本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种基于血清标志物MMP-7的胆道闭锁诊断试剂盒。
背景技术：
胆道闭锁(Biliary atresia，BA)是以肝外胆管进行性炎症、快速肝纤维化为特征的新生儿胆汁淤积性疾病，疾病进展迅速，3月以内行Kasai手术(肝门空肠吻合术)效果较好。该疾病在西方国家的发生率为1/17000-1/19000，而在台湾地区、日本为1/7000-1/13000，大陆地区的发生率为1/5000-1/12000[1-6]，是小儿肝移植最常见病因[2,7,8]。
现有的BA筛查和诊断血清学指标包括：①血清总胆红素，直接胆红素；其作为最初筛查指标。新生儿血清总胆红素>2.0mg/dL(42–51μmol/L)，或直接胆红素>1.0mg/dL(17μmol/L)需进行BA排查，但对于诊断BA特异性差；②GGT：大样本调查研究表明，不同年龄组中，BA组GGT含量均明显高于其他胆汁淤积疾病组[9]。Liu等人[10]报道GGT>300U/L时，其诊断BA的精确度为60％-85％诊断。GGT是胆道闭锁最常用的筛查指标，但临床病例中不同患儿之间差异较大，准确性受到局限；③其他指标：血清胆酸、凝血酶原浓度、血小板测定影响因素较多。影像学检查中，异常胆囊(胆囊缩小，收缩差)和肝门部纤维块是超声检查胆道闭锁患儿肝脏的特征性表现[11,12]，但肝门部纤维块不一定在每个患儿中均出现，并且超声检查因不同医生、机器等观察结果差异较大。因此文献中报道诊断BA的敏感性与特异性各不相同[10,13-19]。近期，有Meta分析报道，胆囊闭锁和肝门部纤维块的特异性均可达到99％，然而相对应的敏感性为28％和80％[10]。其它检查虽然可以给胆道闭锁的诊断提供一些线索，但受到不同程度的限制。如十二指肠肠液检测操作困难；放射性核素检查可不同程度加重患儿梗阻性黄疸[2,20]；3个月龄以内的婴儿胆管直径小、胆管内液体少[21]，磁共振胰胆管成像检查诊断胆道闭锁的高假阳性率不可避免。此外，BA的病理特征为小胆管增生、胆栓形成、毛细胆管和肝细胞胆汁淤积、汇管区或小叶周围纤维化，早期尚可见肝小叶结构[1,20,21]。而α1抗胰蛋白酶缺乏疾病的病理表现与之重叠，偶尔Alagille综合症、囊性纤维化、全胃肠外营养相关的胆汁淤积也可表现为相似的病理改变[1]。因此，临床应用于鉴别BA与其他新生儿胆汁淤积症时，因检测准确性低或过程复杂导致BA诊断和治疗的延迟。
疾病早期，BA的临床表现、生物化学指标、影像学和组织学特征与其它胆汁淤积疾病存在重叠性，鉴别诊断过程曲折、复杂，容易导致诊断延迟。因此探索简单、特异性诊断方法从未停止。以往研究显示基质金属蛋白酶7(Matrix metalloproteinases-7，MMP-7)在慢性肝脏疾病中与肝纤维化形成有关[22]。最近发现MMP-7可激活BA胆管上皮先天性免疫反应并参与胆管的炎性损伤[23-25]。本项目通过病例对照研究MMP-7在BA患儿血清和肝内胆管组织中的表达情况，证明血清MMP-7水平在胆道闭锁诊断中具有应用价值。
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技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有诊断BA方法准确性差，操作复杂，病人在儿内科和儿外科反复就诊，程序繁琐，容易延误诊断，导致治疗的延迟，直接影响疗效的不足。而提供一种基于血清标志物MMP-7的胆道闭锁诊断试剂盒，它具有操作简单，结果可靠，高灵敏性、高特异性的特点。以解决现有技术中的BA诊断方法不能实现的诊断技术问题。
本发明的目的是通过如下技术方案来实现的：一种基于血清标志物MMP-7的胆道闭锁诊断试剂盒，用于BA的早期诊断，其特征是该诊断试剂盒包括抗人MMP-7抗体包被的酶标板、阳性对照液、样品稀释液(阴性对照液)、酶标试剂(A、B)、酶底物溶液、洗涤液和终止液。
所述阳性对照液为含有MMP-7的稀释于样品稀释液中血清，含MMP-7浓度为40ng/mL。
所述样品稀释液为0.01mol/L pH 7.4PBS；阴性对照液即为样品稀释液。
所述酶标试剂A为生物素化的MMP-7抗体，酶标试剂B为HRP标记的亲和素，浓度为0.1-111g/mL。
所述酶底物溶液为3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine,TMB溶液)，包括显色剂A和显色剂B，显色剂A为500mL溶液中含有醋酸纳13.6g、柠檬酸1.6g和30％双氧水0.3mL；显色剂B为500mL溶液中含有TMB 350mg、二甲亚砜(Dimethyl Sulphoxide,DMSO)20mL和柠檬酸.H2O 5.1g。
所述洗涤液为0.0lmol/L pH 7.4磷酸盐-NaCl缓冲液(PBST)，PBST内含0.05％吐温20(Tween-20)，即1升溶液中含8g NaCl、0.2g KH2P04、2.9g Na2HP04-12H20、0.2g KCl和0.5mL Tween-20。
所述终止液为2mol/L H2S04溶液。
所述试剂盒中的试剂均可加入防腐剂。
所述抗人MMP-7抗体包被的酶标板所用抗体为抗人MMP-7单克隆抗体。
基于血清标志物MMP-7的胆道闭锁诊断试剂盒的诊断方法，用于BA早期的诊断，所述诊断试剂盒采用的是现在临床广泛使用的ELISA技术，应用间接法定量检测人血清中MMP-7含量，具体是:向抗人MMP-7抗体包被的酶标板中加入待测血清，加入生物素化的MMP-7抗体，在将未结合的生物素化抗体洗净后，加入HRP标记的亲和素，形成酶抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色，TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，颜色的深浅和样品中的MMP-7的水平呈正相关。
与现有技术相比，本发明有以下优点:
1、提供一种新的灵敏、安全、可靠、易操作的商品化试剂盒，定量测定人血清中MMP-7的水平，有助于早期诊断BA；
2、提供的血清生物标志物蛋白质MMP-7诊断BA的敏感性为100％，特异性为95.6％，具有高特异性和高敏感性的特点。
3、提高BA的早期诊断率，减少误诊，提高BA自身肝脏生存率。
附图说明
图1为ELISA测定血清MMP-7的标准曲线；
图2A和图2B为血清MMP-7在BA组、非BA组和对照组中的表达情况；其中：图2A表示整体人群中BA组血清MMP-7浓度明显高于非BA组和CO组(**P<0.001)；图2B表示年龄小于60d患儿中，BA组血清MMP-7浓度明显高于非BA组及CO组(**P<0.001)
图3A、图3B和图3C为血清MMP-7与年龄相关性情况；
其中：图3A表示BA组血清MMP-7浓度与年龄呈正相关趋势(P<0.001)；图3B表示非BA组血清MMP-7浓度与年龄不相关(P＝0.11)；图3C表示对照组血清MMP-7浓度与年龄无相关趋势(P＝0.29)；
图4为血清MMP-7与GGT诊断BA的ROC曲线(受试者工作特征曲线receiver operating characteristic curve，简称ROC曲线)下面积比较，MMP-7与GGT的ROC曲线下面积分别为0.996和0.678；
图5为肝脏MMP-7基因表达情况：BA组MMP-7mRNA表达明显高于分BA组和对照组；
图6表示BA患儿肝脏中可见大量增生、排列紊乱的小胆管表达MMP-7强阳性(免疫组织化学染色，放大40倍)；
图7A、图7B、图7C、图7D、图7E、图7F为MMP-7在不同患儿肝脏中的表达情况比较(图中的方框部分为放大的区域)；
其中：图7A(放大100倍),图7B(放大400倍)表示BA患儿肝脏汇管区可见胆管上皮细胞强阳性染色；图7C(放大100倍),图7D(放大400倍)非BA(婴儿肝炎)患儿肝脏汇管区，仅可见部分胆管上皮细胞MMP-7染色；图7E(放大100倍),图7F(放大400倍)正常肝脏汇管区中未见MMP-7表达。
具体实施方式
以下结合附图对本发明做进一步详细的说明，但它们并不构成对本发明的限定，仅作举例，同时通过说明本发明的优点将变得更加清林和容易理解。
参阅附图可知：1、血清MMP-7浓度检测及比较：
按照试剂盒说明书，做标准曲线如图1。
图中横坐标为吸光度值(OD值)，纵坐标为MMP-7浓度，从图1可以看出OD值与MMP-7浓度呈正相关系。
整体人群及年龄小于60天患儿血清MMP-7水平分别如图2A和图2B所示，BA组均明显高于非BA组和对照组(P<0.001)。
BA组血清MMP-7浓度与患儿年龄呈正相关趋势，如图3A；非BA组和对照组血清MMP-7浓度与年龄无相关性，如图3B，3C。
血清MMP-7诊断BA的ROC曲线计算曲线下面积为0.996，如图4。当血清MMP-7浓度>55.18ng/mL时,其诊断BA的灵敏度与特异度分别为100％和95.6％。
2、MMP-7在不同患儿肝脏组织中基因和蛋白的表达鉴定及比较：
RT-PCR检测显示，BA组肝脏MMP-7基因mRNA表达为非BA组的8倍，明显高于非BA组(P<0.001)和对照组(P<0.001)。非BA组与对照组无明显差异(P＝0.15)，如图5。
3、BA组在低倍镜下可见肝小叶周围存在大量增生、排列紊乱的小胆管，这些增生的小胆管表达MMP-7强阳性表达，如图6。高倍镜下可见胆管、疸栓强阳性染色，如图7A,7B；在非BA组中，仅可见部分胆管上皮细胞MMP-7染色，如图7C,7D)；对照组中未见MMP-7表达，如图7E,7F。
4、血清样品的准备：
全血标本于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟左右，取上清即可。立即检测或进行分装，并将标本放于-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。解冻后的样品应再次离心，然后检测。所检测样品中不能含有NaN3，因为NaN3抑制辣根过氧化物酶(HRP)的活性。
5、抗体酶标板的制备方法为：
用pH为8.2的PBS缓冲液将抗人MMP-7单克隆抗体稀释至60μg/m1，按100μ1/孔的加入量加于96孔酶标板中，在温度为4℃的条件下放置过夜，然后用洗涤液洗涤，所述洗涤液为含有0.05％Tween-20，pH为7.4的磷酸盐缓冲液，甩干，得包被有抗MMP-7单克隆抗体的96孔酶标板。
6、ELISA法测定血清中MMP-7的浓度，以辅助早期诊断BA:
诊断试剂盒的具体操作步骤如下:
6.1标准品与样品的稀释与加样：将标准品与待测血清样品1:100用样品缓冲液稀释至100uL，加入到各自的抗原测定孔板中。注意不要有气泡，加样将样品加于梅标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动泪匀，酶标板上加盖或覆膜。若待测血清样品较多，建议使用多管微量加液器加样。标准品及待检测样品临用前15分钟内配制，用完丢弃，下次检测使用新鲜配制的标准品。
6.2温育：酶标板置于37℃反应60分钟，甩净孔中液体，不用洗涤。
6.3加酶：每孔加酶标试剂A 100uL，37℃，60分钟。甩净孔中液体，洗板3次，拍干。每孔加酶标试剂B 100uL，37℃，30分钟。甩净孔中液体，洗板5次，拍干。
6.4显色：各孔TMB底物溶液90uL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。
6.5终止：依序每孔加终止液50uL，终止反应。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。底物反应时间到后应尽快加入终止液。
6.6结果判定：
在加入终止液后15min内，用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。检测试剂盒的检测标准为：以标准品的浓度为纵坐标(或对数坐标)，OD值为横坐标(或对数坐标)，使用curve expert1.30软件绘出标准曲线(最佳方程式应依回归方程计算的R2值未定，以R2值越趋近于1为好)，计算样品的实际浓度。其中：阳性结果判断标准为：MMP-7>55.18ng/mL。
对108例BA患儿血清、87例非BA患儿血清、52例对照患儿血清的ROC分析确立了以上参考值。
7、特异性和敏感性检测：采用300份BA相关患者的血清(BA患儿100例、非BA黄疸患儿100例、无肝病或黄疸患儿100例)对本发明的诊断试剂盒进行了特异性和敏感性检测。本发明的诊断试剂盒辅助早期诊断BA的特异性为95.6％，敏感性为100％，均高于现有技术中BA诊断的指标。
本发明一种基于血清标志物MMP-7的胆道闭锁诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括抗人MMP-7单克隆抗体包被的酶标板、阴性对照液、阳性对照液、酶标试剂、酶底物溶液、封闭液、样品稀释液、洗涤液和终止液；
所述阴性对照液为不含MMP-7的稀释于样品稀释液中的健康人血清；
所述阳性对照液为含有MMP-7的稀释于样品稀释液中血清，含MMP-7浓度为100U/mL；
所述酶标试剂为含辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗0.1-111g/mL；
所述酶底物溶液为3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液，包括显色剂A和显色剂B，显色剂A为500mL溶液中含有醋酸纳13.6g、柠檬酸1.6g和30％双氧水0.3mL；显色剂B为500mL溶液中含有TMB 350mg、二甲亚砜20mL和柠檬酸.H2O 5.1g；
所述封闭液为0.5％牛血清白蛋白的0.01mol/L pH 7.4磷酸盐-NaCl缓冲液溶液，即1升溶液中含5g BSA、8g NaCl、0.2g KH2P04、2.9g Na2HP04.12H2O和0.2g KCl；
所述样品稀释液为0.01mol/L pH 7.4PBS；
所述洗涤液为0.0lmol/L pH 7.4磷酸盐-NaCl缓冲液PBST，PBST内含0.05％吐温20，即1升溶液中含8g NaCl、0.2g KH2P04、2.9g Na2HP04-12H20、0.2g KCl和0.5mL Tween-20；
所述终止液为2mol/L H2S04溶液。
所述试剂盒中的试剂均可加入防腐剂。
基于血清标志物MMP-7的胆道闭锁诊断试剂盒的诊断方法，用于BA早期的诊断，所述诊断试剂盒采用的是现在临床广泛使用的ELISA技术，应用间接法定量检测人血清中MMP-7含量，具体是:向抗人MMP-7抗体包被的酶标板中加入待测血清，加入生物素化的MMP-7抗体，在将未结合的生物素化抗体洗净后，加入HRP标记的亲和素，形成酶抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色，TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，颜色的深浅和样品中的MMP-7的水平呈正相关。
其它未详细说明的均为现有技术。