一种硫化氢对脑基底动脉舒张反应的影响的实验方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种硫化氢对脑基底动脉舒张反应的影响的实验方法，具体地说，硫化氢对不同周龄自发性高血压大鼠脑基底动脉舒张反应的影响的实验方法。

背景技术：

硫化氢(H₂S)是继一氧化碳和一氧化氮之后的又一新型气体信号分子，同时也是一种血管舒张因子。在机体内，H₂S对动脉血压及血管舒张具有重要调节作用。高血压作为心脑血管系统的常见疾病,严重影响着人们的身心健康。高血压的发病机制主要源于外周血管阻力增高，且长期过高的动脉血压会造成血管功能损伤。近年来研究显示,随着自发性高血压大鼠周龄的增加及血压的升高,其体内由血管内皮细胞合成的内源H₂S含量也显著降低，并进一步造成血管舒缩功能紊乱；而通过外源注射硫化氢供体后则可有效降低自发性高血压大鼠血压的动脉血压。虽然已有研究指出H₂S具有舒张血管效应，但随着高血压的病程发展，H₂S是否对阻力血管还具有明显的舒张调节作用还不清楚。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种硫化氢对脑基底动脉舒张反应的影响的实验方法，通过观察不同浓度硫氢化钠(NaHS)(H₂S供体)对不同周龄自发性高血压大鼠(spontaneous hyper tension rats,SHR)以及正常对照组Wistar京都(Wistar-Kyoto，WKY)大鼠的脑基底动脉舒张反应的异同，探讨随着高血压的发展及动物周龄变化血管功能的改变以及H₂S对自发性高血压大鼠中阻力血管舒张功能的影响。

其具体技术方案为：

一种硫化氢对脑基底动脉舒张反应的影响的实验方法，包括以下步骤：

步骤1、动物血压测量

使用全自动大小鼠无创血压测量仪检测WKY大鼠和SHR尾动脉收缩压。测量时先预热，将血压计的充气尾套套在大鼠尾根部，待大鼠安静后，重复测量血压3次，结果取其平均值。

步骤2、脑基底动脉标本制备

各组大鼠在麻醉后放血处死，迅速取出脑，置于含有95％O₂和5％CO₂的4℃饱和PSS液中，清除大脑基底动脉旁的脑膜，剪成2～3mm的血管段备用在动物被处死到固定到记录系统上在45min内完成。

步骤3、压力肌动图技术检测血管直径

血管固定在两个玻璃微电极上，外径是240～360μm，用10～0号眼科尼龙线固定血管在压力肌动图仪器水浴槽上，浴槽中持续通以95％O₂和5％CO₂的混合气体,管的远端封闭，形成一个无流动实验的状态，任何血管漏气时丢弃。DMT由一个摄像机和控制系统控制，血管直径的变化通过视频显微测量技术和一个校准视频尺寸分析仪来分析测量血管直径，测量单位是μm。血管压力从0mmHg上升到60mmHg，每隔5min上升10mmHg，直到60mmHg上。血管的压力维持在60mmHg，在37℃，pH7.4的PSS液中孵育1h，每隔20min换一次PSS液。给予K-PSS液检测血管的活性，观察血管的收缩程度大于直径的1/3，稳定后再用,10μmol/L乙酰胆碱舒张，舒张率大于80％认为内皮完整，可用于实验。血管直径舒张幅度变化公式D(μm)＝D_X-D₁，D₁为血管在K-PSS中稳定时的直径，D_X为血管加入不同浓度的药物时血管稳定后的直径。血管收缩率(％)＝(D_X-D₁)/D₁×100％。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明通过观察不同浓度硫氢化钠(NaHS)(H₂S供体)对不同周龄自发性高血压大鼠(spontaneous hypertension rats,SHR)以及正常对照组Wistar京都(Wistar-Kyoto，WKY)大鼠的脑基底动脉舒张反应的异同，探讨随着高血压的发展及动物周龄变化血管功能的改变以及H₂S对自发性高血压大鼠中阻力血管舒张功能的影响。结果显示：在高血压初期，脑基底动脉对H₂S的敏感性增加，而可能随着高血压的发展及血管功能的严重损伤，脑基底动脉对H₂S的敏感性降低。

附图说明

图1是本发明硫化氢对脑基底动脉舒张反应的影响的实验方法的流程图；

图2是不同浓度NaHS对14周龄WKY大鼠脑基底动脉的舒张反应；

图3是不同浓度NaHS对14周龄WKY和SHR脑基底动脉的舒张反应的量效曲，与WKY组比较：^*P<0.05；

图4是不同浓度NaHS对40周龄WKY和SHR脑基底动脉的舒张反应的量效曲线，与WKY组比较：^*P<0.05。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

1材料与方法

1.1实验动物与分组实验所用WKY大鼠和SHR(北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号SCXK(京)2012-0001)。清洁级，适应性饲养1周后进入正式实验，动物房室内温度为20～25℃，湿度为50％～55％。各组大鼠分笼喂养，给予标准饲料，自由进食水，环境安静。所有实验在符合动物实验伦理要求下进行。WKY组分为14、40周龄组，SHR组分为14、40周龄组，各6只。

1.2主要试剂生理盐溶液(physiologic salt solution,PSS)成分：NaCl 119mmol/L，K Cl 4.69mmol/L，MgSO₄·7H₂O 1.17mmol/L，KH₂PO₄ 1.18mmol/L，CaCl₂2.5mmol/L，NaHCO₂ 25mmol/L，EDTA 0.026mmol/L，葡萄糖5.5mmol/L。将pH调至7.4。高钾外液(K-PSS，相当于60mmol/L KCl)成分：KCl 123.70mmol/L，MgSO₄·7H₂O 1.17mmol/L，KH₂PO₄ 1.18mmol/L，CaCl₂ 2.5mmol/L，NaHCO₂ 25mmol/L，EDTA 0.026mmol/L，葡萄糖5.5mmol/L。NaHS(H₂S供体)购自Sigma公司(美国Sigma公司)，其余试剂均为国产分析纯试剂。

1.3主要仪器压力肌动图：Pressure myograph system，DMT(丹麦Danish Myo Tec hnology A/S公司)110P；倒置相差显微镜(宁波舜宇仪器有限公司)；光学显微镜(日本O lympus公司)；电子天平(上海越平科学仪器有限公司)。

1.4实验方法如图1所示：

1.4.1动物血压测量使用全自动大小鼠无创血压测量仪检测WKY大鼠和SHR尾动脉收缩压。测量时先预热，将血压计的充气尾套套在大鼠尾根部，待大鼠安静后，重复测量血压3次，结果取其平均值。

1.4.2脑基底动脉标本制备各组大鼠在麻醉后放血处死，迅速取出脑，置于含有95％O₂和5％CO₂的4℃饱和PSS液中，清除大脑基底动脉旁的脑膜，剪成2～3mm的血管段备用在动物被处死到固定到记录系统上在45min内完成。

1.4.3压力肌动图技术检测血管直径血管固定在两个玻璃微电极上，外径是240～360μm，用10～0号眼科尼龙线固定血管在压力肌动图仪器(pressure myograph system,DMT,110P)水浴槽上,浴槽中持续通以95％O₂和5％CO₂的混合气体,管的远端封闭，形成一个无流动实验的状态，任何血管漏气时丢弃。DMT由一个摄像机和控制系统控制，血管直径的变化通过视频显微测量技术和一个校准视频尺寸分析仪来分析测量血管直径，测量单位是μm。血管压力从0mmHg上升到60mmHg，每隔5min上升10mmHg，直到60mmHg上^[4]。血管的压力维持在60mmHg，在37℃，pH7.4的PSS液中孵育1h，每隔20min换一次PSS液。给予K-PSS液检测血管的活性，观察血管的收缩程度大于直径的1/3，稳定后再用,10μmol/L乙酰胆碱舒张，舒张率大于80％认为内皮完整，可用于实验。血管直径舒张幅度变化公式D(μm)＝D_X-D₁，D₁为血管在K-PSS中稳定时的直径，D_X为血管加入不同浓度的药物时血管稳定后的直径。血管收缩率(％)＝(D_X-D₁)/D₁×100％。

1.5统计学处理应用SPSS 17.0统计学软件进行统计学处理，以表示，组间比较采用t检验以P<0.05，表示差异有统计学意义。

2结果

表1两种大鼠一般资料的比较(n＝6,)

与WKY-14周龄比较：^**P<0.05；与WKY-40周龄比较：^**P<0.05

2.1 WKY大鼠和SHR一般资料的比较14周龄SHR收缩压为(183.4±8.8)mmHg，14周龄WKY大鼠收缩压为(117.2±8.2)mmHg，SHR明显高于WKY大鼠，差异有统计学意义(t＝9.66，P<0.01)。40周龄SHR收缩压为(201.7±9.1)mmHg，40周龄WKY大鼠收缩压为(118.2±7.6)mmHg，SHR明显高于WKY大鼠，差异有统计学意义(t＝12.20，P<0.01)。见表1。

2.2 NaHS对不同周龄SHR和WKY大鼠脑基底动脉血管的舒张作用给予K-PSS预收缩血管后，观察不同浓度的NaHS对SHR和WKY大鼠脑基底动脉直径的影响(图2)，10^-5～3×10^-3mol/L的NaHS可以浓度依赖的舒张SHR和WKY大鼠脑基底动脉。与同龄的WKY大鼠相比，NaHS对14周龄SHR脑基底动脉的舒张更明显，10^-3mol/L和3×10^-3mol/L的NaHS引起的SHR脑基底动脉舒张率分别为(1.27±0.16)和(1.34±0.16)，对WKY的舒张率为(0.85±0.14)和(0.97±0.11)，差异有统计学意义(t＝3.422、3.301，P<0.05)。经绘制量效曲线(图3)，NaHS对14周龄WKY和SHR脑基底动脉舒张半数有效浓度(50％effective concentration，EC₅₀)分别为3.63×10^-4和4.37×10^-4，差异无统计学意义。

与同龄的WKY大鼠相比，N aHS对40周龄SHR脑基底动脉的舒张显著降低，10^-3～3×10^-3mol/L的NaHS引起的SHR脑基底动脉舒张率分别为(0.76±0.07)和(0.81±0.07)，对WKY的舒张率为(1.20±0.20)和(1.51±0.31)，差异有统计学意义(t＝3.597、3.815，P<0.05)。经绘制量效曲线(图4)，NaHS对40周龄SHR和WKY脑基底动脉舒张EC₅₀分别为3.28×10^-4和3.18×10^-4，差异无统计学意义。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。