本发明涉及一种检测方法，具体是一种伏马毒素检测方法。
背景技术：
伏马毒素B1(FumonisinB1，FB1)是串珠镰刀菌在一定湿度和温度条件下繁殖所产生的次级代谢产物，在全世界范围内分布广泛。1988年，Gelderblom等首次从串珠镰刀菌培养液中分离出伏马毒素。伏马毒素能够对玉米及其制品造成污染，而且在以谷物为原料的一些产品中如面条、啤酒、调味品，甚至在芦笋中也检测到了伏马毒素。据报道，伏马毒素与马脑白质软化症，猪的肺水肿症候群，大鼠肝癌等疾病有关。除上述疾病外，在南非的特兰斯凯地区和中国林县地区研究发现，食用伏马毒素污染的玉米制品与人类食道癌相关。串珠镰刀菌产生的毒素已经被国际癌症研究会(InternationalAgencyforResearchonCancer，IARC)划分到2B类--可能的人类致癌物。加入WTO之后，农产品及相关食品的国际贸易量日益增加，随之对进出口产品的生物安全性的要求也越来越高，为了保证这类产品的顺利上市和食用者的健康，出入境检疫、海关、生产企业、监督部门等部门迫切需要一种特异、快速、简便的伏马毒素检测方法。胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物，应用抗原抗体反应的一种免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、单宁酸/柠檬酸钠和柠檬酸三钠等作用下，聚合成特定大小的金颗粒，由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。胶体金标记，实质上是蛋白质高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理是胶体金颗粒表面的负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团因静电作用而形成牢固结合。这种球型的胶体金颗粒具有高电子密度，能够对多种生物高分子物质如葡萄球菌、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、BSA(牛血清白蛋白)等非共价结合，形成可见的紫红色，使其成为免疫反应的优良标记物，因此广泛应用于各种物质的检测。酶联免疫吸附实验由于液相中的抗原(或抗体)需经扩散才能与固相上的抗原或抗体反应，需较长时间，各个步骤需彻底地洗涤，并且需要特定的酶和底物显色，因此耗时长，程序繁琐；高效液相色谱法因其对检测样品、仪器及操作人员的要求，不利于基层常规检测使用。胶体金免疫层析法能克服上述方法的不足，胶体金免疫层析定量试验法利用抗原抗体反应原理，胶体金标记示踪物与固定在膜上的抗原或抗体形成复合物被截留而显色，不需要特定的酶和底物显色，也不需要抗原抗体之间的较长时间的物理吸附，而根据显色深浅判定阴阳性结果并根据标准曲线计算出具体浓度，安全有效，简单方便。胶体金免疫层析试验的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的胶体金标记。固定在NC膜(硝酸纤维素膜)上的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，胶体金标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又有示踪的功能。在测定时，受检样品(测定其中的抗体或抗原)通过毛细作用向前移行与金标垫上的抗原或抗体起反应。继续向前移行，与固定在T线(检测线)抗原或抗体结合形成免疫复合物被截留而显色，约为一条宽为1mm的棕红色条带，多余的金标抗体继续向前移动，与固定在C线(质控线)的二抗结合被截留而显色，约为一条宽为1mm的棕红色条带。此时T线形成金标复合物与标本中受检物质的量呈一定的比例，故可根据T线呈现的颜色深浅进行定量分析。关于伏马毒素B1的检测国内外已建立了多种方法。目前检测伏马毒素B1的方法主要为高效液相色谱法(HPLC)，在全球范围内的玉米及其制品的调查中，90％以上的实验室用的都是HPLC法。然而，由于伏马毒素B1本身既没有特异的紫外吸收基团，同时也没有荧光特性，但在一定条件下伏马毒素B1可同某些物质反应形成具有荧光的衍生物，因此荧光衍生剂和衍生方法的选择与HPLC检测伏马毒素的准确度和灵敏性有密切关系。此外该法需要对检测样品进行严格的预处理，还需要高效液相色谱仪等贵重仪器，同时要求专业人员来操作，不利于现场常规检测使用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种伏马毒素检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种伏马毒素检测方法，包括如下步骤：步骤一，将FB1半抗原分别与KLH和OVA偶联，得到FB1-KLH和FB1-OVA；步骤二，用所述FB1-KLH作为免疫原，采用常规方法制备抗FB1的单克隆抗体；步骤三，将所述单克隆抗体加入EP管中，使用洗涤液洗涤，将待侧样品进行萃取，得到萃取液，该萃取液稀释后加入所述管中，震荡；步骤四，去除上清液，使用洗涤液洗涤，将所述OVA-FB1加入所述管中，震荡；步骤五，去除上清液，使用洗涤液洗涤，将抗FB1单克隆抗体加入所述管中，震荡；步骤六，去除上清液，使用洗涤液洗涤，加入发光底物，震荡，测定发光值；步骤七，根据已知不同浓度FB1与抗FB1单克隆抗体加入后得到的发光值，制作标准曲线，再根据待测样品的发光值，通过标准曲线得到对应的FB1浓度。
作为本发明进一步的方案：在所述步骤三中，所述萃取液的稀释倍数为5倍。
作为本发明进一步的方案：在所述步骤三中，所述萃取的方法为：取样品，按照重量体积比1：10的比例加入70％甲醇-PBS溶液，剧烈震荡15min，静置30min，将上清液通过快速定性滤纸过滤，即得萃取液。
作为本发明进一步的方案：在所述步骤三中，所述稀释液为pH8.2的0.1M磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液含有体积比为0.01％的Tween-20。
作为本发明进一步的方案：在所述步骤三中，所述震荡步骤为室温震荡10-20分钟。
作为本发明进一步的方案：在所述步骤六中，所述震荡步骤为室温震荡5-10分钟。
作为本发明再进一步的方案：在所述步骤四中，所述上清液的去除使用磁力架完成。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明检测对象针对性强，准确率高，灵敏度较市售ELISA检测试剂盒高，并且由于本发明采用抗伏马毒素B1单克隆抗体，与其他谷物中的真菌毒素无交叉反应，较市售的以多克隆抗体为基础的ELISA试剂盒有更强的特异性，减少了假阳性率。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明实施例中，一种伏马毒素检测方法，包括如下步骤：步骤一，将FB1半抗原分别与KLH和OVA偶联，得到FB1-KLH和FB1-OVA；步骤二，用所述FB1-KLH作为免疫原，采用常规方法制备抗FB1的单克隆抗体；步骤三，将所述单克隆抗体加入EP管中，使用洗涤液洗涤，将待侧样品进行萃取，得到萃取液，该萃取液稀释后加入所述管中，震荡；步骤四，去除上清液，使用洗涤液洗涤，将所述OVA-FB1加入所述管中，震荡；步骤五，去除上清液，使用洗涤液洗涤，将抗FB1单克隆抗体加入所述管中，震荡；步骤六，去除上清液，使用洗涤液洗涤，加入发光底物，震荡，测定发光值；步骤七，根据已知不同浓度FB1与抗FB1单克隆抗体加入后得到的发光值，制作标准曲线，再根据待测样品的发光值，通过标准曲线得到对应的FB1浓度。在所述步骤三中，所述萃取液的稀释倍数为5倍。在所述步骤三中，所述萃取的方法为：取样品，按照重量体积比1：10的比例加入70％甲醇-PBS溶液，剧烈震荡15min，静置30min，将上清液通过快速定性滤纸过滤，即得萃取液。在所述步骤三中，所述稀释液为pH8.2的0.1M磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液含有体积比为0.01％的Tween-20。在所述步骤三中，所述震荡步骤为室温震荡10-20分钟。在所述步骤六中，所述震荡步骤为室温震荡5-10分钟。在所述步骤四中，所述上清液的去除使用磁力架完成。
实施例1：
本发明伏马毒素检测方法，包括如下步骤：步骤一，将FB1半抗原分别与KLH和OVA偶联，得到FB1-KLH和FB1-OVA；步骤二，用所述FB1-KLH作为免疫原，采用常规方法制备抗FB1的单克隆抗体；步骤三，将所述单克隆抗体加入EP管中，使用洗涤液洗涤，将待侧样品进行萃取，得到萃取液，该萃取液稀释后加入所述管中，震荡；步骤四，去除上清液，使用洗涤液洗涤，将所述OVA-FB1加入所述管中，震荡；步骤五，去除上清液，使用洗涤液洗涤，将抗FB1单克隆抗体加入所述管中，震荡；步骤六，去除上清液，使用洗涤液洗涤，加入发光底物，震荡，测定发光值；步骤七，根据已知不同浓度FB1与抗FB1单克隆抗体加入后得到的发光值，制作标准曲线，再根据待测样品的发光值，通过标准曲线得到对应的FB1浓度。在所述步骤三中，所述萃取液的稀释倍数为5倍。在所述步骤三中，所述萃取的方法为：取样品，按照重量体积比1：10的比例加入70％甲醇-PBS溶液，剧烈震荡15min，静置30min，将上清液通过快速定性滤纸过滤，即得萃取液。在所述步骤三中，所述稀释液为pH8.2的0.1M磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液含有体积比为0.01％的Tween-20。在所述步骤三中，所述震荡步骤为室温震荡10分钟。在所述步骤六中，所述震荡步骤为室温震荡5分钟。在所述步骤四中，所述上清液的去除使用磁力架完成。
实施例2：
本发明伏马毒素检测方法，包括如下步骤：步骤一，将FB1半抗原分别与KLH和OVA偶联，得到FB1-KLH和FB1-OVA；步骤二，用所述FB1-KLH作为免疫原，采用常规方法制备抗FB1的单克隆抗体；步骤三，将所述单克隆抗体加入EP管中，使用洗涤液洗涤，将待侧样品进行萃取，得到萃取液，该萃取液稀释后加入所述管中，震荡；步骤四，去除上清液，使用洗涤液洗涤，将所述OVA-FB1加入所述管中，震荡；步骤五，去除上清液，使用洗涤液洗涤，将抗FB1单克隆抗体加入所述管中，震荡；步骤六，去除上清液，使用洗涤液洗涤，加入发光底物，震荡，测定发光值；步骤七，根据已知不同浓度FB1与抗FB1单克隆抗体加入后得到的发光值，制作标准曲线，再根据待测样品的发光值，通过标准曲线得到对应的FB1浓度。在所述步骤三中，所述萃取液的稀释倍数为5倍。在所述步骤三中，所述萃取的方法为：取样品，按照重量体积比1：10的比例加入70％甲醇-PBS溶液，剧烈震荡15min，静置30min，将上清液通过快速定性滤纸过滤，即得萃取液。在所述步骤三中，所述稀释液为pH8.2的0.1M磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液含有体积比为0.01％的Tween-20。在所述步骤三中，所述震荡步骤为室温震荡20分钟。在所述步骤六中，所述震荡步骤为室温震荡10分钟。在所述步骤四中，所述上清液的去除使用磁力架完成。
实施例3：
本发明伏马毒素检测方法，包括如下步骤：步骤一，将FB1半抗原分别与KLH和OVA偶联，得到FB1-KLH和FB1-OVA；步骤二，用所述FB1-KLH作为免疫原，采用常规方法制备抗FB1的单克隆抗体；步骤三，将所述单克隆抗体加入EP管中，使用洗涤液洗涤，将待侧样品进行萃取，得到萃取液，该萃取液稀释后加入所述管中，震荡；步骤四，去除上清液，使用洗涤液洗涤，将所述OVA-FB1加入所述管中，震荡；步骤五，去除上清液，使用洗涤液洗涤，将抗FB1单克隆抗体加入所述管中，震荡；步骤六，去除上清液，使用洗涤液洗涤，加入发光底物，震荡，测定发光值；步骤七，根据已知不同浓度FB1与抗FB1单克隆抗体加入后得到的发光值，制作标准曲线，再根据待测样品的发光值，通过标准曲线得到对应的FB1浓度。在所述步骤三中，所述萃取液的稀释倍数为5倍。在所述步骤三中，所述萃取的方法为：取样品，按照重量体积比1：10的比例加入70％甲醇-PBS溶液，剧烈震荡15min，静置30min，将上清液通过快速定性滤纸过滤，即得萃取液。在所述步骤三中，所述稀释液为pH8.2的0.1M磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液含有体积比为0.01％的Tween-20。在所述步骤三中，所述震荡步骤为室温震荡15分钟。在所述步骤六中，所述震荡步骤为室温震荡8分钟。在所述步骤四中，所述上清液的去除使用磁力架完成。
实施例4：
本发明伏马毒素检测方法，包括如下步骤：步骤一，将FB1半抗原分别与KLH和OVA偶联，得到FB1-KLH和FB1-OVA；步骤二，用所述FB1-KLH作为免疫原，采用常规方法制备抗FB1的单克隆抗体；步骤三，将所述单克隆抗体加入EP管中，使用洗涤液洗涤，将待侧样品进行萃取，得到萃取液，该萃取液稀释后加入所述管中，震荡；步骤四，去除上清液，使用洗涤液洗涤，将所述OVA-FB1加入所述管中，震荡；步骤五，去除上清液，使用洗涤液洗涤，将抗FB1单克隆抗体加入所述管中，震荡；步骤六，去除上清液，使用洗涤液洗涤，加入发光底物，震荡，测定发光值；步骤七，根据已知不同浓度FB1与抗FB1单克隆抗体加入后得到的发光值，制作标准曲线，再根据待测样品的发光值，通过标准曲线得到对应的FB1浓度。在所述步骤三中，所述萃取液的稀释倍数为5倍。在所述步骤三中，所述萃取的方法为：取样品，按照重量体积比1：10的比例加入70％甲醇-PBS溶液，剧烈震荡15min，静置30min，将上清液通过快速定性滤纸过滤，即得萃取液。在所述步骤三中，所述稀释液为pH8.2的0.1M磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液含有体积比为0.01％的Tween-20。在所述步骤三中，所述震荡步骤为室温震荡18分钟。在所述步骤六中，所述震荡步骤为室温震荡7分钟。在所述步骤四中，所述上清液的去除使用磁力架完成。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。