一种甲砜霉素检测酶联免疫试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于生物工程领域，涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种甲砜霉素检测酶联免疫试剂盒，以及该试剂盒的应用方法。
背景技术：
：甲砜霉素(Thiamphenicol)，别名硫霉素，属于酰胺醇类，是甲砜霉素的同类物，抗菌谱和抗菌作用与甲砜霉素相仿，具有广谱抗微生物作用，甲砜霉素和甲砜霉素已在我国畜牧业中广泛应用，对畜禽疾病控制及治疗起到了重要作用。甲砜霉素对抑制红细胞、白细胞和血小板程度比甲砜霉素轻，但免疫抑制作用比甲砜霉素强，现除我国与日本外，欧共体和美国均禁用于食品动物。到目前为止，甲砜霉素残留的分析方法最常用的是液相色谱法和气相色谱法。也有波谱法的报道，但该方法耗时又缺乏灵敏性，现已很少使用。公开号为CN105445390A专利文献，公开了一种“乳制品中甲砜霉素类残留的检测方法”，其中该技术方案中所称甲砜霉素类包括甲砜霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，该方法包括：对待测样品进行前处理，其中包括：称取m1克待测样品，加入v1毫升乙酸乙酯提取，以获得第一提取物，利用v2毫升甲醇溶解第一提取物，加入v3毫升正己烷混匀，离心弃去上层，以获得第二提取物，利用固相萃取柱净化第二提取物，以获得净化物；利用液相-串联质谱仪分析净化物，以检测该待测样品中的甲砜霉素类残留；其中，m1小于等于5，v1小于20，v2小于1，v3小于8。通过以上技术方案可知，这是目前较为常用的色谱法检测方法，能够同时检测甲砜霉素类残留，但是甲砜霉素与甲砜霉素并不相同，其检测缺乏针对性，因此，对于甲砜霉素的检测灵敏度不高，准确性较差，而且整个检测方法较为复杂，耗时耗力，不能一种较为理想的甲砜霉素残留检测方法。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题在于：现有甲砜霉素检测方法复杂及检测结果灵敏度不高、准确性较差的问题，本发明提供一种甲砜霉素检测酶联免疫试剂盒及其应用。技术方案：一种甲砜霉素检测酶联免疫试剂盒，包括：酶标板，酶标板上预包被有包被原，所述包被原为抗原、抗体或抗抗体；酶标记物工作液，其中所述酶标记物为酶标记半抗原、酶标记抗体或酶标记抗抗体；甲砜霉素特异性抗体工作液，所述甲砜霉素特异性抗体为甲砜霉素单克隆抗体，可用甲砜霉素半抗原与载体蛋白的偶联物作为免疫原制备得到；洗涤工作液，由浓缩洗涤液稀释而成；复溶工作液，由浓缩复溶液稀释而成；TMB显色液，包括TMB底物液A液和TMB底物液B液；其中，本发明酶标板上的微孔条上预包被甲砜霉素偶联抗原，酶标记物工作液中的酶标记物为酶标记抗抗体，即酶标二抗。其中，本发明所述的预包被偶联抗原由甲砜霉素半抗原与载体蛋白OVA偶联制备得到，制备工艺为，将甲砜霉素半抗原溶解于DMF溶液中，加入各EDC和NHS水溶液进行活化30分钟，加入到载体蛋白OVA水溶液中进行偶联制备出包被原。其中，本发明所述的甲砜霉素半抗原由甲砜霉素溶液与丁二酸酐，在吡啶的催化下制备得到，合成路线如下所示：其中，本发明甲砜霉素特异性抗体由甲砜霉素半抗原与载体蛋白的偶联物作为免疫原制备，制备工艺为，将甲砜霉素半抗原溶解于DMF溶液中，加入各EDC和NHS水溶液进行活化30分钟，加入到载体蛋白BSA水溶液中进行偶联制备出免疫原，然后缓冲液透析3天，透析完成后用于动物免疫，制备出甲砜霉素特异性抗体。本发明的一个具体实施方式，所述试剂盒还包括甲砜霉素标准溶液，浓度分别为0μg/L、0.025μg/L、0.1μg/L、0.4μg/L、1.6μg/L和6.4μg/L。本发明的一个具体实施方式，所述试剂盒还包括终止液，所述终止液为2mol/L的盐酸缓冲液。一种应用甲砜霉素检测酶联免疫试剂盒检测甲砜霉素的方法，步骤如下：(1)样品预处理；(2)将样品加入到酶标板上之后，再加入酶标记物工作液和甲砜霉素特异性抗体工作液；(3)酶标板洗板处理；(4)显色处理：在酶标板先加入TMB底物液A液，再加入TMB底物液B液，进行显色反应；(5)测定：加入终止液，放入酶标仪中，采用波长450nm进行测定，读取OD值。作为优选，所述步骤(5)测定阶段，酶标仪采用双波长450/630nm进行检测。有益效果：本发明的检测原理：当在微孔条上预包被甲砜霉素偶联抗原时，加入样本溶液或标准品溶液后，样本中残留的甲砜霉素和酶标板微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗甲砜霉素的抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含残留物甲砜霉素的含量成负相关，与标准曲线比较，再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中甲砜霉素的残留量。本发明提供的甲砜霉素检测酶联免疫试剂盒，是应用ELISA技术研发的新一代药物残留检测产品，与传统仪器分析技术相比，具有检测快速、简便、准确，以及检测灵敏度高等特点，能最大限度地减少操作误差和工作强度，是一种十分理想的甲砜霉素残留检测试剂盒。附图说明图1为甲砜霉素氢谱图。图2为甲砜霉素半抗原合成图。具体实施方式为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。本发明甲砜霉素检测酶联免疫试剂盒，包括：(1)洗涤工作液，浓缩洗涤液1：19体积比稀释而成，所述浓缩洗涤液为pH值为7.1～7.5，含有0.8％～1.2％吐温-20、0.01‰～0.03‰硫柳汞防腐剂、0.01～0.03mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；(2)复溶工作液，浓缩复溶液1：1体积比稀释而成，pH值为7.2～7.7，含有8％～12％卵清蛋白、0.1～0.4mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；(3)TMB显色液，包括TMB底物液A液和TMB底物液B液，A液为过氧化氢，B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺；(4)终止液，2mol/L的盐酸缓冲液；(5)96孔酶标板，其中在酶标板制备过程中所用的包被缓冲液为pH值为9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，所用封闭液为pH值为9.1～9.5，含有3％～10％小牛血清、0.2％吐温-20、0.1～0.3mol/L的碳酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；本发明中酶标板的制备过程为，用包被缓冲液将包被原稀释成0.1～0.2μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2h或4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150～200μl封闭液37℃温育1～2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空；其中，本发明所述的预包被偶联抗原由甲砜霉素半抗原与载体蛋白OVA偶联制备得到，其中甲砜霉素半抗原合成的方法为，将甲砜霉素溶于DMF溶液，加入丁二酸酐，以吡啶为催化剂，加热回流，薄层色谱监测反应，待反应完成后，提取纯化，得到半抗原，合成路线如下所示：其中，本发明所述的预包被偶联抗原的制备方法如下：称取32.5mg半抗原溶解于2mLDMF溶液中，将60mgEDC和60mgNHS溶于2mL水中，加入到半抗原的DMF溶液中，活化30分钟，加入到100-250mg载体蛋白OVA的3mL水溶液中进行偶联制备出包被原。(6)其中，本发明甲砜霉素特异性抗体的制备流程为：称取32.5mg半抗原溶解于2mLDMF溶液中，将60mgEDC和60mgNHS溶于2mL水中，加入到半抗原的DMF溶液中，活化30分钟，加入到100-250mg载体蛋白BSA的3mL水溶液中进行偶联制备出免疫原，用0.02mol/LPB3天，每天早晚更换透析液，透析完成后用于动物免疫制备出抗体。所述甲砜霉素特异性抗体为甲砜霉素单克隆抗体；所述单克隆抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源抗体，本实施例为甲砜霉素鼠单克隆抗体；将甲砜霉素鼠单克隆抗体通过现有技术进行稀释，制备得到甲砜霉素特异性抗体工作液；(7)酶标二抗工作液，本实施例酶标二抗采用羊抗鼠抗抗体，以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原，对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。本实施例为酶标记的鼠抗抗体，本实施例的标记酶为辣根过氧化物酶，标记酶酶标记的羊抗鼠抗抗体是采用戊二醛法将标记酶与抗抗体进行偶联得到；酶标二抗通过稀释，酶标二抗得到工作液，稀释处理同现有技术；(8)甲砜霉素标准溶液，浓度分别为0μg/L、0.025μg/L、0.1μg/L、0.4μg/L、1.6μg/L和6.4μg/L。一种应用甲砜霉素检测酶联免疫试剂盒检测甲砜霉素的方法，步骤如下：(1)样品预处理；牛奶样本前处理方法a.量取1ml牛奶至2ml聚苯乙烯离心管中，加入30μl牛奶提取液，用涡旋仪涡动20s，3000g室温(20-25℃/68-77℉)离心5min；b.避开上层悬浮物，移取50μl上清液至2ml聚苯乙烯离心管中，加入450μl复溶工作液；c.取50μl用于分析。(如果需要检测含量大于40μg/L的样本，可在最后一步将样本进行20倍稀释，即25μl上清液加入475μl复溶工作液。)在使用各种试剂前，需回温至室温，另外酶标板做遮光处理，盖板膜封住微孔酶标板。(2)将样品加入到酶标板上之后，再加入酶标记物工作液和甲砜霉素特异性抗体工作液；加入标准品和样本50μl到对应的微孔中，然后加入酶标二抗50μl/孔，再加入甲砜霉素特异性抗体工作液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃(98.6℉)避光环境中反应30min；(3)酶标板洗板处理；揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250μl/孔，充分洗涤4－5次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干；(4)显色处理：在酶标板先加入TMB底物液A液，再加入TMB底物液B液，进行显色反应；加入TMB底物液A液50μl/孔，再加入TMB底物液B液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃(98.6℉)避光环境中反应15min；(5)测定：加入终止液，放入酶标仪中，采用波长450nm进行测定，读取OD值。加入终止液50μl/孔，轻轻振荡混匀，采用波长450nm进行测定，测定每孔OD值；最后，是结果判定，采用定量分析法，即百分吸光率的计算。1、标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的平均吸光度值(双孔)除以第一个标准品(0标准)的平均吸光度值，再乘以100％，即B—标准品或样本溶液的平均吸光度值B0—0μg/L标准溶液的平均吸光度值2、标准曲线的绘制与计算以标准品百分吸光率为纵坐标，以甲砜霉素标准品浓度(μg/L)的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中甲砜霉素的实际浓度。本发明甲砜霉素检测酶联免疫试剂盒对甲砜霉素的检测灵敏度高达0.025μg/L。对甲砜霉素检测酶联免疫试剂盒进行测试：(1)应用甲砜霉素检测酶联免疫试剂盒对0.35μg/L浓度的甲砜霉素牛奶样品进行含量测定，精密度以变异系数表示，分别取三个不同批次的试剂盒，每个浓度重复5次，分别计算变异系数，结果见表1。表1牛奶样品变异系数测定由上表所示，牛奶中样品的变异系数为4.54-7.41％。(2)样品精确度测试：取浓度为0.1μg/L的甲砜霉素标准品溶液，分别对5个牛奶样品进行添加回收试验，每个浓度做3个平行，分别计算回收率，准确度以回收率表示，计算结果如表2所示。表2添加回收率测定由上表可知，本实施例中牛奶样品添加回收率在93.0％-105.83％之间，表明本发明酶联免疫检测试剂盒测定牛奶的准确率较高。(3)交叉反应率试验：选择与甲砜霉素有类似结构和类似功能2种药物测定交叉反应率，通过各种药物的标准曲线分别得到其50％抑制浓度(即IC50)，交叉反应率(％)＝(甲砜霉素IC50/甲砜霉素类似物IC50)×100％，结果见表3。表3交叉反应率测定药物名称交叉反应率(％)甲砜霉素100％氟甲砜霉素130％(4)试剂盒保存性试验：试剂盒保存条件为2～8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、甲砜霉素添加实际测定值均在正常范围之内。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。当前第1页1 2 3