器参数ntree、mtry进行调试，按照上述方法重新建立模型并计算准确率，选择准确率最高的模型作为最终的突变体抗旱程度判别模型；

(8)采集待筛选植株抗旱性突变体的图像并提取特征参数，将参数输入抗旱程度判别模型确定突变体的抗旱程度。