本发明涉及一种细胞角蛋白18(CK18)检测试剂及制备方法，特别是采用乳胶增强免疫比浊法检测CK18的试剂及制备方法，可应用在检验医学领域。
背景技术：
：CK18是细胞骨架蛋白的一种，除了起到细胞骨架的支撑作用以外，还通过多种途径参与着细胞内的各种反应。CK18作为肝细胞凋亡的指标，在包括非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的很多肝脏疾病中都有升高，并且与NAFLD患者肝细胞的脂肪变性、小叶炎症、气球样变的程度及纤维化程度相关，同时有中重度纤维化患者的血清CK18水平明显高于轻度或无纤维化患者的水平。肝病是威胁人类健康的重大问题，脂肪肝、药物性肝损伤、自体免疫性肝病等发病率逐年上升，相当数量的上述肝病患者最终发展为肝纤维化。肝纤维化是所有肝脏慢性疾病的共同通路，早中期可逆转，晚期即肝硬化不可逆转，最终发展为肝功能衰竭危及生命，因此肝纤维化早期诊断意义重大。CK18作为一个无创性的检测手段，在NAFLD的诊断、NAFL和HASH的鉴别及纤维化程度的判断上有重要临床价值。对于CK18定量检测，现有的检测方法主要有有双抗夹心法(ELISA)、免疫发光法。ELSA的灵敏度较高，但其操作复杂，反应测定时间长，且线性范围窄，对于样品稀释度不好控制；化学发光法具有灵敏度高的优点，但是需要配套专门仪器使用，价格昂贵，不利于各级医院推广，而且标准曲线会随着时间漂移。胶乳增强免疫比浊法具有操作简单、快速、灵敏度高、可应用于自动生化分析仪等优点，如能开发出可在全自动生化分析仪上使用的免疫比浊试剂用于检测血清中的CK18，将为临床在NAFLD的诊断及治疗提供强有力的支持。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足和缺点，提供一种具有高灵敏度和宽线性范围的CK18检测试剂，同时还具有测值准确，操作简单、快速可用于门急诊检测且仪器适用面广等优点，所述试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品，其中：a)试剂R1包含防腐剂、稳定剂、表面活性剂、反应促进剂、电解质和缓冲液；b)试剂R2包含结合有抗CK18单克隆抗体和多克隆抗体的胶乳颗粒、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、电解质和缓冲液；c)校准品包含防腐剂、稳定剂、电解质、CK18纯品和缓冲液。特别地，本发明涉及一种单多抗复合的胶乳增强免疫比浊试剂用于测定血清CK18，包括试剂R1、试剂R2和已知浓度的CK18抗原校准品，其中：a)本发明所述试剂盒的试剂R1是一种使样本中CK18特异的抗原位点充分暴露，有利于与抗CK18抗体充分结合的，包含占其质量百分比为：0.01％～1.0％防腐剂、0.05％～5.0％的稳定剂、0.01％～3.0％的表面活性剂、0.01％～10.0％的反应促进剂、0.01％～5.0％的电解质、pH6.5～8.5的10～200mmol/L的缓冲液；b)本发明所述试剂盒的试剂R2包含结合有鼠抗人CK18单克隆抗体和鸡抗人CK18多克隆抗体的胶乳颗粒，可特异性识别并结合血清中的CK18抗原，包含占其质量百分比为：0.1％～0.8％的50～250nm胶乳颗粒、0.01％～1.0％防腐剂、0.05％～15.0％的稳定剂、0.01％～3.0％的表面活性剂、0.01％～5.0％的电解质、pH6.5～8.5的10～200mmol/L的缓冲液；c)本发明所述的CK18校准品，用来与样本比较进行结果计算，包括占其质量百分比为：0.01％～1.0％防腐剂、0.05％～5.0％的稳定剂、0.01％～5.0％的电解质、根据需要的CK18校准品浓度添加的相应量的CK18纯品及pH6.5～8.5的10～100mmol/L的缓冲液。本发明所述的CK18校准品中使用的CK18纯品是通过重组表达获得。本发明采用单克隆抗体和多克隆抗体复合包被胶乳颗粒的方法，可以同时保证高线性和灵敏度，与现有的CK18试剂盒相比较，测定结果准确性大大提高。本发明中所使用的抗CK18单抗为鼠抗人单克隆抗体，抗CK18多抗为鸡抗人多克隆抗体，特别地，本发明所使用的鼠抗人CK18单克隆抗体可以多于一种，即可以为几种抗CK18特异性单抗的混合，以识别更多的抗原表位，使得所述试剂盒具有更高的灵敏度。本发明中所使用的鼠抗人CK18单抗、鸡抗人CK18多抗，对于本领域技术人员而言可购得或制备。本发明所述试剂盒的试剂R2中胶乳颗粒与抗CK18单克隆抗体的结合可以采用物理吸附法或化学交联法制备，优选化学交联法。本发明中所使用的反应促进剂可以是聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、溴化乙二甲胺、聚凝胺的一种或几种，优选聚乙二醇6000。本发明中所使用的防腐剂选自叠氮钠、山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、ProClin300中的一种或几种，优选ProClin300。本发明中所使用的电解质可以是钠离子或镁离子，优选钠离子。本发明中所使用的缓冲液可以是甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、PIPES缓冲液、硼酸盐缓冲液或磷酸缓冲液、优选甘氨酸缓冲液。本发明中所使用的表面活性剂为非离子型表面活性剂和/或阴离子型表面活性剂，优选地，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂和阴离子型表面活性剂的复配使用，其中非离子型表面活性剂选自Tween20、Tween40、Tween60、Span40、Span80、TritonX-100中的一种或几种，阴离子型表面活性剂选自SDS、脂肪醇聚氧乙烯磺酸钠、聚茴脑磺酸钠、脱氧胆酸钠中的一种或几种。本发明中所使用的稳定剂选自蛋白质、无机盐、金属络合剂、助悬剂和抗氧化剂中的一种或几种。特别的，所述的蛋白质为牛血清白蛋白或明胶；所述的无机盐选自氯化钠、氯化钾或氯化镁中的一种或几种，优选氯化钠；所述的金属络合剂为含有氨基二乙酸基团的络合剂，选自EGTA、EDTP、DTPA、EDTA中的一种或几种；所述的助悬剂选自乙二醇、丙三醇、乳糖、蔗糖、麦芽糖中的一种或几种；所述抗氧化剂选自2，6-二叔丁基对甲酚、叔丁基对羟基茴香醚、没食子酸丙酯中的一种或几种。本发明采用胶乳增强免疫比浊法，开发出可检测血清和尿液中CK18的试剂.胶乳增强免疫比浊法的反应原理是：包被了高特异性抗体的胶乳颗粒，与样本中相应的CK18抗原发生特异性结合，形成不溶性的抗原-抗体-胶乳颗粒复合物，产生一定的浊度，其浊度高低与样本中的CK18抗原浓度成正比关系，在一定波长下进行浊度测定，即可测得样本中被检测CK18的含量。本发明中，选取的检测波长为340-800nm，优选500-750nm。采用本发明所述的试剂盒测定血清或尿液中CK18时，先将样本与试剂R1混匀后孵育5分钟，然后加入试剂R2，测定反应第0.5分钟和第5分钟的吸光度值(A1、A2)，计算吸光度差值，根据校准曲线得到样本中CK18的含量。本发明采用6点定标法，以样条函数作为计算模式，绘制出校准曲线。本发明所述的试剂盒，用于测定血清中CK18，与现有技术相比，具有特异性好、灵敏度高、准确性好、线性范围宽等优点；另外，进行检测时操作简便适用于全自动生化分析仪，大幅度提高了检测效率。附图说明图1：由实施例1得到的本发明试剂盒1与ELISA试剂盒A测定结果的相关性。图2：由实施例2得到的本发明试剂盒2与进口试剂盒B测定结果的相关性。具体实施方式实施例一CK18胶乳增强免疫比浊检测试剂11.试剂盒主要成分及浓度如下：试剂R1：试剂R2：包被有鼠抗人CK18单克隆抗体和鸡抗人CK18多克隆抗体的胶乳颗粒胶乳粒径：160nm，胶乳浓度0.2％。CK18校准品：包被有鼠抗人CK18单克隆抗体和鸡抗人CK18多克隆抗体的胶乳颗粒胶乳粒径：160nm，胶乳浓度0.2％。CK18校准品：按照需要的CK18参考校准品浓度将CH18纯品加入上述缓冲液，配制浓度为3200U/L的参考校准品，再用校准品稀释液依次梯度稀释，获得6份浓度为3200U/L、1600U/L、800U/L、400U/L、200U/L、0U/L的系列参考校准品。试剂R1为无色透明液体，R2为乳白色液体，校准品为浅黄色透明溶液。2.试剂盒测定方法分析方法：两点终点法反应方向：上升反应校准方式：Spline测定波长：700nm测定温度：37℃R1∶R2∶样本＝100∶100∶8μl操作步骤：将100μl试剂R1加入8μl样本，于37度孵育5分钟后加入100μl试剂R2，反应开始0.5分钟时读取第一点，反应5分钟后读取第二点。使用迈瑞BS-200全自动生化分析仪。采用6点定标方法，校准品浓度分别为0U/L、200U/L、400U/L、800U/L、1600U/L、3200U/L的系列参考校准品。实施例二CK18胶乳增强免疫比浊检测试剂21.试剂盒主要成分及浓度如下：试剂R1：试剂R2：包被有鼠抗人CK18单克隆抗体和兔抗人CK18多克隆抗体的致敏胶乳颗粒，胶乳粒径：160nm；胶乳浓度0.2％。CK18校准品：按照需要的CK18参考校准品浓度将CH18纯品加入上述缓冲液，配制浓度为3200U/L的参考校准品，再用校准品稀释液依次梯度稀释，获得6份浓度为3200U/L、1600U/L、800U/L、400U/L、200U/L、0U/L的系列参考校准品。试剂R1为无色透明液体，R2为乳白色液体，校准品为浅黄色透明溶液。2.试剂盒测定方法分析方法：两点终点法；反应方向：上升反应校准方式：Spline测定波长：700nm测定温度：37℃R1∶R2∶样本＝100∶100∶8μl操作步骤：将100μl试剂R1加入8μl样本，于37度孵育5分钟后加入100μl试剂R2，反应开始0.5分钟时读取第一点，反应5分钟后读取第二点。使用迈瑞BS-200全自动生化分析仪。采用6点定标方法，校准品浓度分别为0U/L、200U/L、400U/L、800U/L、1600U/L、3200U/L的系列参考校准品。实施例三CK18胶乳增强免疫比浊检测试剂的性能评价1.相关线性评估将按照实施例1配制的本发明试剂盒1与市售采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定的试剂盒A做相关性实验。检测50份新鲜人血清(包含正常和异常样本)，按照各自测定方法进行测定，对测定值进行相关分析(结果见图1，X，Y轴均为测定值，单位U/L)。相关系数R2＝0.9927，回归方程为y＝1.0145x+19.915，结果表明本发明试剂与酶联免疫吸附法ELISA有良好的相关性。相关性实验数据如表1所示。将按照实施例2配制的本发明试剂盒2与市售进口试剂盒B做相关性实验。检测50份新鲜人血清(包含正常和异常样本)，按各自说明书进行测定，对测定值进行相关分析(结果见图2，X，Y轴均为测定值，单位U/L)。相关系数R2＝0.9965，回归方程为y＝1.0228x+4.5463，结果表明本发明试剂与试剂盒B有很好的相关性。相关性实验数据如表1所示。2.灵敏度实验以零值校准品进行20次重复测定，其平均值加上两倍标准差带入曲线方程所得的浓度值为试剂盒的灵敏度。本实施例1灵敏度测定，显示最低检测限度为16.2U/L。本实施例2灵敏度测定，显示最低检测限度为13.5U/L。3.精密度同时评价批内和批间不精密度：每天做2个批次的测试，每批测试时，对同一样品作双份测量，共做20天。评估结束时共有40对，即80个测试结果。从40批次测量中双份结果的差值求出批内精密度。从所有80个数据计算出批间精密度。本实施例1精密度检测显示，批内精密度CV为6.9％；批间精密度为9.8％.本实施例2精密度检测显示，批内精密度CV为7.2％；批间精密度为10.1％.表1样本号试剂盒1试剂盒A样本号试剂盒2试剂盒B156061551485490249851252981033403452535054924961055410351072548651155756967189568973714981520575976820412032585655749108116594530101369136060951251175677761505521125863621350137713802814637566141201356489701516471640657966167089666357201792195167639818494368829902197567636973881120658270969521106513027187912261687263922394112731537159024468492745876012586102757126932673976176893910279499776584286374787908332918341900799281308298805826033163728170733271875582464233971108312491196346026538468467935100212148557559536759886858137839587788836388692889569633967898975804052958390104934171699163684288107928491438499049392115448388569467870645769801951670167846878396859947612722977986485670987988214916041537996273509479921009951105上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围。当前第1页1 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